Usando un Chip de microfluidos adaptado olfativo para la proyección de imagen de la actividad Neuronal en respuesta a las feromonas en las neuronas de cabeza de macho de C. Elegans
7 de septiembre de 2017
El uso de un chip olfativo de"adaptado" para la proyección de imagen del calcio eficiente de los machos de C. elegans se describe aquí. También se muestran estudios de exposición masculina a glicerol y una feromona.
El objetivo general de este procedimiento es atrapar de manera eficiente la transitoriedad del calcio en las neuronas de la cabeza de C. Elegans macho tras la exposición a las feromonas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como la comprensión de la regulación de los circuitos neuronales específicos del sexo. La principal ventaja de esta técnica es que los machos de C. Elegans ahora pueden ser fotografiados de manera eficiente en un dispositivo de trampa microfluídica.
Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque cargar animales puede ser difícil al principio y las feromonas biogénicas no provocan la transitoriedad del calcio en todos los animales. Para comenzar el ensamblaje de los depósitos, prepare tres juegos de tubos insertando una aguja en un extremo y un tubo de metal en el otro. Luego, para cada depósito, tome una válvula Luer de tres vías y conecte una jeringa de 30 mililitros sin el émbolo, una jeringa de tres mililitros y el tubo.
Llene cada depósito con el tampón adecuado, ya sea un estímulo S basal o un estímulo S basal que contenga fluorescina. Luego, elimine las burbujas de aire tanto del depósito como del tubo, agitando y bombeando la jeringa. Ahora, llene una nueva jeringa y un tubo de tres mililitros con S basal e insértelo en el puerto de salida del dispositivo microfluídico.
Aplique suavemente un poco de presión a la jeringa hasta que aparezca el tampón en la superficie de los orificios de entrada. A continuación, conecte los tubos de control de flujo, amortiguador y depósito de estímulo a sus orificios de entrada apropiados, asegurándose de que haya gotas de líquido tanto en el orificio del puerto de carga como en la tubería que se va a conectar. Ahora, aplique suavemente un poco más de presión a la jeringa hasta que aparezcan gotas en la entrada del puerto de carga del gusano, luego inserte un pin de bloqueo sólido en ese puerto.
A continuación, retire la jeringa del puerto de salida y conecte una línea de salida conectada a la casa de vacío. Ahora, inspeccione el dispositivo en busca de burbujas en los canales de flotación en la transmisión de video del microscopio. Haga clic en vivo para observar la imagen en vivo y espere a que las burbujas se disipen naturalmente antes de continuar.
A continuación, encienda la fuente de luz fluorescente y use un filtro GFP para confirmar la dinámica de flujo adecuada. Accione la válvula de tres ondas y observe cómo aparece el flujo de control fluorescente en la transmisión de video, cuando la válvula está abierta. Para comenzar, elija un gusano en una placa de agar NGM sin semillas y deje que el gusano se aleje.
Luego, haga flotar la placa con S basal. Aspire la solución que contiene el gusano en la jeringa. Ahora, en el dispositivo, apague la aspiradora para detener el flujo usando la válvula luer de salida.
Luego, retire el pasador sólido que bloquea el puerto de carga del tornillo sinfín. Inserte el tubo que contiene gusanos en el puerto de carga. Abra la válvula luer de salida y observe la transmisión de video en vivo.
Ahora, aplique una presión suave sobre la jeringa hasta que aparezca el gusano. Tire del gusano hacia atrás si entra primero en la cola, debe entrar primero en la cabeza para estar expuesto al estímulo. El usuario debe tirar del gusano hacia atrás antes de que la cola entre completamente en el canal, de lo contrario, sacar el gusano del canal es extremadamente difícil y, por lo general, requiere enjuagar el gusano completamente a través del canal y cargar un nuevo gusano.
Ahora, usando la presión de la jeringa, haga avanzar el gusano a través del canal y coloque la cabeza del gusano, de modo que quede expuesto al flujo del tampón, pero no tan adentro del canal, que pueda moverse libremente. Se espera una pequeña cantidad de movimiento axial o de rotación en animales no paralizados. Aunque la adición de un paralizante a los tampones casi elimina este efecto.
Para disminuir la probabilidad de movimiento durante el ensayo, utilice machos mayores que estén atrapados de manera más eficiente, disminuya el ancho o el grosor del puerto de carga del gusano o aumente la cantidad de tiempo que pasa en el paralítico. Utilice el software para realizar grabaciones utilizando la excitación de la luz azul. Establezca la exposición en 100 milisegundos, abra la ventana de adquisición de imágenes, establezca los puntos de tiempo en 300 con un intervalo a cero y, a continuación, inicie la adquisición de imágenes.
Después de cinco segundos, aplique el estímulo cambiando la válvula de tres vías que controla los tampones. Una estimulación de 10 segundos es un buen punto de partida y la duración del estímulo se puede ajustar según sea necesario. Después de la estimulación, vuelva a cambiar el flujo presionando el botón nuevamente y continúe grabando hasta que se complete el video de 30 segundos.
Esto permite que la fluorescencia del campo g regrese a la línea de base. Ahora, deje reposar la preparación durante 30 segundos antes de la próxima prueba. Los gusanos que expresan g camp three en la neurona no susceptiva, ASH, responden a un glicerol molar con cambios visibles en la fluorescencia dentro de la neurona ASH, indicativos de actividad neuronal.
La neurona debe permanecer en el área de análisis durante todo el video, de lo contrario puede ocurrir un artefacto de movimiento. Si es así, mueva el área de análisis de esos puntos de tiempo y combine los valores de intensidad para crear un solo seguimiento. Los machos que son estimulados con la atractiva feromona biogénica ascarósido tres durante la exposición, se midió la transitoriedad del calcio en las cuatro neuronas CEM.
De animal a animal y de neurona a neurona, las huellas variaban en forma, signo y magnitud. Por lo tanto, es muy importante analizar muchos animales cuando se estudian las respuestas de las feromonas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cargar un macho de C. elegans en un dispositivo microfluídico y analizar la transitoriedad del calcio en las neuronas principales.
El mismo proceso se puede utilizar con hermafroditas, para identificar diferencias específicas en las respuestas neuronales. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en media hora para el primer animal fotografiado. Después de la primera grabación, se puede cargar un nuevo animal en la imagen en unos 10 minutos.
Siguiendo este procedimiento, se pueden combinar otros métodos como la optogenética con este protocolo para comprender mejor cómo se regulan los circuitos neuronales.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este artículo describe un "chip olfativo" adaptado diseñado para la obtención eficiente de imágenes de calcio en machos de C. elegans, específicamente en respuesta al glicerol y a las feromonas. El método mejora la comprensión de la regulación de circuitos neuronales específicos del sexo en neurobiología.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Neurobiología
- Imagen de calcio
- Análisis del comportamiento
Antecedentes
- C. elegans sirve como un organismo modelo importante para estudiar la función neuronal.
- La imagen de calcio permite la observación de circuitos neuronales en tiempo real.
- Las respuestas específicas al sexo frente a estímulos proporcionan información sobre la dinámica de los circuitos neuronales.
- Las técnicas eficientes de atrapamiento mejoran las capacidades de imagen en preparaciones vivas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una técnica para la obtención de imágenes de transitorios de calcio en neuronas cefálicas de machos de C. elegans.
- Explorar cómo los machos responden a feromonas biogénicas y otros estímulos.
- Proporcionar nuevas perspectivas sobre la regulación de circuitos neuronales específicos del sexo.
Métodos Utilizados
- Se utilizó un dispositivo microfluídico para atrapar e imaginar C. elegans.
- Se enfocó en machos de C. elegans como modelo biológico para evaluar las respuestas neuronales.
- Se realizó imágenes de calcio mediante una proteína fluorescente para visualizar la actividad neuronal.
- Los pasos críticos incluyeron la carga cuidadosa de los gusanos y el control del flujo de fluido durante la adquisición de imágenes.
- El proceso permite la posterior obtención de imágenes de nuevos animales en aproximadamente 10 minutos.
Resultados principales
- Se observó una transitoriedad de calcio en la neurona ASH y en cuatro neuronas CEM tras la exposición a feromonas.
- Las respuestas variaron en forma y magnitud, lo que indica diferencias individuales en las respuestas neuronales.
- El método mostró un potencial prometedor para comprender las respuestas de los circuitos neuronales a las feromonas.
- Se demostró la viabilidad de obtener imágenes de la actividad neuronal con artefactos mínimos de movimiento.
Conclusiones
- Este estudio establece un método para la obtención de imágenes en tiempo real de la actividad neuronal en C. elegans macho.
- La técnica puede adaptarse para investigar mecanismos neuronales específicos del sexo.
- Este enfoque mejora la comprensión de las respuestas neuronales a estímulos químicos y sus implicaciones en la regulación de circuitos neuronales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este chip olfativo microfluídico permite imágenes de calcio eficientes en C. elegans macho, abordando una laguna clave en la investigación de neurobiología específica del sexo. Al permitir la obtención de imágenes en tiempo real de las respuestas neuronales a feromonas, el método apoya la desactivación mecanicista de riesgos en la validación de dianas para compuestos neuroactivos. El enfoque proporciona valor predictivo en las etapas iniciales del descubrimiento al aclarar la regulación de circuitos neuronales con dimorfismo sexual.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la exploración de circuitos neuronales específicos del sexo en respuesta a estímulos feromónicos.
- Valor operativo: Proporciona una plataforma reproducible para atrapar e imaginar neuronas de la cabeza de machos de C. elegans.
- Valor predictivo: Facilita la comprobación de hipótesis sobre mecanismos dimórficos por sexo en el cribado de compuestos neuroactivos.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Facilita la preparación de sistemas neuronales validados para la cribado de compuestos posteriores.
- Valor operativo: Permite mediciones estandarizadas y cuantitativas de transitorios de calcio en poblaciones neuronales definidas.
- Preparación del ensayo: Apoya flujos de trabajo de imagen escalables con mínimos artefactos por movimiento tras el entrenamiento inicial.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor Translacional: Conecta la imagen neural en fase de descubrimiento con la continuidad preclínica mediante la alineación de biomarcadores específicos por sexo.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Disminuye la ambigüedad en las respuestas neuronales específicas por sexo frente a estímulos químicos.
- Confianza Predictiva: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo al revelar patrones variables de respuesta entre individuos.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos activos, particularmente para compuestos neuroactivos que requieren perfiles de eficacia específicos según el sexo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la regulación de circuitos neuronales específicos por sexo mediante exposición controlada a feromonas.
- Selección: Proporciona preparaciones neuronales listas para ensayos con entrega reproducible de estímulos y lecturas de calcio.
- Análisis: Permite el análisis cuantitativo de transitorios de calcio en neuronas ASH y CEM utilizando ImageJ para la evaluación comparativa entre condiciones.
- Investigación Traducida: Se alinea con la validación preclínica al proporcionar datos de respuesta neural estratificados por sexo, relevantes para el desarrollo de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma microfluídica reutilizable para un rápido intercambio de imágenes de C. elegans macho, reduciendo el tiempo de preparación por animal tras la capacitación inicial.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al resolver los mecanismos de señalización neural específicos por sexo.
- Valor operativo: Estandariza los procedimientos de carga e imagen de gusanos, mejorando el rendimiento y reduciendo la variabilidad.
- Valor estratégico: Informa decisiones de avance o interrupción al revelar respuestas neuronales dimórficas por sexo que podrían predecir una eficacia diferencial de los compuestos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos neuroactivos según perfiles de actividad neural específicos por sexo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el ensamblaje de dispositivos microfluídicos, manipulación de gusanos e imágenes de calcio.
- Depende del acceso a microscopía de fluorescencia, bombas de jeringa y sistemas de control de vacío para la regulación de fluidos.
- Necesita estandarización entre equipos para lograr una orientación consistente en la carga de gusanos y un momento adecuado de los estímulos.
- Implica consideraciones de adaptación al extender el protocolo a hermafroditas u otras cepas neuronales.
- Incluye limitaciones prácticas, como tasas variables de respuesta a feromonas y una curva inicial de aprendizaje para la eficiencia en la carga de gusanos.
