Un método basado en la filtración para preparar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado para inmunoprecipitación de cromatina

El objetivo general de este procedimiento experimental es permitir la preparación de núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado, los cuales pueden utilizarse posteriormente en estudios de inmunoprecipitación de cromatina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del músculo y circadiano, como estudios genómicos que empleen tejidos y células musculares en contextos circadianos u otros contextos dependientes del tiempo. La principal ventaja de esta técnica es que permite la reticulación inmediata de las muestras y el procedimiento basado en filtración puede realizarse de manera confiable para aislar núcleos de alta calidad con mínima contaminación de miofibrillas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el músculo esquelético, también puede aplicarse a otros sistemas como el músculo cardíaco y el músculo liso. Pese y pique el músculo esquelético de las extremidades posteriores aislado de ratones macho C57 black six de aproximadamente 20 semanas de edad en solución salina tamponada con fosfato fría con hielo, como se describió previamente. Coloque el tejido muscular esquelético picado en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de PBS sobre hielo.

Luego, centrifugue la muestra a 300 veces g a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Retire cuidadosamente el sobrenadante de PBS mediante aspiración. Estime el volumen del sedimento en cada tubo de 50 mililitros utilizando tubos de referencia con uno, dos, tres y cuatro mililitros de agua.

Añada siete volúmenes de formaldehído al 1% frío con hielo en PBS y homogenice las muestras en hielo utilizando un homogenizador de tejidos con sonda. A continuación, realice el entrecruzamiento de la muestra incubándola a temperatura ambiente durante 10 minutos. Detenga la reacción de entrecruzamiento mediante la adición de glicina 1 M hasta una concentración final de 0,125 M, seguida de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente.

Después de centrifugar la muestra a 3.000 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius, elimine el sobrenadante mediante aspiración. Lave el sedimento resuspendiéndolo en 10 mililitros de tampón base frío con inhibidores de proteasas recién agregados. Vuelva a centrifugar la muestra y retire cuidadosamente el sobrenadante por aspiración.

Luego, re suspenda el precipitado en seis mililitros de tampón de lisis que contenga inhibidores de proteasas recién agregados. Transfiera la muestra a un homogenizador Dounce de 15 mililitros previamente enfriado e incube durante 10 minutos en hielo. Homogenice cada muestra con el Dounce en hielo mediante 15 movimientos lentos usando un pistilo flojo, seguidos de 15 movimientos con un pistilo ajustado para liberar los núcleos.

Los siguientes pasos de filtración son clave para el aislamiento de núcleos de alta calidad. Filtre el homogenato a través de un tamiz celular y enjuague con cuatro mililitros de tampón de lisis. Luego, centrifugue las muestras a 1.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

ReSuspender el sedimento en cinco mililitros de tampón básico frío con hielo y homogeneizar 10 veces con un pistilo ajustado para liberar los núcleos. A continuación, filtrar la suspensión a través de un colador celular y enjuagar el tubo con dos mililitros de tampón básico y filtrar nuevamente. Repetir la filtración utilizando coladores celulares con tamaños de poro gradualmente menores.

Finalmente, centrifugue a 1.000 × g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y resuspenda el precipitado en 500 microlitros de tampón base antes de centrifugar nuevamente. Deseche el sobrenadante y almacene el precipitado a menos 80 grados Celsius.

Deshiele las muestras en 500 microlitros de tampón de lisis SDS y resuspenda con pipeteo suave. Transfiera la suspensión de ADN de núcleos a un vial de vidrio sobre hielo. Elegir la plataforma y las condiciones adecuadas de sonicación es fundamental para la preparación de cromatina a partir de núcleos aislados.

Realice la sonicación con ráfagas enfocadas de energía acústica ultrasónica procedente de un transductor con forma de disco, utilizando los parámetros descritos en el protocolo escrito. Transfiera el cromatina sonificado a un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, centrifugue a 12.000 × g durante 15 minutos y transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.

A continuación, transfiera 50 microlitros de la muestra sonicada a un nuevo tubo de 1,5 mililitros para realizar la descrosslinkación inversa durante la noche a 65 grados Celsius. La recuperación de las muestras de ADN se describe en la siguiente sección. Tras la evaluación de la sonicación y la cuantificación según se describe en el protocolo del texto, alícuota el cromatina descongelado en aproximadamente 100 a 120 microgramos por tubo.

Luego, diluya la cromatina de uno a diez con tampón de inmunoprecipitación. A continuación, agregue 40 microlitros de una suspensión al 50 % de agarosa HE o perlas de IgY bloqueadas con BSA y incube en un rotador durante tres horas a cuatro grados Celsius. Tras centrifugar la muestra a 1 000 ×g durante 10 minutos, transfiera cuidadosamente el sobrenadante a nuevos tubos.

Luego, agregue anticuerpos a una concentración de un microgramo de anticuerpo por cada 25 a 100 microgramos de ADN de cromatina. Incube con rotación suave durante la noche a cuatro grados Celsius y aproximadamente 15 rpm. A continuación, agregue 10 microlitros de agarosa HE de proteína o perlas de IgY bloqueadas previamente con BSA y mezcle.

Gire la suspensión de perlas en la cámara fría durante dos horas. A continuación, lave las perlas con tampón RIPA, seguido de tampón de alta sal, tampón de cloruro de litio y tampón de Tris EDTA, como se detalla en el protocolo del texto. Tras el lavado, eluya el ADN de las perlas primero centrifugando a 1.000 × g durante un minuto y retirando cuidadosamente el sobrenadante.

Re-suspender las perlas con 50 microlitros de tampón de elución. Luego, incubar durante 10 minutos a 65 grados Celsius. Tras la incubación, centrifugar a 12.000 ×g durante cinco minutos.

Retire el sobrenadante y agregue otros 50 microlitros de tampón de elución antes de centrifugar nuevamente a 12.000 ×g durante cinco minutos. El volumen final de elución será de 100 microlitros. Para revertir el entrecruzamiento y realizar la elución del ADN, primero incube el cromatina eluido durante la noche a 65 grados Celsius.

Luego, agregue un microlitro de RNasa A antes de incubar durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Posteriormente, incube con ocho microlitros de proteasa K al 10 miligramos por mililitro durante 30 minutos a 55 grados Celsius. Recupere el ADN utilizando un kit de purificación de PCR con un volumen de elución de 50 microlitros según el protocolo del fabricante.

Finalmente, analice los perfiles mediante QPCR en tiempo real como se describió previamente. La filtración secuencial eliminó eficazmente los restos de tejido. Aquí se muestran imágenes representativas de las muestras tras la filtración inicial y tras la filtración en serie para su comparación.

La degradación progresiva de la cromatina mediante 10 ciclos de sonicación se revela mediante la realización de un gel de agarosa. Diez ciclos de sonicación con la cromatina digerida produjeron ADN de aproximadamente 500 pares de bases. Aquí se muestran resultados representativos de PCR cuantitativa (QPCR) para machos B de un experimento de inmunoprecipitación de cromatina (chIP) con muestras de músculo esquelético de ratón recolectadas en ZT6 y ZT18.

El análisis de los elementos de localización de Dbp en el gen Dbp reveló que, en concordancia con resultados previos, las cimas de unión se encuentran alrededor de ZT6. Una vez dominado, la preparación de núcleos puede realizarse en cinco a seis horas si se lleva a cabo adecuadamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar métodos basados en filtración para purificar núcleos y ADN de cromatina de alta calidad a partir de tejido muscular entrecruzado.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener las muestras en hielo o en una habitación fría y guardar alícuotas de las muestras para su revisión microscópica antes y después de los pasos de filtración. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la genómica y el músculo exploraran la dinámica circadiana o sensible al tiempo de las interacciones cromatina-proteína en diversos tejidos musculares. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (chIP) con el fin de responder preguntas adicionales, como buscar patrones de unión de factores de transcripción en tejidos musculares.