Electroforesis en gel horizontal para la detección mejorada de los complejos proteína-ARN

El objetivo general de este protocolo consiste en analizar las interacciones de las proteínas de ARN mediante electroforesis en gel nativo horizontal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la bioquímica del ARN, como la definición de las características de las interacciones específicas de las proteínas del ARN. La principal ventaja de esta técnica es que permite monitorizar la formación de complejos varias veces durante la electroforesis.

Para el aparato de gel horizontal, use una caja de gel con una bandeja de fundición de 27 centímetros por 21 centímetros y una capacidad para dos peines de 24 pocillos. Esta configuración proporciona un total de 48 muestras que se pueden analizar simultáneamente. Prepare dos litros de tampón de funcionamiento 1x TBE diluyendo 400 mililitros de 5x TBE con 1.600 mililitros de agua y mezclando.

Coloque el tampón TBE en la cámara frigorífica para que se enfríe. Prepare los siguientes reactivos siguiendo los procedimientos estándar, 40% de acrilamida best 19:1, 5x TBE, temed y 10% de amonio por sulfato. Para hacer un gel de acrilamida al 10% nativo, agregue lo siguiente a un matraz de 500 mililitros: 80 mililitros de 5x TBE, 100 mililitros de acrilamida al 40% y agua hasta un volumen final de 400 mililitros.

Añadir cuatro mililitros de amonio al 10% por sulfato y 400 microlitros de temed y mezclar bien. Vierta la mezcla en la bandeja de fundición horizontal y deje que el gel se polimerice en la campana extractora durante 30 minutos. El gel polimerizado tendrá aproximadamente dos centímetros de espesor y quedará una fina capa de líquido encima del gel.

Coloque el gel en la caja de gel y llévelo a la cámara frigorífica. A continuación, vierta el líquido y enjuague con tampón corriente. Retire los peines con cuidado, agregue dos litros de tampón de corriente fría a la caja de gel y luego use una jeringa para enjuagar los pocillos con tampón de corriente.

Deje correr el gel a 120 voltios durante una hora a cuatro grados centígrados en una habitación fría. Mientras se preejecuta el gel, prepare las reacciones de unión. Agregue los siguientes componentes de reacción de unión a cada tubo de microcentrífuga libre de ARN en este orden: cinco microlitros de BSA de 10 milimolares, cinco microlitros de DTT de 20 milimolares, cinco microlitros de ARNt de levadura de 10 milimolares, 10 microlitros de tampón de unión 5x, proteína bicaudal-c a una concentración final de 250 nanomolares en 50 microlitros, agua tratada con DEPC a un volumen final de 45 microlitros y cinco microlitros de sustrato de ARN marcado con fluorescencia.

Cierre los tubos y agite suavemente para mezclar, centrifugar los tubos brevemente e incubar en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando se completen las reacciones de unión, agregue 15 microlitros de glicerol al 50% a cada reacción y mezcle suavemente. Cargue cuidadosamente 30 microlitros de cada reacción en los pocillos del gel, la cantidad de muestra que se puede cargar en un solo pocillo varía según el grosor del gel y el tamaño de los pocillos.

La fuente de alimentación del aparato de gel, encienda la alimentación, ajuste el voltaje a 120 voltios y haga funcionar el gel a cuatro grados centígrados. Para evitar dañar o blanquear el ARN marcado con fluorescencia, realice la electroforesis en la oscuridad. Los tiempos de electroforesis variarán dependiendo de los detalles del complejo de proteínas de ARN que se esté analizando.

Una ventaja importante del análisis de ensayo de desplazamiento de movilidad electroforado horizontal es que la electroforesis se puede detener en la imagen de gel antes de completar la ejecución. Realice análisis con cualquier instrumento diseñado para detectar sustratos fluorescentes de imágenes. Ajuste la configuración del generador de imágenes, para ligandos marcados con fluorescencia, utilice los siguientes ajustes.

Longitud de onda de fluoresceína de 473 nanómetros, voltaje fotomultiplicador de 750 voltios y tamaño de píxel de 100 micrómetros. Escanea el gel para capturar la imagen. Después de la toma de imágenes, el gel se puede volver a colocar en el aparato y la electroforesis se puede continuar durante más tiempo.

La unión de la proteína xenopus bicaudal-C o Bicc1 a un ARNm de Cripto1 marcado con fluorescencia que contiene un sitio de unión a Bicc1, se analizó mediante electroforesis en gel nativo vertical y horizontal, como control negativo, Bicc1 se mezcló con un ARN marcado con fluorescencia derivado del ARNm de CyclinB1. Usando cualquiera de los dos métodos, se hizo evidente que Bicc1 se une al ARN de Cripto1 y forma un complejo específico. Sin embargo, los complejos Bicc1, Cripto1 fueron significativamente más distintos cuando se analizaron con el gel horizontal, lo que facilitó su detección y permitió la discriminación de los complejos de ARN proteico del ARN no unido.

Después de la toma de imágenes, el gel se devolvió al aparato de gel, se realizó una electroforesis durante tres horas y media adicionales y se volvieron a tomar imágenes. Como se muestra aquí, los complejos habían migrado más lejos y todavía eran fácilmente detectables, lo que indica su estabilidad. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro o cinco horas, si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar las interacciones de las proteínas de ARN mediante electroforesis en gel nativo horizontal.