Usando un Chip de microfluidos adaptado olfativo para la proyección de imagen de la actividad Neuronal en respuesta a las feromonas en las neuronas de cabeza de macho de C. Elegans

El objetivo general de este procedimiento es atrapar de manera eficiente la transitoriedad del calcio en las neuronas de la cabeza de C. Elegans macho tras la exposición a las feromonas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como la comprensión de la regulación de los circuitos neuronales específicos del sexo. La principal ventaja de esta técnica es que los machos de C. Elegans ahora pueden ser fotografiados de manera eficiente en un dispositivo de trampa microfluídica.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque cargar animales puede ser difícil al principio y las feromonas biogénicas no provocan la transitoriedad del calcio en todos los animales. Para comenzar el ensamblaje de los depósitos, prepare tres juegos de tubos insertando una aguja en un extremo y un tubo de metal en el otro. Luego, para cada depósito, tome una válvula Luer de tres vías y conecte una jeringa de 30 mililitros sin el émbolo, una jeringa de tres mililitros y el tubo.

Llene cada depósito con el tampón adecuado, ya sea un estímulo S basal o un estímulo S basal que contenga fluorescina. Luego, elimine las burbujas de aire tanto del depósito como del tubo, agitando y bombeando la jeringa. Ahora, llene una nueva jeringa y un tubo de tres mililitros con S basal e insértelo en el puerto de salida del dispositivo microfluídico.

Aplique suavemente un poco de presión a la jeringa hasta que aparezca el tampón en la superficie de los orificios de entrada. A continuación, conecte los tubos de control de flujo, amortiguador y depósito de estímulo a sus orificios de entrada apropiados, asegurándose de que haya gotas de líquido tanto en el orificio del puerto de carga como en la tubería que se va a conectar. Ahora, aplique suavemente un poco más de presión a la jeringa hasta que aparezcan gotas en la entrada del puerto de carga del gusano, luego inserte un pin de bloqueo sólido en ese puerto.

A continuación, retire la jeringa del puerto de salida y conecte una línea de salida conectada a la casa de vacío. Ahora, inspeccione el dispositivo en busca de burbujas en los canales de flotación en la transmisión de video del microscopio. Haga clic en vivo para observar la imagen en vivo y espere a que las burbujas se disipen naturalmente antes de continuar.

A continuación, encienda la fuente de luz fluorescente y use un filtro GFP para confirmar la dinámica de flujo adecuada. Accione la válvula de tres ondas y observe cómo aparece el flujo de control fluorescente en la transmisión de video, cuando la válvula está abierta. Para comenzar, elija un gusano en una placa de agar NGM sin semillas y deje que el gusano se aleje.

Luego, haga flotar la placa con S basal. Aspire la solución que contiene el gusano en la jeringa. Ahora, en el dispositivo, apague la aspiradora para detener el flujo usando la válvula luer de salida.

Luego, retire el pasador sólido que bloquea el puerto de carga del tornillo sinfín. Inserte el tubo que contiene gusanos en el puerto de carga. Abra la válvula luer de salida y observe la transmisión de video en vivo.

Ahora, aplique una presión suave sobre la jeringa hasta que aparezca el gusano. Tire del gusano hacia atrás si entra primero en la cola, debe entrar primero en la cabeza para estar expuesto al estímulo. El usuario debe tirar del gusano hacia atrás antes de que la cola entre completamente en el canal, de lo contrario, sacar el gusano del canal es extremadamente difícil y, por lo general, requiere enjuagar el gusano completamente a través del canal y cargar un nuevo gusano.

Ahora, usando la presión de la jeringa, haga avanzar el gusano a través del canal y coloque la cabeza del gusano, de modo que quede expuesto al flujo del tampón, pero no tan adentro del canal, que pueda moverse libremente. Se espera una pequeña cantidad de movimiento axial o de rotación en animales no paralizados. Aunque la adición de un paralizante a los tampones casi elimina este efecto.

Para disminuir la probabilidad de movimiento durante el ensayo, utilice machos mayores que estén atrapados de manera más eficiente, disminuya el ancho o el grosor del puerto de carga del gusano o aumente la cantidad de tiempo que pasa en el paralítico. Utilice el software para realizar grabaciones utilizando la excitación de la luz azul. Establezca la exposición en 100 milisegundos, abra la ventana de adquisición de imágenes, establezca los puntos de tiempo en 300 con un intervalo a cero y, a continuación, inicie la adquisición de imágenes.

Después de cinco segundos, aplique el estímulo cambiando la válvula de tres vías que controla los tampones. Una estimulación de 10 segundos es un buen punto de partida y la duración del estímulo se puede ajustar según sea necesario. Después de la estimulación, vuelva a cambiar el flujo presionando el botón nuevamente y continúe grabando hasta que se complete el video de 30 segundos.

Esto permite que la fluorescencia del campo g regrese a la línea de base. Ahora, deje reposar la preparación durante 30 segundos antes de la próxima prueba. Los gusanos que expresan g camp three en la neurona no susceptiva, ASH, responden a un glicerol molar con cambios visibles en la fluorescencia dentro de la neurona ASH, indicativos de actividad neuronal.

La neurona debe permanecer en el área de análisis durante todo el video, de lo contrario puede ocurrir un artefacto de movimiento. Si es así, mueva el área de análisis de esos puntos de tiempo y combine los valores de intensidad para crear un solo seguimiento. Los machos que son estimulados con la atractiva feromona biogénica ascarósido tres durante la exposición, se midió la transitoriedad del calcio en las cuatro neuronas CEM.

De animal a animal y de neurona a neurona, las huellas variaban en forma, signo y magnitud. Por lo tanto, es muy importante analizar muchos animales cuando se estudian las respuestas de las feromonas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cargar un macho de C. elegans en un dispositivo microfluídico y analizar la transitoriedad del calcio en las neuronas principales.

El mismo proceso se puede utilizar con hermafroditas, para identificar diferencias específicas en las respuestas neuronales. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en media hora para el primer animal fotografiado. Después de la primera grabación, se puede cargar un nuevo animal en la imagen en unos 10 minutos.

Siguiendo este procedimiento, se pueden combinar otros métodos como la optogenética con este protocolo para comprender mejor cómo se regulan los circuitos neuronales.