Name: Engraftment de tumor en un modelo de ratón de xenoinjerto de linfoma de manto humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprenda a establecer un modelo de xenoinjerto en ratón para linfoma de manto humano. Este método permite evaluar estrategias terapéuticas in vivo utilizando células derivadas de pacientes.

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Este trabajo fue apoyado por el Ligue Genevoise contre le Cancer, Fundación Dr. Dubois Ferriere Dinu-Lipatti, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008 y 2914-02-2012 y subvención de Fundación de ciencia nacional suizo 31003A_156760 y 310030-153456.

Las muestras de sangre humana fueron utilizadas según procedimientos aprobados por los comités de experimentación humana del Hospital Universitario de Ginebra y de ética local.
Animales procedimientos fueron realizados según el institucional ética Comité de Animal Care en Ginebra, Suiza y la Oficina veterinaria Cantonal (número de autorización: 26/GE/15).
1. preparación de células mononucleares de sangre periférica primaria (PBMCs) por separación de gradiente de densidad
Nota: 3-5 mL de sangre periférica se obtuvo de pacientes con MCL en una fase leucémica. El diagnóstico fue establecido de acuerdo con criterios estándar de diagnóstico para citometría de flujo (CD5 +, CD23−, CD200 +, población monoclonal de células B) y posteriormente confirmado por la presencia de la translocación cromosómica t(11;14) y sobreexpresión de ciclina D1. En todos los casos, células B monoclonales constituyeron a > 90% de la población total de células B. Las células restantes fueron principalmente monocitos y algunos linfocitos T.
<ol><li>Diluir 5 mL (1:1) de la muestra de sangre MCL con 5 mL de medio de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) (figura 1A).</li>
	<li>Invertir los medios gradiente de densidad (Tabla de materiales) varias veces antes de su uso para asegurar una mezcla completa.</li>
	<li>Añadir 5 mL de medio de gradiente de densidad en un tubo de centrífuga de 15 mL con un aspirador de pipeta.</li>
	<li>Capa de la muestra de sangre diluida suavemente sobre los medios de gradiente de densidad en el tubo de centrífuga de 15 mL con un aspirador (relación medios gradiente de densidad de la sangre debe ser 2:1, por ejemplo, 10 mL de sangre a 5 mL de medio de gradiente de densidad). Debe tenerse cuidado para no mezclar las dos capas (figura 1B, C).</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 400 x g durante 40 min a temperatura ambiente con los frenos de la centrifugadora apagados.</li>
	<li>Suavemente con una pipeta Pasteur estéril, aspirar la capa media (anillo blanquecino, delgado marcado con una flecha (figura 1, E)) que contiene las células mononucleares y transferirlos a un tubo limpio.</li>
	<li>Lavado de células mononucleares<ol>
<li>Estimar el volumen de la suspensión de células transferidas y añadirle 3 volúmenes de estéril 1 x de tampón fosfato salino (PBS) con 1% de albúmina sérica bovina (BSA).</li>
		<li>Mezcle la suspensión mediante pipeteo arriba y abajo varias veces.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión a 400-500 x g durante 10-15 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante para obtener el precipitado de células y repetir el paso de lavado.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y resuspender las células en el volumen deseado, por ejemplo, 1 o 2 mL de PBS.</li>
		<li>Contar el número de células por un contador de células automatizado o manualmente usando un hemocitómetro (cámara de Neubauer).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. enriquecimiento de las células B por selección negativa de células B
<ol><li>Diluir las células en PBS a una concentración final de 50 x 106 células/mL.</li>
	<li>Transferir las células a 5 mL tubo de poliestireno fondo redondo. Añadir 100 μl de anticuerpo cóctel del kit de enriquecimiento de la célula de B de 2 ml de la suspensión celular y suavemente mezclar mediante pipeteo arriba y abajo (figura 2-1).</li>
	<li>Incube las células a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
	<li>Brevemente vortex las partículas magnéticas proporcionan en el kit de enriquecimiento de células B durante 30 s (figura 2-2). Añadir 150 μL de las partículas magnéticas a 2 mL de la muestra.</li>
	<li>Incubar la muestra para otros 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Llevar el volumen de muestra a 2.5 mL con PBS de x 1 que contiene 2% de suero de ternero fetal (FCS) y ácido etilendiaminotetraacético de 1 mM (EDTA). Coloque el tubo en el imán e incubar el tubo por otro 3-5 min (figura 2-3).</li>
	<li>Recoger el imán con el tubo en su lugar y en un movimiento continuo, decantar el tubo para que la suspensión de células enriquecido se recoge en un tubo fresco (figura 2-4). Contar las células por un contador de células automatizado o manualmente usando un hemocitómetro para obtener el rendimiento total de las células de B. Nota: Normalmente, el rendimiento es ~ 105 B células/mL para normal las células de B y 5-50 x 106 células/mL para MCL.</li>
	<li>Confirmar la pureza del enriquecimiento de la célula de B<ol>
<li>Tomar ~ 50.000 células e incubar las células con anticuerpos anti-CD19/CD20 (1:20 dilución) y anticuerpo anti-CD45, junto a diferentes fluorocromos (1:10 dilución) a temperatura ambiente durante 15-30 min.</li>
		<li>Lavar con 1 mL de 1 x PBS + 1% de BSA, centrifugar las células a 400-500 x g durante 5 min y resuspender las células en ~ 200 μL de PBS.</li>
		<li>Adquirir las muestras de células por citometría de flujo y analizar la pureza de las células de B. La pureza es en su mayoría > 90% por este método (figura 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. desarrollo del modelo de ratón de xenoinjerto
<ol><li>Suspender ~ 40-60 x 106 células en 150-200 μL de PBS 1 x (volumen necesaria para inyectar al ratón).</li>
	<li>Inyecte 150 μL de la suspensión celular por vía intravenosa (i.v.) en cada vena de la cola de ratones inmunodeficientes 6-7 semana viejo de la gamma (NSG) del NOD scid independientemente del género (Figura 4A).</li>
	<li>Permitir que los ratones a desarrollar linfoma humano de aproximadamente 10 semanas. Nota: Las células de linfoma humano primario toman mucho más tiempo para desarrollar tumor en comparación con líneas de células de linfoma humano (~ 3 semanas).</li>
	<li>Cuando los animales comienzan a mostrar síntomas de una enfermedad mortal como la pérdida de peso, pelo rizado, parálisis de extremidades, disminución de la actividad, etc., sacrificar a los ratones por CO2 asfixia seguida por punción cardiaca corazón para obtener sangre.</li>
	<li>Recogemos diferentes órganos como médula ósea, bazo y hígado por disección de los ratones y recoger sangre periférica por extraer sangre desde el corazón en el momento del sacrificio para el análisis de engraftment de tumor (Figura 4B -F).</li>
</ol>4. Análisis de quimerismo de células tumorales Engrafted en diferentes órganos
<ol><li>Después de recoger los diferentes órganos, procesarlos por la interrupción mecánica para generar suspensiones de la célula después de lisis de glóbulos rojos (gr) con 200 μL de 1 x de buffer de cloruro de amonio potasio de sangre y médula ósea, 500 μl de bazo y 2 mL para el hígado .</li>
	<li>Cuente y teñir las células con anticuerpos de células B humanas, es decir, anti-CD19, anti-CD20 y anti-CD45. Nota: Ratones NSG carecen las células de B y por lo tanto, para el análisis, se tiñen las células con marcadores de células B específicas humanas.</li>
	<li>Analizar las células de cada órgano mediante citometría de flujo por que bloquean a las células B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).</li>
	<li>Cuantificar las células del tumor implantada en diversos órganos derivadas de ratones MCL inyectado en las células cerradas base como se indica en el paso 4.3 (figura 4). Nota: Para detalles, véase Tabla de materiales .</li>
</ol>

<ol><li>Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chemokines%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human chemokines: an update.</a> Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).</li>
<li>Baggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+leukocyte+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines and leukocyte traffic.</a> Nature. 392, 565-568 (1998).</li>
<li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+CA+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease</a>. , 5th edition, (2001).</li>
<li>De Silva, N. S., Klein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+B+cells+in+germinal+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of B cells in germinal centres.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).</li>
<li>Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+peripheral+blood+involvement+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma.</a> Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).</li>
<li>Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantle+cell+lymphoma%3A+diagnostic+criteria%2C+clinical+aspects+and+therapeutic+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems.</a> Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).</li>
<li>Herrmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+overall+survival+in+advanced+stage+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma.</a> J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+treatment+strategies+may+not+provide+superior+outcomes+in+mantle+cell+lymphoma%3A+overall+survival+exceeding+7+years+with+standard+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies.</a> Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).</li>
<li>Iyengar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+human+primary+mantle+cell+lymphoma+engraftment+in+NSG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice.</a> Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).</li>
<li>Klco, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+genetically+defined+subclones+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia.</a> Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).</li>
<li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tumor+xenografts+as+predictive+preclinical+models+for+anticancer+drug+activity+in+humans%3A+better+than+commonly+perceived-but+they+can+be+improved%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved.</a> Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).</li>
<li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).</li>
<li>Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+drug+response+in+patients+and+in+the+clonogenic+assay+with+solid+human+tumour+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts.</a> Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).</li>
<li>Doñate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27256571">Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma.</a> J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Los ensayos clínicos son posibles para los medicamentos que están en una etapa avanzada de desarrollo pero no se puede utilizar para el descubrimiento de medicamentos. Esfuerzos para desarrollar a animales destinatarios para xenotransplante de células humanas para probar drogas etapa temprana largo han sido llevadas a cabo. Aquí presentamos un modelo animal que evita el rechazo al injerto humano y puede establecer un modelo para enfermedades humanas, como MCL. Esto es en la actualidad un modelo de xenoinjerto de vanguard...

Linfocitos por naturaleza un papel importante en la vigilancia inmune, y trata de linfocitos es un paso crítico en la inmunidad específica de antígeno1,2de montaje. Este proceso incluye la migración de linfocitos T del timo al torrente sanguíneo y de allí a los órganos linfoides secundarios, incluyendo los ganglios linfáticos, placas de Peyer y bazo, donde se encuentran los antígenos afines. Los linfocitos B diferencian en la médula ósea y migran como ingenuo células en los folículos de los órganos linfoides secundarios3. Algunas de estas células B antígeno con su receptor unen y son activados por células T específicas. Proliferación y diferenciación de estas células B empuja las células Naive B desactivado, en la zona del manto del folículo. Las células activadas pueden distinguir entonces en memoria B las células, que patrullan el cuerpo, o maduran en inmunoglobulinas secretoras de las células plasmáticas que migran a la médula ósea4.
MCL se produce cuando los linfocitos B en la zona del manto se transforman en un tumor. Estas células de linfoma residen en el microambiente de los órganos linfoides y proliferan independientemente de linfocitos T específicos de control. Sin embargo, en un determinado momento de densidad escapan de este nicho y recirculan en el torrente sanguíneo en búsqueda de nichos en otros órganos. Teniendo en cuenta la complejidad de las moléculas de adhesión y la promiscuidad de quimiocinas y sus receptores, el mecanismo de este celular trata en vivo es mal entendido y por lo tanto dificulta la terapia. Se necesitan métodos nuevos para bloquear este proceso de migración para evitar que las células del linfoma B llegando a microambientes nuevo.
MCL es uno de los más difíciles para el tratamiento de tumores malignos de células B. El desarrollo de un fenotipo neoplásico de MCL es el resultado de una cascada multietapa, caracterizado por la adquisición de propiedades biológicas únicas. En el momento del diagnóstico, mayoría (70%) de los pacientes ya presentan una enfermedad diseminada, con una mayoría de casos exponiendo implicación extranodal en bazo, médula ósea, y en el tracto gastrointestinal5,6. En los pacientes tratados, recaídas de tumores resistentes dentro de unos años es común, a pesar de la quimioterapia convencional induce tasas de remisión alta a corto plazo7,8. Aquí presentamos un nuevo modelo de enfermedad que puede ayudar a entender su biología subyacente y difusión MCL: establecimos un modelo humano del ratón del xenoinjerto MCL que se originaron en las células del tumor primario de los pacientes. Esperamos que este modelo ayudará a desarrollar estrategias terapéuticas contra difusión de MCL y posiblemente proporcionar nuevas perspectivas clínicas para óptimo diagnóstico y tratamiento de los pacientes recaídos.

<table><tbody><tr><td>Medios Ficoll-paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>para la separación de células mononucleares</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco-Life technologies</td><td>61870-010</td><td>para la dilución de muestras de sangre</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>lavado de células</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td>para la preparación de PBS con 1% de BSA utilizado en el lavado de células durante el aislamiento</td></tr><tr><td>CD19-APC700</td><td>Beckman Coulter</td><td>B49212</td><td>marcador de células pan-B humanas</td></tr><tr><td>CD20-APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21693</td><td>marcador de células pan-B humanas</td></tr><tr><td>CD20-ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3607</td><td>marcador de células pan-B humanas</td></tr><tr><td>CD5-PC 5.5</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN A70203</td><td>marcador</td></tr> <tr>de células T humanas<td>CD23-PE</td><td>Pharmingen</td><td>555711</td><td>Proteína de superficie celular típicamente ausente en MCL</td></tr><tr><td>CD45 KO</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td>Marcador panleucocítico</td></tr><tr><td>CD200-PE</td><td>Pharmingen</td><td>552475</td><td>Proteína de superficie celular típicamente ausente en ratones MCL</td></tr><tr><td>NOD scid gamma (NSG)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>5557</td><td>utilizado para desarrollar xenoinjertos MCL en este estudio</td></tr><tr><td>Kit de enriquecimiento de células B humanas Easy sep</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>19054</td><td>utilizadas para enriquecer células B para obtener células puras para inyectar en ratones</td></tr><tr><td>FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>Navios</td><td>utilizado para caracterizar la muestra de MCL y estudiar los órganos para el injerto de MCL</td></tr><tr><td>1X tampón</td><td></td><td></td> de cloruro de amonio y potasio <td>tampón de lisis de sangre roja (NH4Cl 8,024 mg / l; KHCO3 1.001 mg/l; EDTA. Na2 y punto medio; 2H2O 3.722 mg/l )</td></tr></tbody></table>

engraftment de tumor en un modelo de ratón de xenoinjerto de linfoma de manto humano

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Los linfocitos B son actores clave en la circulación de células inmunitarias y principalmente hogar y residen en los órganos linfoides. Mientras que las células B normales sólo proliferan cuando estimulados por los linfocitos T, células B oncogénicas sobrevivirán y amplían autónomamente en nichos de órgano indefinido. Linfoma del manto (MCL) es un tal trastorno de la célula de B, donde la tasa mediana de supervivencia de los pacientes es 4-5 años. Esto requiere la necesidad de mecanismos efectivos por que se bloquean el autoguiado hacia el blanco y el injerto de estas células con el fin de aumentar la supervivencia y longevidad de los pacientes. Por lo tanto, el esfuerzo para desarrollar un modelo de ratón de xenoinjerto para estudiar la eficacia de la terapéutica MCL bloqueando la recalada mecanismo en vivo es de suma importancia. Desarrollo de receptores animales para xenotransplante de células humanas para probar drogas etapa temprana largo han sido perseguido, como modelos de ratón preclínicos relevantes son cruciales para nuevos agentes terapéuticos pantalla. Este modelo animal se desarrolla para evitar el rechazo al injerto humano y establecer un modelo para enfermedades humanas, y puede ser una herramienta extremadamente útil para el estudio de progresión de la enfermedad de tipos diferentes de linfoma y para efectuar la prueba preclínica de fármacos candidatos para malignidades hematológicas, como MCL. Hemos establecido un modelo de ratón de xenoinjerto que servirá como un excelente recurso para estudiar y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para MCL.

El manuscrito describe un protocolo optimizado para el desarrollo exitoso de un modelo de ratón de xenoinjerto de engraftment de células MCL. Preparación de una población celular pura (en este caso células MCL), es muy crítico para desarrollar exitosos xenoinjertos MCL. La figura 1 representa los pasos preparativas para el aislamiento de células mononucleares de sangre del paciente MCL por separación de gradiente de densidad. Las células mononucleares son pro...

Linfoma del manto (MCL) es un difícil de tratar el trastorno de la célula de B y es igualmente difícil establecer un modelo de ratón de xenoinjerto de MCL primaria a estudiar y desarrollar la terapéutica. Aquí, describimos el establecimiento acertado de xenoinjertos MCL en ratones para ayudar a comprender su biología subyacente.

Engraftment de tumor en un modelo de ratón de xenoinjerto de linfoma de manto humano

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

El objetivo general de este método es establecer un modelo de ratón con xenoinjerto para el linfoma de células del manto, con el fin de desarrollar estrategias de tratamiento para esta enfermedad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la hematooncología, como el resultado terapéutico de diferentes estrategias de tratamiento. La principal ventaja de esta técnica es que permite estudiar el efecto de fármacos sobre células humanas de linfoma in vivo.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia para el linfoma de células del manto, ya que mediante el uso de este modelo, no solo es factible sino también conveniente estudiar el efecto de la terapia sobre células derivadas de pacientes. Aunque este método puede proporcionar información sobre los aspectos terapéuticos del linfoma de células del manto, también puede aplicarse para estudiar diferentes tipos de linfomas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es difícil obtener xenoinjertos derivados de pacientes.Cuando tuvimos por primera vez la idea de este método, cuando queríamos estudiar la migración de linfocitos B in vivo y los efectos de algunas terapias sobre este proceso. Diluya 12 mililitros de muestra sanguínea de linfoma de células del manto con volúmenes iguales de medio RPMI 1640. Luego, invierta varias veces el medio de gradiente de densidad antes de usarlo.Aspire 15 mililitros de medio de gradiente de densidad en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Con la ayuda de un aspirador, agregue cuidadosa y suavemente la muestra de sangre diluida encima del medio de gradiente de densidad sin mezclar las dos capas. Luego, desactive los frenos y centrifugue la muestra de sangre a 400g durante 40 minutos a temperatura ambiente.Utilice una pipeta de Pasteur estéril para aspirar las células sanguíneas mononucleares de la capa media y transfiéralas a un tubo limpio. Para lavar las células mononucleares, agregue tres volúmenes de solución salina tamponada con fosfatos estéril al 1x con 1% de suero bovino fetal a un volumen estimado de suspensión celular. Pipetee la suspensión celular varias veces para lograr una mezcla adecuada.A continuación, centrifugue la muestra a 400-500g durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y lave el botón celular con solución salina tamponada con fosfatos al 1% de albúmina sérica bovina. Centrifugue la muestra.Luego, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en uno o dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato. A continuación, cuente el número de células utilizando un contador automático de células. Diluya las células en solución salina tamponada con fosfato, luego pipetee las células hacia un tubo de poliestireno de cinco mililitros y agregue 100 microlitros de una mezcla de anticuerpos a la suspensión celular.Pipetee suavemente varias veces la suspensión celular para una mezcla adecuada. Luego, incube las células a temperatura ambiente en la cabina de flujo laminar durante 10 minutos. Mientras tanto, vortexe las partículas magnéticas del kit de enriquecimiento de células B durante 30 segundos.Luego, agregue 150 microlitros de las partículas magnéticas a dos mililitros de la suspensión celular. Incube la mezcla de partículas magnéticas y células a temperatura ambiente durante cinco minutos. Ajuste el volumen de la muestra a 2,5 mililitros, coloque el tubo en el imán e incube durante otros tres a cinco minutos.Después de la incubación, en un solo movimiento continuo, vierta la suspensión celular desde el tubo unido al imán hacia un tubo nuevo. Luego, cuente el rendimiento total de células B en la suspensión utilizando un contador automático de células. Para confirmar la pureza de las células B enriquecidas, incube aproximadamente 50.000 células con anticuerpos anti-CD19, CD20 y anti-CD45 acoplados a diferentes fluorocromos a temperatura ambiente durante 15-30 minutos.Luego, lave las células con un mililitro de solución salina tamponada con fosfato al 1% y albúmina sérica bovina. Centrifugue las células a 400-500g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, deseche el sobrenadante y re suspenda el sedimento en 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato.Analice la pureza de las células B mediante citometría de flujo, que generalmente es superior al 90 % con este método. Suspenda las células en 150 microlitros de solución salina tamponada con fosfato al 1×. Luego, inyecte la suspensión celular por vía intravenosa en la vena de la cola de ratones de seis a siete semanas de edad, independientemente de su sexo.La inyección intravenosa en la vena de la cola del ratón de células de linfoma aisladas de sangre derivada del paciente también es fundamental para garantizar un injerto exitoso. Después de sacrificar a los ratones en una cámara de dióxido de carbono, recolecte los diferentes órganos. Luego, someta los órganos a una disrupción mecánica en un filtro de 70 micrones utilizando la parte posterior del émbolo de una jeringa para obtener una suspensión de células individuales.Centrifugar todas las muestras, excepto la sangre, entre 400 y 500g durante cinco minutos, y desechar el sobrenadante. Utilizar tampón de cloruro de amonio y potasio a concentración unitaria para lisar las células de sangre, médula ósea, bazo e hígado. Es importante filtrar las células procedentes de órganos aislados de ratones para obtener una suspensión de células individuales antes de pasar al citómetro de flujo, con el fin de evitar obstrucciones.Utilice anticuerpos específicos para linfocitos B, como anti-CD19, CD20 y CD45, para teñir las células. Mediante citometría de flujo se obtuvieron los linfocitos B derivados de cada órgano con anticuerpos positivos para CD19, CD20 y CD45. En función de las células seleccionadas, cuantifique las células específicas del órgano y las células tumorales injertadas obtenidas de los ratones inyectados con linfoma de células del manto.En este estudio, se realiza citometría de flujo para analizar la pureza de las células B antes y después del enriquecimiento en el linfoma de manto. Para caracterizar el linfoma de manto monoclonal, se utilizan marcadores específicos de células B como CD45, CD19, CD5, CD200, CD20 Kappa y Lambda. El análisis por citometría de flujo muestra células que se tiñen positivamente para CD45, CD19, CD20 y CD5.Y estas se seleccionan para su caracterización. También se seleccionan las células que no tiñeron para CD23 y CD200. El grado de engraftamiento específico del órgano se investiga procesando los órganos mediante citometría de flujo y luego analizando las células B.Se muestra aquí una representación comparativa del patrón de enxerto obtenido a partir de dos pacientes utilizando órganos como el bazo, la médula ósea y el hígado. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un período de tres semanas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar enriquecer los PBMC utilizados para los xenoinjertos y también realizar revisiones regulares en los ratones para detectar signos vitales de enfermedad, como pelo erizado, espalda encorvada, parálisis de las patas traseras y pérdida de peso.Tras seguir este procedimiento, los xenoinjertos podrían aplicarse a otros tipos de linfomas, por ejemplo, con el fin de realizar una medicina personalizada. Después de su desarrollo, esta técnica podría allanar el camino para otros investigadores en el campo de la hematooncología, a fin de explorar los métodos para establecer el linfoma de células del manto derivado de pacientes en ratones inmunodeficientes nod scid. Tras ver este video, debería tener una buena idea de cómo purificar los PBMC derivados de pacientes y utilizarlos para xenoinjertar ratones inmunodeficientes con el fin de comprender la estrategia de las terapias.Por favor, no olvide que trabajar con muestras sanguíneas humanas primarias puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes al realizar estos procedimientos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Un método de injerto de forma fiable la luciferasa-etiquetados humanos malignos de los nervios periféricos células del tumor de la vaina en el nervio ciático de ratones inmunodeficientes se describe. El uso de imágenes de bioluminiscencia para demostrar establecimiento adecuado de los injertos de tumor y los criterios de segregación aleatoria de los animales en grupos de estudio también se discuten.

Xenotrasplante ortotópico de los Derechos Humanos-luciferasa Tagged células malignas del tumor vaina de nervio periférico para In vivo Pruebas de candidatos a agentes terapéuticos

Este video muestra un ensayo para generar un modelo de ratón xenoinjerto humanizado. A un ratón inmunodeprimido se le inyecta ciclofosfamida para provocar el agotamiento de las células inmunitarias. Las células tumorales derivadas del paciente mezcladas con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) en un hidrogel se inyectan subcutáneamente en el ratón, formando un tumor con células T infiltrantes.

Una técnica para generar un modelo de ratón de xenoinjerto humanizado humano injertado en PBMC

Xenoinjertos tumorales humanos en ratones inmunodeficientes son herramientas valiosas para el estudio de la biología del cáncer. Se describen los protocolos específicos para generar los xenoinjertos subcutáneos y intrahepática de células de carcinoma hepatocelular humano o fragmentos tumorales. La regeneración hepática inducida por hepatectomía parcial en ratones receptores se presenta como una estrategia para facilitar el injerto intrahepática.

Generación de subcutánea e intrahepática hepatocelular carcinoma humano xenoinjertos en ratones inmunodeficientes

Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto para la viabilidad y la eficacia antitumoral de inmunoterapias celulares entregados intrabrain.

Estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de Glioblastoma Multiforme de Orthotopic humanos

Aquí utilizamos bioluminiscente, rayos x y emisión de positrones la tomografía/computado tomografía la proyección de imagen para estudiar cómo inhibidor mTOR actividad impactos tumores mieloma engrafted de médula ósea en un modelo de xenoinjerto. Esto permite fisiológicamente relevantes, no invasivo y multimodales análisis del efecto anti-mieloma de tratamientos contra tumores mieloma médula engrafted en vivo.

Proyección de imagen de tomografía multimodal bioluminiscente y emisión positrónica tomografía/computacional de xenoinjertos de médula ósea del mieloma múltiple en ratones NOG

Aquí, presentamos un protocolo para inducir y puntuar enfermedades en un modelo xenogénico de enfermedad de injerto contra huésped (xenoGVHD). xenoGVHD proporciona un modelo in vivo para estudiar la inmunosupresión de células T humanas. Además, describimos cómo detectar células T humanas en tejidos con PCR digital como herramienta para cuantificar la inmunosupresión.

Inducción y puntuación de la enfermedad de injerto-versus-huésped en un modelo de murina xenógeno y cuantificación de células T humanas en tejidos de ratón utilizando PCR digital

Describimos una célula mononuclear de sangre periférica humana (PBMC), modelo de ratón xenoinjerto humanizado basado para la investigación traslacional de inmunooncología. Este protocolo podría servir como una guía general para establecer y caracterizar modelos similares para la evaluación de la terapia I-O.

Un modelo de xenoinjerto humanizado de sangre periférica humana (PBMC) para la investigación de inmunooncología traslacional (I-O)

El protocolo actual describe métodos para establecer modelos de xenoinjerto sorinjertos derivados del paciente (PDX) y líneas celulares primarias de cáncer a partir de muestras de cáncer gástrico quirúrgico. Los métodos proporcionan una herramienta útil para el desarrollo de fármacos y la investigación de la biología del cáncer.

Establecimiento de modelos de xenoinjerto saqueos derivados del paciente y líneas celulares primarias

Los modelos de ratón de xenoinjerto de melanoma uveal de hígado humano ortotópico se crearon utilizando técnicas quirúrgicas de implantación ortotópica con técnicas de inyección de agujas y trozos tumorales derivados del paciente con líneas celulares de melanoma uveal humano cultivadas.

Generación de una plataforma de xenoinjerto de melanoma uveal humano ortotópico hepático en ratones inmunodeficientes

Aquí, presentamos un protocolo de trasplante tumoral para la caracterización de linfocitos infiltrados tumorales inherentes y derivados de la periferia en un modelo de tumor de ratón. El rastreo específico de la afluencia de células inmunes derivadas del receptor con citometría de flujo revela la dinámica de los cambios fenotípicos y funcionales de estas células durante las respuestas inmunes antitumorales.

Trasplante de tumores para evaluar la dinámica de las células T CD8+ infiltrantes de tumores en ratones

El presente protocolo describe cómo injertar piel humana en ratones diabéticos no obesos (NOD)-scid receptor de cadena gamma (NSG) con interleucina-2. En el informe se incluye una descripción detallada de la preparación de la piel humana para el trasplante, la preparación de ratones para el trasplante, el trasplante de piel humana de espesor dividido y el procedimiento de recuperación posterior al trasplante.

Modelo de piel de xenoinjerto para manipular las respuestas inmunes humanas in vivo

Aprenda a establecer un modelo de xenoinjerto en ratón para linfoma de manto humano. Este método permite evaluar estrategias terapéuticas in vivo utilizando células derivadas de pacientes.

Engraftment de tumor en un modelo de ratón de xenoinjerto de linfoma de manto humano

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