Un método basado en la filtración para preparar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado para inmunoprecipitación de cromatina

El objetivo general de este procedimiento experimental es permitir la preparación de núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado que luego puedan usarse para estudios de inmunoprecipitación de cromatina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo muscular y circadiano, como los estudios genómicos que utilizan tejidos y células musculares en contexto circadiano u otro contexto sensible al tiempo. La principal ventaja de esta técnica es que permite la reticulación inmediata de las muestras y el procedimiento basado en la filtración se puede llevar a cabo de forma fiable para aislar núcleos de alta calidad con una contaminación mínima por miofibrillas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el músculo esquelético, también se puede aplicar a otros sistemas, como los músculos cardíacos y lisos. Pesar y picar el músculo esquelético de las extremidades traseras aislado de ratones machos C57 negros seis de aproximadamente 20 semanas de edad en solución salina tamponada con fosfato helado como se describió anteriormente. Coloque el tejido muscular esquelético picado en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de PBS en hielo.

A continuación, centrifugar la muestra a 300 veces g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Retire con cuidado el sobrenadante PBS por aspiración. Calcule el volumen de gránulos en cada tubo de 50 mililitros utilizando tubos de referencia con uno, dos, tres y cuatro mililitros de agua.

Añadir siete volúmenes de formaldehído al 1% y PBS y homogeneizar las muestras en hielo utilizando un homogeneizador de tejido de sonda. A continuación, reticule la muestra incubándola a temperatura ambiente durante 10 minutos. Apagar la reacción de reticulación mediante la adición de un molar de glicina hasta una concentración final de 0,125 molar, seguida de una incubación durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Después de centrifugar la muestra a 3.000 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, retire el sobrenadante por aspiración. Enjuague el pellet resuspendiéndolo en 10 mililitros de tampón base helada que contenga inhibidores de la proteasa recién añadidos. Vuelva a centrifugar la muestra y retire con cuidado el sobrenadante por aspiración.

A continuación, vuelva a suspender el pellet en seis mililitros de tampón de lisis que contenga inhibidores de la proteasa recién añadidos. Transfiera la muestra a un homogeneizador Dounce de 15 mililitros preenfriado e incube durante 10 minutos en hielo. Homogeneizar cada muestra en hielo con 15 trazos lentos usando un mortero suelto seguidos de 15 golpes con un mortero apretado para liberar los núcleos.

Los siguientes pasos de filtración son la clave para el aislamiento de núcleos de alta calidad. Filtrar el homogeneizado a través de un colador de células y enjuagar con cuatro mililitros de tampón de lisis. A continuación, centrifugar las muestras a 1.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tampón base helado y rebote 10 veces con un mortero apretado para liberar los núcleos. A continuación, filtre la suspensión a través de un colador de células y enjuague el tubo con dos mililitros de tampón base y vuelva a filtrar. Repita la filtración con filtros celulares de tamaño de poro gradualmente reducido.

Por último, centrifugar a 1.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón base antes de volver a centrifugar. Deseche el sobrenadante y almacene el pellet a menos 80 grados centígrados.

Descongele las muestras en 500 microlitros de tampón de lisis SDS y vuelva a suspender con un pipeteo suave. Transfiera la suspensión de ADN de los núcleos a un frasco de vidrio con hielo. La elección de la plataforma y el estado de sonicación adecuados es fundamental para la preparación de la cromatina a partir de núcleos aislados.

Ejecute la sonicación con ráfagas focalizadas de energía acústica ultrasónica desde un transductor en forma de disco utilizando los ajustes descritos en el protocolo de texto. Transfiera la cromatina sonicada a un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, centrifugar a 12.000 veces g durante 15 minutos y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.

A continuación, transfiera 50 microlitros de la muestra sonicada a un nuevo tubo de 1,5 mililitros para la reticulación inversa durante la noche a 65 grados centígrados. La recolección de las muestras de ADN se describe en la siguiente sección. Tras la evaluación de la sonicación y la cuantificación descritas en el protocolo de texto, se debe alícuota la cromatina descongelada a aproximadamente 100 a 120 microgramos por tubo.

A continuación, diluir la cromatina uno a 10 con tampón de inmunoprecipitación. A continuación, agregue 40 microlitros de una suspensión al 50% de proteína HE prebloqueada por BSA, agarosa o perlas de IgY e incube en un rotador durante tres horas a cuatro grados centígrados. Después de centrifugar la muestra a 1.000 veces g durante 10 minutos, transfiera cuidadosamente el sobrenadante a tubos nuevos.

A continuación, añada anticuerpos a un microgramo de anticuerpo por cada 25 a 100 microgramos de ADN de cromatina. Gire suavemente durante la noche a cuatro grados centígrados y aproximadamente 15 rpm. A continuación, añada 10 microlitros de proteína BSA prebloqueada HE, agarosa o perlas de IgY y mezcle.

Gire la suspensión de cuentas en la cámara frigorífica durante dos horas. A continuación, lave las perlas con tampón RIPA seguido de tampón con alto contenido de sal, tampón de cloruro de litio y Tris EDTA como se detalla en el protocolo de texto. Después del lavado, eluir el ADN de las perlas centrifugando primero a 1.000 veces g durante un minuto y eliminando cuidadosamente el sobrenadante.

Vuelva a suspender las perlas con 50 microlitros de tampón de elución. Luego incube durante 10 minutos a 65 grados centígrados. Después de la incubación, centrifugar a 12.000 veces g durante cinco minutos.

Retirar el sobrenadante y añadir otros 50 microlitros de tampón de elución antes de centrifugar de nuevo a 12.000 veces g durante cinco minutos. El volumen de elución final será de 100 microlitros. Para revertir la reticulación y realizar la elución del ADN, primero incube la cromatina eluida durante la noche a 65 grados Celsius.

A continuación, añadir un microlitro de RNasa A antes de incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Posteriormente, incubar con ocho microlitros de 10 miligramos por mililitro de proteasa K durante 30 minutos a 55 grados centígrados. Recolectar el ADN mediante el uso de un kit de limpieza de PCR con un volumen de elución de 50 microlitros de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Por último, analice los perfiles mediante QPCR en tiempo real como se ha descrito anteriormente. La filtración secuencial eliminó eficazmente los restos de tejido. Aquí se muestran imágenes representativas de las muestras después de la filtración inicial y después de la filtración en serie para comparar.

La trituración progresiva de la cromatina a través de 10 ciclos de sonicación se revela mediante el funcionamiento de un gel de agarosa. 10 ciclos de sonicación con la cromatina digerida dieron como resultado un ADN de aproximadamente 500 pares de bases. Aquí, se muestran los resultados representativos de QPCR para machos B con un chIP con muestras de músculo esquelético de ratón recolectadas en ZT6 y ZT18.

El análisis de los elementos de ubicación de Dbp en el gen Dbp reveló que, de acuerdo con los resultados anteriores, la unión alcanza su punto máximo alrededor de ZT6. Una vez dominado, la preparación de los núcleos se puede hacer en cinco o seis horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar los métodos basados en la filtración para purificar núcleos de alta calidad y ADN de cromatina a partir de tejido muscular reticulado.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las muestras en hielo o en una cámara frigorífica y guardar las alibcuotas de las muestras para la verificación microscópica antes y después de los pasos de filtración. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la musculatura y la genómica exploraran la dinámica circadiana o sensible al tiempo de la interacción cromatina-proteína en varios tejidos musculares. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación de chIP, para responder a preguntas adicionales, como buscar patrones de unión de factores de transcripción en los tejidos musculares.