Name: Un método basado en la filtración para preparar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado para inmunoprecipitación de cromatina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprende un método de filtración para aislar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado de ratón. Esta técnica elimina la ultracentrifugación y facilita estudios de inmunoprecipitación de cromatina en investigación muscular.

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Agradecemos a Karyn Esser, Nobuya Koike y Noheon Park por sus consejos útiles. Este trabajo fue apoyado en parte por NIH / NIGMS (R01GM114424) a S.-HY, y la Fundación Robert A. Welch (AU-1731) y NIH / NIA (R01AG045828) a ZC

El cuidado de los animales se llevó a cabo bajo las directrices del Comité de Uso y Cuidado de Animales Institucionales (IACUC), y los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo animal aprobado por el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en Houston. 1. Aislamiento de Nucleos a partir del Músculo Esquelético Reticulado <ol><li> Pesar y picar el músculo esquelético de la extremidad posterior, aislado de ratones machos C57BL / 6 de aproximadamente 20 semanas de edad, en solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada como se describe con detalle anteriormente 22 . NOTA: Usualmente obtenemos 1,0 - 1,5 g de músculo esquelético de un ratón. <ol><li> Coloque el tejido muscular esquelético picado en un tubo cónico de 50 ml que contenga 10 ml de PBS sobre hielo. </li></ol></li><li> Centrifugar a 300 xg a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Quitar cuidadosamente el sobrenadante de PBS por aspiración. </li><li> Estimar el volumen de pellets en cada tubo de 50 ml usando tubos de referencia con 1, 2, 3 y 4 ml de agua. </li><li> Añadir 7 volúmenes deDe formaldehído al 1% enfriado con hielo en PBS y homogeneizar las muestras sobre hielo usando un homogeneizador de tejido sonda (véase la Tabla de Materiales ). NOTA: Opcional: El procedimiento de homogeneización se puede realizar en una habitación fría. </li><li> Reticular la muestra incubando a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Enfriar la reacción de reticulación mediante la adición de glicina 1 M a una concentración final de 0,125 M e incubar durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar las muestras a 3.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por aspiración. </li><li> Enjuagar con 10 ml de tampón de base enfriado con hielo (HEPES-KOH 10 mM a pH 7,3, EDTA 10 mM, KCl 10 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM) que contiene inhibidores de proteasa recién añadidos (fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM (PMSF) , Y 10 μg / ml de leupeptina). Centrifugar a 3.000 g durante 5 min a 4 ° C y retirar cuidadosamente el sobrenadante por aspiración. </li><li> Resuspender el sedimento en 6 ml de tampón de lisis (HEPES-KOH 10 mM a pH 7,3, EDTA 10 mM, KCl 10 mM, MgCl _ {2} 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton X - 100 al 1%) que contenían inhibidores de proteasas recién añadidos (PMSF 0,2 mM y leupeptina 10 mu g / ml). </li><li> Transferir la muestra a un homogeneizador de 15 mL Dounce prechilado e incubar durante 10 min en hielo. Dividir homogeneizar cada muestra en hielo con 15 carreras lentas usando pilón suelto seguido de 15 carreras con pilón apretado para liberar los núcleos. </li><li> Se filtra el homogeneizado (6 ml) a través de un filtro de células (tamaño de poro: 100 μm) y se enjuaga con 4 ml de tampón de lisis. Centrifugar las muestras a 1.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Resuspender en 5 ml de tampón de base helado y dounce 10 veces con el mazo apretado para liberar los núcleos. <ol><li> Eliminar una alícuota de 20 μL para la medición de la concentración de ADN con un espectrofotómetro (OD260 / OD280) y observar microscópicamente con azul de tripano si es necesario (ver más adelante) ( Figura 1 A ). </li></ol></li><li> Filtrar la suspensión a través deUn filtro de células (tamaño de poro: 70 μm), enjuague el tubo y vuelva a filtrar con 2 ml de tampón de base como se indica más arriba. </li><li> Repetir la filtración como en el paso 1.13 con filtros de células de tamaño de poro gradualmente reducido (40 μm, 30 μm, 20 μm y 10 μm). NOTA: En total, se utilizaron filtros de 6 tamaños de poro en los pasos 1.12-1.14. </li><li> Centrifugar a 1.000 g a 4 ° C durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 500 μ l de tampón base. </li><li> Mida la concentración de ADN como se ha indicado anteriormente. NOTA: Se obtuvieron aproximadamente 200 μg de ADN nucleico combinando ambas extremidades traseras de un animal. Opcionalmente, ahorre 20 μl para la observación microscópica con tinción con azul de tripano (concentración de stock 0,4%, dilución 1: 5); Los núcleos se tiñen de azul ( Figura 1 B ). </li><li> Centrifugar a 1.000 g a 4 ° C durante 10 min, y desechar el sobrenadante. Almacenar el gránulo a -80 ° C. </li></ol> 2. Sonicación &lt;Ol <li> Descongelar las muestras en 500 μl de tampón de lisis SDS y resuspender con pipeteado suave. </li><li> Transferir la suspensión de ADN del núcleo a un vial de vidrio sobre hielo. </li><li> Ejecute la sonicación con ráfagas enfocadas de energía acústica ultrasónica de un transductor en forma de plato. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el equipo. Utilice el siguiente ajuste: ciclos por ráfaga: 200; Intensidad: 5; Ciclo de trabajo: 20; Temperatura 4 - 6 ° C; 30 s encendido / apagado. NOTA: Un ejemplo para evaluar la eficacia de la sonicación se muestra en la Figura 2 . </li><li> Transferir la cromatina sonicada a un tubo de 1,5 ml. Centrifugar a 12.000 xg durante 15 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Transferir 50 μl de muestras sonicadas (~ 7 - 10 μg / muestra de músculo) en un nuevo tubo de 1,5 ml para reticulación inversa durante la noche a 65 ° C. Congele las muestras restantes a -80 ° C. </li></ol> 3. Evaluación de Sonicación y Cuantificación <ol><li> Añadir 1.0Μ l de RNasa A (500 U / ml RNasa A: 20.000 U / mL RNasa T1) a las muestras de 50 μl de sonicación almacenadas y se incuba durante 30 minutos a 37ºC. </li><li> Añadir 8 μl de proteasa K (10 mg / ml) e incubar durante 30 minutos a 55 ° C. </li><li> Cosecha del ADN mediante el uso de un kit de extracción de ADN. <ol><li> Añadir 5 volúmenes de tampón de unión, aplicarlo a la columna de centrifugado y centrifugar a 4.000 xg, 10 min. </li><li> Aplicar el paso a través de la misma columna y centrifugar nuevamente. </li><li> Lavar con tampón de lavado dos veces a 13.000 xg, 1 min. </li><li> Centrifugar de nuevo a 13.000 xg, 1 min para secar la columna. </li><li> Añadir 50 μL de H2O y centrifugar a 13.000 xg, 1 min para eluir ADN. </li><li> Aplicar el paso a través de la misma columna y centrifugar nuevamente. </li></ol></li><li> Cuantificar la cantidad de ADN con un espectrofotómetro (OD260 / OD280). Ejecutar muestras sobre geles al 0,8% para evaluar el tamaño y la cantidad (1 μ g) de los productos sonicated ( Figura 2 ]. NOTA: El rendimiento promedio de la cromatina es aproximadamente ~ 20%. </li></ol> 4. ChIP <ol><li> Deshielo la cromatina guardada previamente a -80 ° C y alícuota de la cromatina a ~ 100 - 120 μ g por tubo. Diluir 1:10 con tampón de ensayo de radioimmunoprecipitación (RIPA) (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NaF 1 mM, Na3VO4 1 mM, PMSF 1 mM, cóctel inhibidor de la proteasa 1x (PIC), desoxicolato de Na al 0,1% P / v), Triton X - 100 al 1%). <ol><li> Si hay múltiples muestras en cada grupo, combine cantidades iguales de ADN de cromatina hasta la cantidad final de ~ 100 - 120 μg / muestra. Ahorre un 10% como entrada. </li></ol></li><li> Se añaden 40 μl (50% v / v de lechada en tampón RIPA) de agarosa BSA-pre-bloqueada (~ 2 h, 4 ° C) de agarosa de proteína A / G (anticuerpo no de pollo) o perlas de IgY Un rotador durante 3 ha 4 ° C. </li><li> Centrifugar a 1.000 xg, 10 min y transferir cuidadosamente el sobrenadante a nuevos tubos. </li><li> Añadir anticuerpos a 1 μ g de anticuerpos por ~25 - 100 mu g de ADN de cromatina. </li><li> Girar suavemente a 4 ° C durante la noche a aproximadamente 15 rpm. </li><li> Añada 10 μl de agarosa BSA-pre-bloqueada (~ 2 h, 4 ° C) de agarosa de proteína A / G (anticuerpo no de pollo) o de perlas de IgY (anticuerpo de pollo) y gírela en la habitación fría durante 2 h. </li><li> Lavar las perlas de la siguiente manera. Lavar con 1 ml de tampón RIPA durante 3 min dos veces, lavar con 1 ml de tampón salino alto (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 500 mM, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, Triton X-100 al 1%) durante 3 min dos veces , Lavar con 1 ml de tampón LiCl (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), LiCl 250 mM, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, Na-desoxicolato al 1%, NP40 al 0,5%) durante 3 min dos veces. <ol><li> Lavar con 1 ml de tampón Tris-EDTA (TE) (Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), EDTA 1 mM) durante 3 min una vez. Luego eluir ADN con tampón de elución (Tris-HCl 20 mM, EDTA 5 mM y SDS al 0,5%). </li></ol></li><li> Centrifugar a 1.000 g, 1 min y retirar cuidadosamente el sobrenadante. </li><li> Resuspender el cordón con 50 μl de tampón de elución. </li><li> Incubar durante 10Min a 65 ° C. </li><li> Centrifugar a 12.000 g durante 5 min. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, añadir otros 50 μL y centrifugar nuevamente a 12.000 g durante 5 min. El volumen de elución final será de 100 μl. </li><li> Reticulación inversa y elución de ADN. <ol><li> Incubar la cromatina eluida durante la noche a 65 ° C. </li><li> Añadir 1,0 μl de RNasa A e incubar durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Añadir 8 μl de proteasa K (10 mg / ml) e incubar durante 30 minutos a 55 ° C. </li><li> Coseche el ADN utilizando un kit de limpieza de PCR con volumen de elución a 50 μl de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li></ol></li><li> Analizar los perfiles por tiempo real qPCR como se describe anteriormente [ 25 , 26] . NOTA: Las secuencias de cebadores se listan en la Figura 3 Leyenda . Los datos se presentan como media ± SEM ( Figura 3 ). </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos un método robusto en el que se utilizaron tejidos de músculo esquelético entrecruzados para aislar núcleos de alta calidad. La filtración secuencial se llevó a cabo para separar eficazmente los núcleos de los residuos, y la energía acústica ultrasónica del transductor en forma de plato cizalló la cromatina para el análisis de ChIP. Los resultados mostraron que el tiempo circadiano específico de unión de BMAL1 a los promotores objetivo. ChIP se puede emplear para capturar la ...

El músculo esquelético juega un papel importante en la fisiología y el comportamiento. La fibra muscular multi-nucleada consiste en miofibrillas donde la actina y la miosina forman unidades funcionales llamadas sarcómeros para generar fuerza contráctil. El músculo esquelético es también el órgano metabólico más grande del cuerpo, que representa&gt; 80% de la ingesta postprandial de glucosa y la regulación de la respuesta insulínica y la homeostasis metabólica 1 , 2 . La fisiología y el metabolismo muscular están estrechamente regulados por el reloj circadiano, un temporizador biológico intrínseco 3 , 4 , 5 , 6 . Por ejemplo, la deleción específica del músculo esquelético de Bmal1 , uno de los componentes del reloj circadiano núcleo, resultó en la resistencia a la insulina y disminución de la captación de glucosa en el músculo esquelético, y los animales se descubrió desarrollar diabetes tipo 2 [ 7] . yoAdemás, el músculo esquelético también se aprecia cada vez más como un órgano endocrino 8 , secretando mioquinas para regular el metabolismo sistémico y la fisiología. Se requieren estudios mecánicos para entender completamente estas funciones reguladoras en el músculo esquelético. ChIP es un poderoso enfoque para delinear el reclutamiento del promotor de las proteínas de unión al ADN. ChIP se desarrolló inicialmente para identificar la organización de los nucleosomas en cromatina ADN [ 9 , 10] . Desde entonces, se ha informado de una variedad de métodos para reticular proteínas y ADN de cromatina usando formaldehído, sulfato de dimetilo o irradiación ultravioleta (UV) 11 , 12 . El entrecruzamiento del formaldehído es el más comúnmente utilizado, conservando la estructura de la cromatina y las interacciones ADN-proteína 9 , 13 , 14 . Cromatografía reticuladaEn es desmenuzado por sonicación e inmunoprecipitado con anticuerpo contra la proteína de unión al ADN particular de interés 15 , 16 . En los últimos años se ha desarrollado la secuenciación de ChIP (ChIP-seq), un método que combina ChIP con NGS, para interrogar la unión del factor de transcripción del genoma 17 y, en algunos casos, para monitorear los cambios dinámicos a lo largo del tiempo 18 , 19 , 20 . Por ejemplo, los estudios circadianos de ChIP-seq han revelado una secuencia altamente orquestada de unión genómica de componentes de reloj circadiano y marcadores de histonas, que impulsa la expresión de genes temporalmente precisa durante todo el ciclo circadiano de ~ 24 h [ 18] . La mayoría de los protocolos disponibles de ChIP están diseñados para tejidos blandos ( por ejemplo , hígado, cerebro, etc. ), y muy pocos han sido publicados para tejidos duros incluyendo el esqueletoTal músculo. Es técnicamente difícil homogeneizar músculo esquelético rico en fibra y aislar núcleos de alta calidad [ 21] , especialmente para los experimentos de ChIP que requieren reticulación. En un reciente estudio de ChIP muscular 22 , las células satélite se separaron de las miofibras, y los núcleos se prepararon a partir de ambos tipos de células a través de un procedimiento prolongado que implica la digestión de los tejidos. El proceso completo tardó aproximadamente tres horas en completarse antes de que se realizara reticulación de formaldehído en núcleos aislados. Si bien este procedimiento evitó el entrecruzamiento de la fibra muscular, lo que hace que el tejido muscular sea aún más refractario a la homogeneización eficiente, y fue capaz de producir núcleos de alta calidad, el importante tiempo transcurrido desde la recolección de tejidos hasta la reticulación de núcleos incurre en el riesgo de alteración del ADN -proteína. Por el contrario, la mayoría de los estudios realizaron reticulación inmediatamente después del tratamiento experimental o recolección de tejidos con el fin de preservar el ADN en tiempo realN de unión 12 . Un segundo inconveniente del aislamiento de núcleos antes de la reticulación es que impide aplicaciones sensibles al tiempo tales como la recolección circadiana de muestras que típicamente ocurre a intervalos de 3 - 4 h. Sin la reticulación de los núcleos, el aislamiento debe proceder inmediatamente después de la disección, mientras que las muestras reticuladas pueden ser procesados ​​juntos después de todo el curso del tiempo se ha completado, lo que garantiza una mayor consistencia experimental. También se han descrito otros protocolos para el aislamiento de núcleos a partir de músculo esquelético no reticulado. Dos estudios describieron el uso de la ultracentrifugación gradiente para separar los núcleos de las restantes miofibrillas y restos celulares 23 , 24 . Mientras que la sacarosa o la ultracentrifugación con gradiente coloidal es eficaz con tejidos musculares no reticulados, nuestros experimentos revelaron que después de la reticulación, la ultracentrifugación en gradiente falló al separar los núcleos de la célula dEbris en el gradiente. Por lo tanto, desarrolló un procedimiento para aislar núcleos de alta calidad utilizando tejidos de músculo esquelético de ratón reticulado. En lugar de la ultracentrifugación gradiente, hemos ideado un método de filtración en serie para separar eficazmente los núcleos de los desechos. Después de la ultrasonicación, las muestras de cromatina se aplicaron con éxito para los estudios ChIP que mostró un patrón circadiano de la proteína BMAL1 vinculante a los promotores objetivo. Nuestro método puede ser ampliamente aplicable a varios estudios mecanicistas de los tejidos musculares.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano (0,4%)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> 15250061 <td></td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115887001</td><td></td></tr><tr><td>Chicken Anticuerpo</td><td></td><td></td> <td>anti-BMAL1Se generó en pollo (Cocalico Biologicals) contra el antígeno aa 318 - 579, y la IgY se purificó por afinidad utilizando el mismo antígeno.</td></tr><tr><td>Resina precipitante</td> de pollo <td>IgY GenScript</td><td>L00405</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KINEMATICA&nbsp; Polytron PT2100 Homogeneizador de sobremesa</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-451-178</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Molinillo de tejidos Dounce</td><td>Whearton</td><td>357544</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers 100 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>Coladores de células de halcón 70 y micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Coladores de células de halcón 40 y micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 30 &micro; m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 20 &micro; m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 10 &micro; m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50010-03</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S2 Ultrasonido focalizado</td><td>Covaris</td><td>Modelo S2</td><td></td></tr><tr><td>Labquake&nbsp;</td><td>Cámara</td><td></td> de microscopio Thermo Scientific C415110 <td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>&nbsp; Leica Microsystems</td><td>DFC3000 G</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Kit</td>DNA extraction kit Thermo <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>Buffers</td>Todos los componentes del tampón <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>se describen en el protocolo. Cada componente fue comprado a Sigma Aldrich</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un método basado en la filtración para preparar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado para inmunoprecipitación de cromatina

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

La inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) es un poderoso método para determinar la unión de proteínas al ADN de la cromatina. Sin embargo, el músculo esquelético rico en fibra ha sido un desafío para ChIP debido a la dificultad técnica en el aislamiento de núcleos de alta calidad con mínima contaminación de miofibrillas. Los protocolos anteriores han intentado purificar los núcleos antes de la reticulación, lo que entraña el riesgo de alteración de la interacción ADN-proteína durante el proceso de preparación prolongada de los núcleos. En el protocolo actual, primero se reticuló el tejido muscular esquelético recogido de ratones, y los tejidos fueron picados y sonicated. Dado que se encontró que la ultracentrifugación no era capaz de separar los núcleos de las miofibrillas utilizando tejido muscular reticulado, se ideó un procedimiento de filtración secuencial para obtener núcleos de alta calidad carentes de contaminación significativa de miofibrillas. Posteriormente se preparó la cromatina mediante el uso de un ultrasonista, y los ensayos de ChIP con anticuerpo anti-BMAL1 reveló fuerte vinculación circadianaPatrón de BMAL1 a los promotores de genes de destino. Este protocolo de filtración constituye un método fácilmente aplicable para aislar núcleos de alta calidad a partir de tejidos de músculo esquelético entrecruzados, permitiendo un procesamiento consistente de muestras para estudios circadianos y otros estudios sensibles al tiempo. En combinación con la secuenciación de próxima generación (NGS), nuestro método puede desplegarse para varios estudios mecánicos y genómicos centrados en la función del músculo esquelético.

Aquí se realizó formaldehído reticulación inmediatamente después de la recolección de tejidos para preservar en tiempo real la interacción ADN-proteína. Sin embargo, se encontró que la sacarosa o gradiente coloidal, comúnmente utilizado para el aislamiento de núcleos 23 , 24 , no fue eficaz en la separación de núcleos de miofibrillas (datos no presentados). La razón puede ser que el entrecruzamiento confería gravedad similar para...

Presentamos un protocolo basado en la filtración para aislar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético de ratón reticulado en el que eliminamos la necesidad de ultracentrifugación, haciéndolo fácilmente aplicable. Mostramos que la cromatina preparada a partir de los núcleos es adecuada para la inmunoprecipitación de la cromatina y probables estudios de secuenciación con inmunoprecipitación de la cromatina.

Un método basado en la filtración para preparar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado para inmunoprecipitación de cromatina

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

El objetivo general de este procedimiento experimental es permitir la preparación de núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado, los cuales pueden utilizarse posteriormente en estudios de inmunoprecipitación de cromatina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del músculo y circadiano, como estudios genómicos que empleen tejidos y células musculares en contextos circadianos u otros contextos dependientes del tiempo. La principal ventaja de esta técnica es que permite la reticulación inmediata de las muestras y el procedimiento basado en filtración puede realizarse de manera confiable para aislar núcleos de alta calidad con mínima contaminación de miofibrillas.Aunque este método puede proporcionar información sobre el músculo esquelético, también puede aplicarse a otros sistemas como el músculo cardíaco y el músculo liso. Pese y pique el músculo esquelético de las extremidades posteriores aislado de ratones macho C57 black six de aproximadamente 20 semanas de edad en solución salina tamponada con fosfato fría con hielo, como se describió previamente. Coloque el tejido muscular esquelético picado en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de PBS sobre hielo.Luego, centrifugue la muestra a 300 veces g a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Retire cuidadosamente el sobrenadante de PBS mediante aspiración. Estime el volumen del sedimento en cada tubo de 50 mililitros utilizando tubos de referencia con uno, dos, tres y cuatro mililitros de agua.Añada siete volúmenes de formaldehído al 1% frío con hielo en PBS y homogenice las muestras en hielo utilizando un homogenizador de tejidos con sonda. A continuación, realice el entrecruzamiento de la muestra incubándola a temperatura ambiente durante 10 minutos. Detenga la reacción de entrecruzamiento mediante la adición de glicina 1 M hasta una concentración final de 0,125 M, seguida de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente.Después de centrifugar la muestra a 3.000 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius, elimine el sobrenadante mediante aspiración. Lave el sedimento resuspendiéndolo en 10 mililitros de tampón base frío con inhibidores de proteasas recién agregados. Vuelva a centrifugar la muestra y retire cuidadosamente el sobrenadante por aspiración.Luego, re suspenda el precipitado en seis mililitros de tampón de lisis que contenga inhibidores de proteasas recién agregados. Transfiera la muestra a un homogenizador Dounce de 15 mililitros previamente enfriado e incube durante 10 minutos en hielo. Homogenice cada muestra con el Dounce en hielo mediante 15 movimientos lentos usando un pistilo flojo, seguidos de 15 movimientos con un pistilo ajustado para liberar los núcleos.Los siguientes pasos de filtración son clave para el aislamiento de núcleos de alta calidad. Filtre el homogenato a través de un tamiz celular y enjuague con cuatro mililitros de tampón de lisis. Luego, centrifugue las muestras a 1.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.ReSuspender el sedimento en cinco mililitros de tampón básico frío con hielo y homogeneizar 10 veces con un pistilo ajustado para liberar los núcleos. A continuación, filtrar la suspensión a través de un colador celular y enjuagar el tubo con dos mililitros de tampón básico y filtrar nuevamente. Repetir la filtración utilizando coladores celulares con tamaños de poro gradualmente menores.Finalmente, centrifugue a 1.000 × g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y resuspenda el precipitado en 500 microlitros de tampón base antes de centrifugar nuevamente. Deseche el sobrenadante y almacene el precipitado a menos 80 grados Celsius.Deshiele las muestras en 500 microlitros de tampón de lisis SDS y resuspenda con pipeteo suave. Transfiera la suspensión de ADN de núcleos a un vial de vidrio sobre hielo. Elegir la plataforma y las condiciones adecuadas de sonicación es fundamental para la preparación de cromatina a partir de núcleos aislados.Realice la sonicación con ráfagas enfocadas de energía acústica ultrasónica procedente de un transductor con forma de disco, utilizando los parámetros descritos en el protocolo escrito. Transfiera el cromatina sonificado a un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, centrifugue a 12.000 × g durante 15 minutos y transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.A continuación, transfiera 50 microlitros de la muestra sonicada a un nuevo tubo de 1,5 mililitros para realizar la descrosslinkación inversa durante la noche a 65 grados Celsius. La recuperación de las muestras de ADN se describe en la siguiente sección. Tras la evaluación de la sonicación y la cuantificación según se describe en el protocolo del texto, alícuota el cromatina descongelado en aproximadamente 100 a 120 microgramos por tubo.Luego, diluya la cromatina de uno a diez con tampón de inmunoprecipitación. A continuación, agregue 40 microlitros de una suspensión al 50 % de agarosa HE o perlas de IgY bloqueadas con BSA y incube en un rotador durante tres horas a cuatro grados Celsius. Tras centrifugar la muestra a 1 000 ×g durante 10 minutos, transfiera cuidadosamente el sobrenadante a nuevos tubos.Luego, agregue anticuerpos a una concentración de un microgramo de anticuerpo por cada 25 a 100 microgramos de ADN de cromatina. Incube con rotación suave durante la noche a cuatro grados Celsius y aproximadamente 15 rpm. A continuación, agregue 10 microlitros de agarosa HE de proteína o perlas de IgY bloqueadas previamente con BSA y mezcle.Gire la suspensión de perlas en la cámara fría durante dos horas. A continuación, lave las perlas con tampón RIPA, seguido de tampón de alta sal, tampón de cloruro de litio y tampón de Tris EDTA, como se detalla en el protocolo del texto. Tras el lavado, eluya el ADN de las perlas primero centrifugando a 1.000 × g durante un minuto y retirando cuidadosamente el sobrenadante.Re-suspender las perlas con 50 microlitros de tampón de elución. Luego, incubar durante 10 minutos a 65 grados Celsius. Tras la incubación, centrifugar a 12.000 ×g durante cinco minutos.Retire el sobrenadante y agregue otros 50 microlitros de tampón de elución antes de centrifugar nuevamente a 12.000 ×g durante cinco minutos. El volumen final de elución será de 100 microlitros. Para revertir el entrecruzamiento y realizar la elución del ADN, primero incube el cromatina eluido durante la noche a 65 grados Celsius.Luego, agregue un microlitro de RNasa A antes de incubar durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Posteriormente, incube con ocho microlitros de proteasa K al 10 miligramos por mililitro durante 30 minutos a 55 grados Celsius. Recupere el ADN utilizando un kit de purificación de PCR con un volumen de elución de 50 microlitros según el protocolo del fabricante.Finalmente, analice los perfiles mediante QPCR en tiempo real como se describió previamente. La filtración secuencial eliminó eficazmente los restos de tejido. Aquí se muestran imágenes representativas de las muestras tras la filtración inicial y tras la filtración en serie para su comparación.La degradación progresiva de la cromatina mediante 10 ciclos de sonicación se revela mediante la realización de un gel de agarosa. Diez ciclos de sonicación con la cromatina digerida produjeron ADN de aproximadamente 500 pares de bases. Aquí se muestran resultados representativos de PCR cuantitativa (QPCR) para machos B de un experimento de inmunoprecipitación de cromatina (chIP) con muestras de músculo esquelético de ratón recolectadas en ZT6 y ZT18.El análisis de los elementos de localización de Dbp en el gen Dbp reveló que, en concordancia con resultados previos, las cimas de unión se encuentran alrededor de ZT6. Una vez dominado, la preparación de núcleos puede realizarse en cinco a seis horas si se lleva a cabo adecuadamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar métodos basados en filtración para purificar núcleos y ADN de cromatina de alta calidad a partir de tejido muscular entrecruzado.Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener las muestras en hielo o en una habitación fría y guardar alícuotas de las muestras para su revisión microscópica antes y después de los pasos de filtración. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la genómica y el músculo exploraran la dinámica circadiana o sensible al tiempo de las interacciones cromatina-proteína en diversos tejidos musculares. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (chIP) con el fin de responder preguntas adicionales, como buscar patrones de unión de factores de transcripción en tejidos musculares.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

La diferenciación de ESC coincide con los cambios de tipo de células específicas en la estructura y composición de la cromatina. La detección de los cambios proporciona información valiosa sobre los mecanismos que definen stemcellness y la diferenciación celular. Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) representa un método valioso para diseccionar los mecanismos moleculares que subyacen a la diferenciación de células madre.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

Los avances en la espectrometría de masas han permitido el análisis de alto rendimiento de la expresión de proteínas y la modificación en un huésped de tejidos. En combinación con el fraccionamiento subcelular y modelos de enfermedad, espectrometría de masa cuantitativa y bioinformática puede revelar nuevas propiedades en los sistemas biológicos. El método descrito en la presente memoria analiza asociadas a la cromatina proteínas en el contexto de las enfermedades del corazón y es fácilmente...

Análisis cuantitativo de proteomas cromatina en la enfermedad

Se describe un método robusto para la inmunoprecipitación de la cromatina utilizando células T primarias. El método se basa en los enfoques estándar, pero utiliza un conjunto específico de condiciones y reactivos que mejoran la eficiencia de unas cantidades limitadas de células. Es importante destacar que, se presenta una descripción detallada de la fase de análisis de datos.

Immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa

La combinación de inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de ultra-alto rendimiento (chip-ss) puede identificar y mapear las interacciones proteína-ADN en un tejido o línea celular dada. Contorno es cómo generar una plantilla de chip de alta calidad para la posterior secuenciación, utilizando la experiencia con el factor de transcripción TCF7L2 como un ejemplo.

Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

Al combinar nativa y reticular inmunoprecipitación de cromatina con una elevada resolución Espectrometría de Masas, enfoque ChroP permite diseccionar la arquitectura proteómico compuesta de modificaciones de las histonas, variantes y proteínas no histonic sinergizantes en cromatina dominios funcionalmente distintos.

El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina

Este protocolo describe un procedimiento para la generación y purificación de tipo salvaje y versiones mutantes del complejo de remodelación de la cromatina INO80 humano. Etiquetadas con epítopo versiones de subunidades INO80 se expresaron de manera estable en células HEK293, y los complejos completos y complejos que carecen de conjuntos específicos de subunidades se purifican mediante cromatografía de inmunoafinidad.

Generación y purificación de Humanos INO80 remodelación de la cromatina complejos y Subcomplejos

Se presenta un nuevo protocolo para la preparación de la cromatina de músculo esquelético de ratón adulto adaptado al estudio de la regulación de los genes en las fibras musculares por inmunoprecipitación de cromatina.

Protocolo de mejora para la inmunoprecipitación de cromatina de músculo esquelético de ratón

La inmunoprecipitación por cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para comprender los mecanismos moleculares de la regulación genética. Sin embargo, el método implica dificultades para obtener fragmentación de cromatina reproducible mediante cizallamiento mecánico. Aquí, proporcionamos un protocolo mejorado para un ensayo ChIP usando digestión enzimática.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

Este protocolo se centra en la preparación de cromatina a partir de tejidos congelados a presión y es adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina reticulada (X-ChIP) seguida de un análisis cuantitativo de PCR (X-ChIP-qPCR) o enfoques de secuenciación de próxima generación (X-ChIP-seq).

Extracción de cromatina del tejido hepático quimérico congelado para el análisis de inmunoprecipitación de la cromatina

El éxito de la transcriptómica y multiómica de una sola célula/núcleo único depende en gran medida de la calidad de las células/núcleos. Por lo tanto, el aislamiento de células/núcleos de los tejidos y su purificación debe estar altamente estandarizado. Este protocolo describe la preparación de núcleos del cerebro y la médula ósea para el ensayo multioma de un solo núcleo aguas abajo.

Preparación de núcleos cerebrales y de médula ósea de alta calidad para ensayos multioma de núcleos individuales

La biología del tejido adiposo intermuscular (IMAT) está en gran parte inexplorada debido a la limitada accesibilidad del tejido humano. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de núcleos y la preparación de bibliotecas de IMAT humano congelado para la secuenciación de ARN de núcleos individuales para identificar la composición celular de este depósito adiposo único.

Aislamiento de núcleos de tejido adiposo intermuscular humano y secuenciación de ARN de núcleos individuales posteriores

Aprende un método de filtración para aislar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado de ratón. Esta técnica elimina la ultracentrifugación y facilita estudios de inmunoprecipitación de cromatina en investigación muscular.

Un método basado en la filtración para preparar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado para inmunoprecipitación de cromatina (Video) | JoVE Journal

Un método basado en la filtración para preparar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado para inmunoprecipitación de cromatina

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