Name: Electroconvulsiva convulsiones en ratas y fraccionamiento de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en densidad Postsynaptic proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprende a inducir convulsiones electroconvulsivas en ratas y fraccionar hipocampos para examinar cambios en proteínas postsinápticas. Este método permite estudiar neuroplasticidad sin muerte neuronal.

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Los autores agradecen a Dr. Eric C. Bolton por permitirnos usar su centrífuga para el fraccionamiento y el Dr. Graham H. Diering en laboratorio del Dr. Richard L. Huganir Universidad de John Hopkins por facilitarnos el protocolo en pequeña escala para el fraccionamiento de la PSD.

Todos los procedimientos experimentales incluyendo temas animal han sido aprobados por el cuidado de animales institucional y Comité de uso de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign.
1. mantener una colonia de la rata
<ol><li>Raza de ratas Sprague-Dawley (véase la Tabla de materiales) y mantenerlas en condiciones estándar con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y acceso ad libitum al alimento y al agua.</li>
	<li>Destetar las crías de rata en el día postnatal (P) 28 y alojarlos en grupos de 2-4 hermanos de camada machos o hembras.</li>
	<li>Marque las colas de ratas macho con un marcador negro permanente no tóxico para la identificación.</li>
	<li>Peso de las ratas macho 3 veces por semana y registrar sus pesos corporales.</li>
</ol>2. preparación de una máquina ECS
<ol><li>En 7:30, desinfectar el Banco en la sala de preparación de animales y poner una máquina ECS (generador de pulso) en el Banco.</li>
	<li>Lugar una rata macho individual pesa 200-250 g en una jaula limpia, vacía con una tapa. Repita para todas las ratas macho tratados con inducción de ECS. Que las ratas habituarse durante 30 minutos.</li>
	<li>Mientras que las ratas son habituar en sus jaulas, establece un generador de pulsos para la inducción de ECS en la frecuencia de 100 pulsos/s, una anchura de pulso de 0,5 ms, una duración de choque de 0,5 s y una corriente de 55 mA (figura 1A).</li>
	<li>Preparar el generador de impulsos empujando el botón de "RESET" y asegurando que el botón "Listo" se ilumina. Asegúrese que los clips de la oreja no están conectados a un generador de pulsos y luego presionen el botón de "Choque" durante unos segundos. Nota: en este punto, el generador de pulso está listo para la inducción de la ECS.</li>
	<li>Conecte los clips de la oreja en el generador de impulsos.</li>
</ol>3. inducción de ECS aguda
Nota: Vea figura 1B, panel superior.
<ol><li>Moje los clips del oído con solución salina estéril y asegurar que están saturadas.</li>
	<li>Mojar orejas de rata con solución salina estéril envolviéndolas en una gasa empapada en solución salina. Una vez mojados, retirar la gasa.</li>
	<li>Coloque un clip por oído, posición más allá de la banda principal del cartílago.</li>
	<li>Confirmar en la máquina ECS que se establece un lazo verdadero; Si no, un mensaje de error o una lectura de "1" aparecerá en la máquina.</li>
	<li>Use un guante grueso, no metal. Sosteniendo la rata suavemente en una mano enguantada, presione el botón de "Choque" durante unos segundos y suelte lentamente el apretón en la rata para observar la incautación. Para la farsa de "no crisis" (NS) de control, manejar la rata idénticamente pero no entregan la corriente.</li>
	<li>Desconecte las abrazaderas del oído como clonus comienza y registrar el comportamiento de incautación según escala22 que incluye "movimientos de boca y facial" (etapa 1), "cabeceo" (etapa 2), "clonus del miembro anterior de un Racine revisado" (etapa 3), "crianza con clonus de miembro anterior" (etapa 4), "crianza y caer con clonus de miembro anterior" (etapa 5). La toma debe durar aproximadamente 10 s; registrar la duración de la crisis mediante un temporizador.</li>
	<li>Tras la terminación de la crisis, volver la rata a su jaula casera. Seguimiento de la rata para otros 5 minutos para asegurarse de la recuperación de la rata de las convulsiones. Mantenerlo ubicado solo en la jaula y volver a la jaula a la sala de recuperación.</li>
	<li>Repetir la inducción de ECS en la rata próxima.</li>
	<li>Controlar las ratas en el resto del día y al menos una vez en la mañana y una vez en la tarde del día siguiente hasta que son sacrificados para los experimentos. Nota: El método de inducción de ECS puede llevar a signos clínicos como un efecto secundario accidental, que requiere atención. Por ejemplo, el protocolo de inducción de ECS podría inducir convulsiones que duran más de 15 s y causa sufrimiento innecesario a las ratas. En este caso, terminar la convulsiones utilizar diazepam (10 mg/kg, i.p.) o pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.). Si las ratas desarrollan dificultad respiratoria o anormalidades del comportamiento severas tras el cese de la convulsión, les eutanasia por inhalación de dióxido de carbono, seguida por decapitación.</li>
</ol>4. inducción de ECS crónica
Nota: Ver figura 1B, panel inferior.
<ol><li>Inducir una ECS por día a la misma hora en la mañana como se describe en los pasos 1-3, anteriormente, durante siete días consecutivos.</li>
	<li>Monitor de las ratas dos veces al día después de que regresaron a su casa de jaulas.</li>
</ol>5. homogeneización y fraccionamiento de hipocampo de rata
Nota: Véase la figura 2.
<ol><li>Preparar un buffer de homogeneización fresco (solución A) que contiene sacarosa 320 mM, pirofosfato de sodio 5 mM, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4, 200 ácido okadaico de nM y los inhibidores de la proteasa. Filtro-esterilizar el búfer utilizando filtros con un tamaño de poro de 0,22 μm para la filtración de vacío y coloque en hielo.</li>
	<li>En un momento dado el punto después de ECS aguda o crónica ECS (figura 1), eutanasia la rata por la inhalación de CO2 por 5-10 min, seguida de decapitación con una guillotina.</li>
	<li>Quitar el cerebro y diseccionar los hipocampos en la placa metálica colocada en hielo, como se describió anteriormente23,24.</li>
	<li>Coloque dos hipocampo de una rata en un cultivo de tejido de 30-mm plato y picar en trozos pequeños con unas tijeras.</li>
	<li>Transferencia de los hipocampos picaditos a un homogeneizador de vidrio manual con una pipeta de 1 mL y añadir 1 mL de buffer de homogenización helada (solución A, paso 5.1). Inserte un mortero redondo en un homogeneizador de vidrio. Mientras el homogenizador de vidrio en el hielo, suavemente y constantemente al movimiento hacia arriba y hacia abajo en la mano del mortero 10 - 15 veces durante 1 minuto, hasta desaparecerán pequeñas porciones de tejido del hipocampo.</li>
	<li>Transferir el homogenizado a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL con una pipeta de 1 mL y centrifugar el homogeneizado a 800 x g por 10 min a 4 ° C para separar el sobrenadante postnuclear (fracción S1) pellets que contiene tejido insoluble y núcleos (fracción de P1). Transferir 50 μl y 950 μl de la fracción S1 a dos tubos de microcentrífuga de separado, nuevo 1,7 mL con una pipeta de 1 mL y almacenar estos tubos en hielo. Guardar el sedimento de la fracción de P1 en el hielo.</li>
	<li>Centrifugar la fracción S1 (950 μL) durante 10 minutos a 13.800 x g y 4 ° C para separar el sobrenadante (fracción S2), enriquecido con proteínas citosólicas solubles, y el pellet (fracción de P2), enriquecido con proteínas de membrana, incluyendo proteínas synaptosomal. Transferir la fracción S2 a una microcentrífuga nuevo de 1,7 mL con una pipeta de 1 mL y almacenar en hielo.</li>
	<li>Resuspender el precipitado (fracción de P2) en 498 μl de agua purificada fría utilizando una pipeta de 1 mL. Añadir 2 μl de 1 M HEPES (pH 7,4) con una pipeta de 20 μl para alcanzar una concentración final de 4 mM HEPES (pH 7.4). Incubar a 4 ° C con agitación por 30 minutos tienda la fracción P2 resuspendida en el hielo.</li>
	<li>Determinar la concentración de proteína de las fracciones S1, S2 y P2 utilizando un ensayo BCA. Añadir 50 mM HEPES (pH 7,4) a cada fracción para alcanzar una concentración de 1 mg/mL y guardar a-80 ° C hasta su uso, o proceso de la fracción de P2 para aislar el PSD.</li>
</ol>6. aislamiento de la PSD de la fracción de membrana cruda proteína (P2)
<ol><li>Centrifugar la fracción P2 (500 μl) por 20 min a 25.000 x g y 4 ° C para separar el sobrenadante sometidas a lisis (LS2 fracción) y el pellet sometidas a lisis (fracción de LP1). Transferencia de la fracción de LS2 a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL con una pipeta de 1 mL y almacenar en hielo.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de LP1 en 250 μl 50 mm HEPES (pH 7.4) mezclado con 250 μl de detergente al 1% en el 1 x de tampón PBS con una pipeta de 1 mL. Incubar a 4 ° C con agitación suave durante 15 minutos.</li>
	<li>Centrifugue la LP1 resuspendido por 3 h a 25.000 x g y 4 ° C para separar el sobrenadante (fracción no-PSD) pellets (fracción de PSD). Quite el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL y resuspender el precipitado PSD en 100 μl de 50 mM HEPES (pH 7,4) con una pipeta de 200 μl.</li>
	<li>Determinar la concentración de proteína de las LS2, no PSD, PSD fracciones y usando un análisis de la BCA. Añadir 50 mM HEPES (pH 7,4) a cada fracción para alcanzar una concentración de 1 mg/mL y guardar a-80 ° C hasta su uso. Nota: Todas las soluciones utilizadas en los pasos 5-6 (es decir, solución tampón HEPES y tampón PBS) deben hacerse con agua purificada libre de partículas y contaminantes iónicos y orgánicos.</li>
</ol>7. Western Blotting
<ol><li>Descongelar cada fracción de proteína en el hielo. Transferencia 12 μl de cada fracción (S2 P2 y PSD en 1 mg/mL) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL con una pipeta de 20 μl.</li>
	<li>Agregar 3 μl de tampón de muestra de SDS de x 5 e incubar a 75 ° C por 30 min en un baño de agua. Enfriar la muestra a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Cargar 10 μl de la muestra de proteína en cada pozo de 4-20% peine de 15 pozos gradiente SDS-poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) en gel utilizando una pipeta de 20 μl. Correr el gel en el aparato de SDS-PAGE y en el 80-100 V en el almacenador intermediario de funcionamiento (25 mM Tris, glicina de 190 mM y 0.1% SDS; pH 8,3). Nota: Cada gel debe contener muestras de proteína de NS ratas y ratas ECS en diferentes puntos temporales después de ECS aguda o crónica.</li>
	<li>Transferencia de las proteínas de la SDS-PAGE gel a una membrana de difluoruro de polivinilo (PVDF) en los aparatos de transferencia en 25-30 V (60 mA) durante 9-12 h en tampón de transferencia (25 mM Tris, glicina de 190 mM y metanol 20%; pH 8,3).</li>
	<li>Quitar la membrana PVDF de la unidad de transferencia y lavar en solución salina tamponada con Tris (TBS) por 5 min en un agitador multiuso a TA.</li>
	<li>Bloquear la membrana en la leche de 5% y 0,1% Tween-20 en TBS para 1 h. Incubar en anticuerpos primarios (tabla 1) en tampón de lavado (leche 1% y 0,1% Tween-20 en TBS) durante la noche en un rotador de multiuso a 4 ° C (véase la Tabla de materiales para las diluciones).</li>
	<li>Lavar la membrana 4 tiempos de 10 minutos en tampón de lavado y luego lo Incube con peroxidasa de rábano (HRP)-conjugado anticuerpos secundarios en lavado tampón durante 1 h en un rotador de multiuso a TA.</li>
	<li>Lavar la membrana 4 tiempos de 10 minutos en tampón de lavado y luego con TBS durante 5 minutos.</li>
	<li>Incubar la membrana con mayor chemifluorescence sustrato durante 1 min y exponerlo a la película de rayos x. Desarrollar la película expuesta con un procesador de la película.</li>
</ol>8. cuantificación de Western Blots
<ol><li>Análisis del Western blot como un archivo TIFF y guardar este archivo en el ordenador.</li>
	<li>Abra el archivo de Western blot en el programa ImageJ como una imagen en escala de grises, debajo de "Archivo", "Abrir imagen" flecha derecha "escala de grises".</li>
	<li>Elija la herramienta selección rectangular de la barra de herramientas de ImageJ y dibujar un rectángulo que cubre una banda de Western blot solo de una proteína de interés.</li>
	<li>Bajo "Analizar," golpeó "Medida" para obtener el área y la densidad media de un grupo seleccionado.</li>
	<li>Mover el rectángulo a un área de fondo sin cambiar su forma y tamaño. Repita el paso 8.4 a la zona y la densidad media de un fondo.</li>
	<li>Restar el valor de la densidad media de una banda de fondo de la de una banda de Western blot, lo que da la densidad de banda resta de fondo de la proteína de interés.</li>
	<li>Repita los pasos 8.2 8.6 para todas las bandas de Western blot de interés.</li>
	<li>Dividir la densidad de banda resta de fondo de la proteína del interés por la densidad de banda resta de fondo de un producto génico de limpieza, tales como α-tubulina; Este paso obtiene el valor normalizado de la proteína de interés.</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Aquí, describimos un método de inducción de ECS en ratas que provoca la estimulación global de la actividad neuronal en sus hipocampos. ECS es un modelo animal de terapia electroconvulsiva, que se utiliza clínicamente para tratar trastornos depresivos refractarios de drogas en los seres humanos1,2,3. A pesar de uso de la terapia electroconvulsiva para tratar la depresión severa, el mecanismo exacto subyacente sigue siendo confus...

La terapia electroconvulsiva se ha utilizado para tratar a pacientes con trastornos depresivos mayores, incluyendo depresión severa resistente a los medicamentos, depresión bipolar, enfermedades de Parkinson y esquizofrenia1,2. En esta terapia, crisis es generada por estímulos eléctricos a la cabeza de los pacientes anestesiados vía epicranial electrodos1,2,3. Administración repetitiva de ECS ha sido clínicamente beneficiosa para los trastornos depresivos resistentes a los medicamentos1,2,3. Sin embargo, el mecanismo exacto subyacente la eficacia a largo plazo del efecto antidepresivo en los seres humanos ha permanecido elusivo. ECS es un modelo animal de terapia electroconvulsiva y es ampliamente utilizada para investigar su mecanismo terapéutico. En roedores, ECS aguda y crónica tratamiento de ECS promoción la neurogénesis adulta en el hipocampo y reorganizan la red neuronal4,5, que es probable que contribuyen a las mejoras en la flexibilidad cognitiva. Además, la elevación global de la actividad cerebral por ECS altera la abundancia de las transcripciones, como un cerebro derivada factor neurotrópico6y varias proteínas, incluyendo metabotrópicos glutamato receptor 17 y la N-metil-D-Aspartato (NMDA) tipo glutamato receptor subunidades7. Estos cambios están involucrados en mediar modificación a largo plazo del número de sinapsis, estructura y fuerza en el hipocampo7,8,9.
En modelos ECS, estimulación eléctrica se entrega a los roedores mediante electrodos implantados stereotaxically, electrodos corneales o electrodos de oído evocar convulsiones tonico-clónicas generalizadas10,11. Implantación estereotáctica de electrodos consiste en una cirugía de cerebro y requiere un tiempo considerable para mejorar las habilidades quirúrgicas del experimentador para minimizar el daño. Menos invasivos electrodos corneales pueden causar sequedad y abrasión corneal y requieren anestesia. El uso de electrodos clip de oreja omite estas limitaciones ya que pueden ser utilizados en roedores sin cirugía ni anestesia y causar lesión mínima. De hecho, encontramos que actual ratas entregado a despierto a través de clip de oreja electrodos confiablemente induce convulsiones tónico-clónicas etapas 4-5 y altera las proteínas sinápticas en sus hipocampos10.
Para examinar la abundancia ECS-inducida de proteínas sinápticas en las regiones específicas del cerebro de los roedores, es importante elegir los métodos experimentales que son los más adecuados para su detección y cuantificación. Fraccionamiento subcelular del cerebro permite el aislamiento crudo de proteínas solubles del citosol; proteínas de membrana; proteínas orgánulo-límites; e incluso las proteínas en especiales estructuras subcelulares, tales como el PSD12,13,14. El PSD es un dominio subcelular densa y bien organizado en las neuronas en que las proteínas sinápticas están concentradas en y cerca de la membrana postsináptica12,13,15. El aislamiento de la PSD es útil para el estudio de las proteínas sinápticas enriquecido en el PSD, desde cambios dinámicos en la abundancia y la función de receptores de glutamato postsinápticos, proteínas de andamiaje y proteínas de transducción de señal en el PSD12 , 15 , 16 , 17 se correlacionan con la plasticidad sináptica y la synaptopathy observada en varios trastornos neurológicos17,18. Un método de fraccionamiento subcelular anterior utilizado para purificar el PSD participando el aislamiento de la fracción insoluble en detergente de la fracción cruda de la membrana del cerebro de la centrifugación diferencial de gradientes de sacarosa14, 19. el gran reto con este método tradicional es que requiere grandes cantidades de roedores los cerebros de14,19. Preparación de roedores 10-20 para aislar la fracción de la PSD por tratamiento requiere amplia costo e inversión de tiempo y no es prácticamente posible si hay muchos tratamientos.
Para superar este reto, hemos adaptado un método más sencillo que directamente aísla la fracción PSD, sin centrifugación del gradiente de sacarosa de20,21y revisada para que sea aplicable al aislamiento de PSD desde el hipocampo de una rata sola cerebro. Nuestro método de fraccionamiento de PSD en pequeña escala produce sobre 30-50 μg de las proteínas PSD de 2 hipocampos, suficientes para el uso en diversos estudios bioquímicos, incluyendo inmunoprecipitación y Western blotting. El borrar occidental demuestra el éxito de nuestro método para aislar el PSD al revelar el enriquecimiento de proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95) y la exclusión de sinaptofisina marcador presinápticos y citoplasmática soluble de la proteína α-tubulina. Nuestra inducción de ECS y métodos de fraccionamiento de PSD en pequeña escala son fácilmente adaptables a otras regiones del cerebro de roedores y proporcionan una manera relativamente simple y confiable para evaluar los efectos de ECS en la expresión de las proteínas PSD.

<table><tbody><tr><td>Rata Spargue-Dawley</td><td>Charles River Laboratories Suministros</td><td></td><td>ECS</td></tr><tr><td>Un generador de pulsos</td><td>Ugo Bsile, Comerio, Italia</td><td>57800</td><td>Suministros ECS</td></tr><tr><td>Sistema de purificación de agua MilliQ</td><td>EMD Millipore</td><td>Z00Q0VWW</td><td>Suministros de fraccionamiento subcelular</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Em science</td><td>SX 1075-3</td><td>Suministros</td></tr> <tr><td>de fraccionamiento subcelularNa4O7P2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>221368</td><td>Suministros de fraccionamiento subcelular</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E9884</td><td>Suministros de fraccionamiento subcelular</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H0527</td><td>Suministros de fraccionamiento subcelular</td></tr><tr><td>Ácido okadaico</td><td>TOCRIS</td><td>1136</td><td>Suministros de fraccionamiento subcelular</td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa Halt</td><td>Thermo Scientific</td><td>78429</td><td>Suministros de fraccionamiento subcelular</td></tr><tr><td>NaVO3</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72060</td><td>Suministros de fraccionamiento subcelular</td></tr><tr><td>EMD Millipore Sterito Filtros estériles de</td> vacío Fisher <td>Scientific</td><td>SCGPS05RE</td><td>Suministros de fraccionamiento subcelular</td></tr><tr><td>Tijeras de iris</td><td>WPI (World Precision Instrumentos)</td><td>500216-G</td><td>Suministros de fraccionamiento subcelular</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 30 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td>Suministros de fraccionamiento subcelular</td></tr><tr><td>Homogeneizador de vidrio y un mortero de teflón</td><td>VWR</td><td>89026-384 Suministros de</td><td>fraccionamiento subcelular</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&nbsp;</td><td>C2170 (1001002)Suministros</td> <td>de fraccionamiento subcelular</td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall Legend XT/XF&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004521</td><td>Suministros de fraccionamiento subcelular</td></tr><tr><td>Reactivo A de ensayo de proteínas Pierce BCA, 500 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#23228</td><td>Suministros de Western blot</td></tr><tr><td>Reactivo de ensayo de proteínas BCA de Pierce B, 25 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#1859078</td><td>Western blot suministra</td></tr><tr><td>gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE)</td><td>BIO-RAD</td><td>#4561086S</td><td>Suministros de Western blot</td></tr><tr><td>En funcionamiento Tampón</td><td>Hecho en el laboratorio</td><td></td><td>Suministros de Western blot.&nbsp;</td></tr><tr><td>Célula de electroforesis vertical Tetra Tetra Mini-PROTEAN para geles miniprefabricados, 4 geles</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>Western blot suministra</td></tr><tr><td>membrana de difluoruro de polivinilo (PVDF)&nbsp;</td><td>Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot suministra</td></tr><tr><td>tampón de transferencia</td><td>Hecho en el laboratorio</td><td></td><td>Western blot suministra blot.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Western blot suministra</td></tr><tr><td>glicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td> Western <td>blot</td></tr><tr><td>suministra Dodecil sulfato de sodio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>436143</td><td>Western blot suministra</td></tr><tr><td>Metanol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Western blot suministra</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>detergente para el aislamiento</td></tr><tr><td>PSD Mini Trans-Blot Module&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703935</td><td>Suministros de Western blot</td></tr><tr><td>Leche en polvo instantánea descremada</td><td>Suministros de Western blot</td><td>de gran valor</td><td></td></tr><tr><td>Rotador multiusos&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model-2314</td><td>Western blot suministra</td></tr><tr><td>la película de autorradiografía Hyblot CL</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&nbsp;</td><td>E3018 (1001365)Suministros</td> de <td>Western blot</td></tr><tr><td>Sustrato de quimiofluorescencia mejorado&nbsp;</td>La <td>transferencia occidental</td> <td>Thermo Scientific</td><td>32106</td> suministra</tr><tr><td>un procesador de película Konica SRX-101A</td><td>KONICA MINOLTA</td><td>SRX-101A</td><td>La transferencia occidental suministra</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre del anticuerpo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PSD-95</td><td>Señalización</td> celular<td>#2507</td><td>Dilución de anticuerpos = 1:500 - 1,000, tiempo = 9 - 12 h, temperatura de reacción = 4 & grados; C, Especie huésped = Señal</td></tr><tr><td>celular</td> de<td>sinaptofisina</td> de conejo<td>#4329</td><td>Dilución de anticuerpos = 1:500 - 1,000, tiempo = 9 - 12 h, Temperatura de reacción = 4 &deg; C, Especie Huésped = Conejo</td></tr><tr><td>alfa-Tubulina</td><td>Santacruz</td><td>SC-5286</td><td>Dilución de anticuerpos = 1:500 - 1,000, tiempo = 9 - 12 h, Temperatura de reacción = 4 &deg; C, Especie huésped =</td></tr><tr><td>Ratón GluN2B</td><td>Neuromab</td><td>75-097</td><td>Dilución de anticuerpos = 1:500 - 1.000, tiempo = 9 - 12 h, Temperatura de reacción = 4 & deg; C, Especie huésped =</td></tr><tr><td>Ratón GluA2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Sab 4501295</td><td>Dilución de anticuerpos = 1:500 - 1.000, tiempo = 9 - 12 h, temperatura de reacción = 4 & grados; C, Especie Huésped = Conejo</td></tr><tr><td>STEP</td><td>Santacruz</td><td>SC-23892</td><td>Dilución de anticuerpos = 1:200 - 500, tiempo = 9 - 12 h, Temperatura de reacción = 4 &deg; C, Especie huésped =</td></tr><tr><td>Peroxidas de ratón AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)</td><td>Laboratorio Jackson ImmunoReserch</td><td>715-035-150</td><td>Dilución de anticuerpos = 1:2,000-5,000, tiempo = 1 h, Temperatura de reacción = RT, Especie huésped = Burro</td></tr><tr><td>Peroxidas AffiniBurro puro Anti-Conejo IgG (H + L)</td><td>Laboratorio Jackson ImmunoReserch</td><td>711-035-152</td><td>Dilución de anticuerpos = 1:2,000-5,000, tiempo = 1 h, Temperatura de reacción = RT, Especie huésped = Burro</td></tr></tbody></table>

electroconvulsiva convulsiones en ratas y fraccionamiento de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en densidad postsynaptic proteínas

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Electroconvulsiva convulsiones (ECS) es un modelo animal experimental de la terapia electroconvulsiva, el tratamiento más efectivo para la depresión severa. ECS induce convulsiones tonico-clónicas generalizadas con baja mortalidad y muerte neuronal y es un modelo ampliamente utilizado para drogas antiepilépticas de pantalla. Aquí, describimos un método de inducción de ECS en que se entrega una breve corriente de 55 mA para 0.5 s para hombre ratas 200-250 g de peso por medio de electrodos clip de oreja. Tal estimulación bilateral producida etapa 4-5 convulsiones clónicas que duró cerca de 10 s. Tras el cese de ECS aguda o crónica, las ratas más recuperadas para ser indistinguible su comportamiento simulado ratas "no crisis". Porque ECS a nivel mundial eleva la actividad cerebral, también se ha utilizado para examinar alteraciones dependientes de la actividad de proteínas sinápticas y sus efectos en la fuerza sináptica mediante varios métodos. En particular, fraccionamiento subcelular de la densidad postsináptica (PSD) en combinación con Western Blot permite la determinación cuantitativa de la abundancia de proteínas sinápticas a esta estructura sináptica especializada. En contraste con un método de fraccionamiento anterior que requiere gran cantidad de cerebros de roedores, se describe aquí un método de fraccionamiento en pequeña escala para aislar el PSD desde el hipocampo de una rata sola, sin centrifugación gradiente de sacarosa. Usando este método, nos muestran que la fracción aislada del PSD contiene proteínas de la membrana postsináptica, incluyendo PSD95, GluN2B y GluA2. Sinaptofisina marcador presinápticos y citoplasmática soluble de la proteína α-tubulina fueron excluidos de la fracción PSD, demostrando el aislamiento exitoso de PSD. Además, ECS crónica disminuyó la expresión de GluN2B en PSD, lo que indica que nuestro método de fraccionamiento de PSD en pequeña escala puede aplicarse para detectar los cambios en las proteínas PSD hipocampales de una rata sola después de tratamientos genéticos, farmacológicos o mecánicos .

Utilizando el procedimiento detallado aquí, presenta una descarga eléctrica (55 mA, 100 pulsos/s para 0.5 s) suministra a través de clip de oreja electrodos inducida por etapa no recurrente asimientos tónico-clónicos 4-5 en la rata (figura 1A-B). Un total 8 de ratas recibió inducción aguda de ECS y aparecen convulsiones tónico-clónicas etapas 4-5. Las crisis duraron cerca de 10 s y todas las ratas recuperadas dentro de 1-2 minutos de cese de ...

Electroconvulsiva convulsiones (ECS) es un modelo animal experimental de la terapia electroconvulsive para la depresión severa. ECS a nivel mundial estimula la actividad en el hipocampo, a sinaptogénesis y plasticidad sináptica. Aquí, describimos los métodos para la inducción de ECS en ratas y para el fraccionamiento subcelular de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en proteínas sinápticas.

Electroconvulsiva convulsiones en ratas y fraccionamiento de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en densidad Postsynaptic proteínas

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

El objetivo general de la inducción de convulsiones electroconvulsivas y la posterior fraccionamiento a pequeña escala del hipocampo es inducir una actividad convulsiva global en el cerebro de la rata y examinar las alteraciones inducidas por las convulsiones en las proteínas de la densidad postsináptica del hipocampo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el proceso neural del trastorno, como qué proteínas sinápticas están reguladas en regiones cerebrales específicas tras una convulsión, y si dicha regulación puede contribuir a la neuroplasticidad. La principal ventaja de este protocolo de inducción de convulsiones electroconvulsivas es que podemos inducir de forma fiable una activación global de baja intensidad en la actividad cerebral sin provocar muerte neuronal.El procedimiento será demostrado por mí y por Han Gil Jeong del laboratorio de la Dra. Hee Jung Chung. Para comenzar este procedimiento, coloque una rata macho en una jaula limpia y vacía con tapa. Permita que la rata se habitúe durante 30 minutos y luego configure el generador de pulsos para la inducción de ECS.Prepare el generador de pulsos presionando el botón de reinicio y asegúrese de que el botón de listo esté iluminado. Asegúrese de que los clips para las orejas no estén conectados al generador de pulsos. A continuación, presione el botón de descarga durante unos segundos y luego conecte los clips para las orejas al generador de pulsos.En este paso, humedezca las pinzas para orejas con solución salina estéril y asegúrese de que estén completamente saturadas. A continuación, humedezca las orejas de la rata con solución salina estéril envolviéndolas en gasa empapada con solución salina. Una vez que estén húmedas, retire la gasa.Sujete las pinzas a las orejas, una pinza por oreja, y colóquelas más allá de la banda principal del cartílago. Presione el botón de choque durante unos segundos y observe la convulsión. Para el grupo control ficticio sin convulsión, trate a la rata de forma idéntica, pero no aplique la corriente.Al comenzar el clono, desconecte los clips auriculares y registre el comportamiento convulsivo según una escala revisada de Racine de uno a cinco. Esto incluye levantarse sobre las patas traseras con clono en las cuatro extremidades en la etapa cuatro, y levantarse sobre las patas traseras y caer con clono en las cuatro extremidades en la etapa cinco. La convulsión debe durar aproximadamente 10 segundos.Registre la duración del episodio convulsivo utilizando un cronómetro. Tras la finalización del episodio, devuelva la rata a su jaula de alojamiento. Observe a la rata durante otros cinco minutos para asegurarse de su recuperación tras las convulsiones.Manténgalo alojado individualmente en la jaula y devuelva la jaula a la sala de recuperación. En este procedimiento, coloque dos hipocampos de una rata sobre una placa de cultivo tisular de 30 milímetros y córtelos en trozos pequeños usando tijeras. A continuación, transfiera los hipocampos picados a un homogenizador manual de vidrio y agregue un mililitro de tampón de homogenización frío con hielo.A continuación, inserte un lápiz redondo en un homogenizador de vidrio. Mientras el homogenizador de vidrio se mantiene en hielo, mueva suavemente y con movimientos firmes hacia arriba y hacia abajo el lápiz, de 10 a 15 veces durante un minuto, hasta que desaparezcan los trozos pequeños de tejido hipocampal. Luego, transfiera el homogenizado a un tubo microcentrífugo de 1,7 mL utilizando una pipeta de 1 mL y centrifugue el homogenizado a 800 ×g durante 10 minutos a 4 °C para separar el sobrenadante posnuclear del precipitado que contiene el tejido insoluble y los núcleos.A continuación, transfiera 50 microlitros y 950 microlitros de la fracción S1 a dos tubos nuevos separados de microcentrifugado de 1,7 mililitros y almacene estos tubos en hielo. Asimismo, conserve el pellet de la fracción P1 en hielo. Posteriormente, centrifugue la fracción S1 de 950 microlitros durante 10 minutos a 13.800 × g y 4 grados Celsius para separar el sobrenadante enriquecido con proteínas solubles citosólicas del pellet enriquecido con proteínas ligadas a membranas, incluidas las proteínas sinaptosomales.Transfiera la fracción S2 a un nuevo microcentrífuga de 1,7 mililitros y almacénela en hielo. A continuación, resuspenda el precipitado de la fracción P2 en 498 microlitros de agua purificada fría. Agregue dos microlitros de HEPES uno molar para alcanzar una concentración final de cuatro milimolar de HEPES.Incube la suspensión a cuatro grados Celsius con agitación durante 30 minutos. Después de 30 minutos, guarde la fracción P2 resuspendida en hielo. En este paso, centrifugue la fracción P2 durante 20 minutos a 25.000 ×g y a cuatro grados Celsius para separar el sobrenadante lisado y el sedimento lisado.Transfiera la fracción LS2 a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,7 mililitros y guárdela en hielo. Luego, resuspenda el precipitado LP1 en 250 microlitros de hepes al 50 milimolar, mezclados con 250 microlitros de detergente al uno por ciento y 1 X PBS. Incube la suspensión a cuatro grados Celsius con agitación suave durante 15 minutos.Posteriormente, centrifugue el precipitado LP1 resuspendido durante 3 horas a 25.000 × g y 4 grados Celsius para separar el sobrenadante de la fracción no PSD del precipitado de la fracción PSD. Transfiera el sobrenadante a un tubo microcentrífugo de 1,7 mililitros y resuspenda el precipitado de la fracción PSD en 100 microlitros de hepes 50 milimolar. En esta figura, los inmunoensayos por transferencia representativos muestran la expresión proteica de la subunidad receptora de NMDA GluN2B, el receptor AMPA, GluA2 y STEP 61 en las fracciones S2, P2 y PSD de los hipocampos de ratas sham, sin convulsiones, y ratas que recibieron estimulación electroconvulsiva aguda (ECS).La proteína soluble citoplasmática alfa-Tubulina está enriquecida en la fracción S2. La sinaptofisina es una proteína de vesículas presinápticas y está enriquecida en la fracción de membrana cruda P2, pero no en la fracción PSD, mientras que PSD-95 está enriquecida tanto en las fracciones P2 como PSD. Aquí se muestran la cuantificación de GluN2B y GluA2 en las fracciones P2 y PSD a las tres y 24 horas después de la estimulación convulsiva eléctrica aguda (ECS).La expresión de GluN2B y GluA2 en la fracción P2 se normalizó respecto a la alfa-tubulina en la fracción S2. En la fracción PSD, la expresión de GluN2B y GluA2 se normalizó respecto a PSD 95 en la misma fracción PSD. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco a seis horas si se lleva a cabo adecuadamente.Tras seguir este procedimiento, se puede realizar una espectrometría de masas automatizada, basada en mezclas de proteínas, con el fin de responder preguntas adicionales, como qué otras proteínas sinápticas se alteran mediante la ECE. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades neurológicas exploraran los mecanismos subyacentes de la disfunción sináptica, con el fin de estudiar los modelos de enfermedades neurológicas mediante trasgénesis. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir la ECE en modelos, realizar la homogenización y la fraccionamiento de la PSD a partir de los hipocampos y examinar las alteraciones de las proteínas sinápticas tras la ECE.

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Investigación

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Neurociencia

Este video muestra el registro electroencefalográfico (EEG) de convulsiones epilépticas en ratas inducidas por epilepsia. Una rata con electrodos implantados en el hipocampo ventral se conecta al sistema de registro de EEG y se coloca en una cámara de plexiglás. Se permite que la rata se mueva libremente mientras se registra la actividad cerebral para controlar la ocurrencia de convulsiones.

Registro electroencefalográfico de convulsiones epilépticas en ratas inducidas por epilepsia

Fuente: Soukupová, M., et al. Microdiálisis de aminoácidos excitatorios durante registros de EEG en ratas que se mueven libremente. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra la evaluación de los niveles de neurotransmisores excitatorios extracelulares en ratas con inducción de epilepsia crónica. Después de implantar una sonda de microdiálisis en el cerebro y confirmar la ausencia de convulsiones mediante electroencefalografía (EEG), se recolecta líquido extracelular para evaluar los niveles...

Evaluación de los niveles de neurotransmisores excitatorios en ratas inducidas por epilepsia crónica

Fuente: Jang, S., et al, Convulsiones electroconvulsivas en ratas y fraccionamiento de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por convulsiones en las proteínas de densidad postsináptica. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra la inducción de una convulsión electroconvulsiva aguda (ECS) en un modelo de rata para estudiar la neuroplasticidad inducida por convulsiones. Los investigadores aplican estimulación eléctrica a través de electrodos de clip para los oídos, lo que desencadena...

Inducción de una convulsión electroconvulsiva aguda en un modelo de rata

Este video presenta los procedimientos de preparación, registro y análisis de fuentes de EEG de alta resolución en ratas sedadas con un modelo preclínico particular de epilepsia focal en condiciones no invasivas.

Cerebro Imaging Source en modelos preclínicos de la rata de la epilepsia focal usando de alta resolución EEG Grabaciones

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Estimulación eléctrica transcraneal crónica y grabación Intracortical en ratas

Ilustramos cómo realizar grabación y eléctrica de la modulación de la actividad epileptiforme inducida por 4-aminopiridina en rebanadas de cerebro de roedores utilizando microelectrodos. Una cámara de grabación personalizada mantiene la viabilidad del tejido a lo largo de prolongadas sesiones experimentales. Asignación de electrodo en vivo y selección de pares estimulantes son realizados por una interfaz de usuario gráfica personalizada.

Grabación y modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor juntada a arreglos de microelectrodos

Modelos de convulsión aguda son importantes para el estudio de los mecanismos subyacentes a los eventos epileptiformes. Además, la capacidad para generar eventos epileptiformes en demanda proporciona un método altamente eficiente para estudiar la secuencia exacta de los eventos subyacentes a su iniciación. Aquí, describimos los modelos de crisis cortical aguda 4-aminopiridina en tejido humano y ratón.

Generación y demanda inicio de la actividad Ictal aguda en roedores y tejido humano

Aquí, describimos un método para microdiálisis en vivo analizar liberación de aspartato y glutamato en el hipocampo ventral de ratas epilépticas y no epilépticas, en combinación con las grabaciones de EEG. Concentraciones extracelulares de aspartato y glutamato pueden ser correlacionadas con las diferentes fases de la enfermedad.

Microdiálisis de aminoácidos excitatorios durante las grabaciones de EEG en mover libremente las ratas

El reto de la investigación de la epilepsia es desarrollar tratamientos novedosos para los pacientes donde la terapia clásica es inadecuada. El uso de un nuevo protocolo — con la ayuda de un sistema de administración de fármacos implantables — somos capaces de controlar las convulsiones en ratones anestesiados por la entrega electroforética de GABA en el foco epiléptico.

La entrega electroforética de ácido γ-aminobutírico (GABA) en el enfoque epiléptico previene las convulsiones en ratones

El protocolo presentado describe el transporte y la preparación del tejido hipocampal humano resecado con el objetivo final de utilizar las rebanadas cerebrales vitales como una herramienta de evaluación preclínica para posibles sustancias antiepilépticas.

Preparación de rebanadas agudas de hipocampo humano para grabaciones electrofisiológicas

Este informe describe los métodos para generar un modelo de epilepsia del lóbulo temporal basado en el encendido eléctrico de ratones transgénicos VGAT-Cre. Los ratones VGAT-Cre encendidos pueden ser útiles para determinar qué causa la epilepsia y para detectar nuevas terapias.

Preparación e implantación de electrodos para encender eléctricamente ratones VGAT-Cre para generar un modelo para la epilepsia del lóbulo temporal

Aprende a inducir convulsiones electroconvulsivas en ratas y fraccionar hipocampos para examinar cambios en proteínas postsinápticas. Este método permite estudiar neuroplasticidad sin muerte neuronal.

Electroconvulsiva convulsiones en ratas y fraccionamiento de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en densidad Postsynaptic proteínas (Video) | JoVE Journal

Electroconvulsiva convulsiones en ratas y fraccionamiento de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en densidad Postsynaptic proteínas

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