Name: Electroforesis en gel horizontal para la detección mejorada de los complejos proteína-ARN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Aprenda electroforesis en gel horizontal nativo para analizar interacciones ARN-proteína con monitoreo en tiempo real. Este método permite estudiar 48 muestras simultáneamente y examinar la formación de complejos durante el proceso.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Damos las gracias a Laura Vanderploeg por la preparación de las cifras. El trabajo en el laboratorio de hojas de cálculo es apoyado por la subvención NSF 1050395 y subvención NIH (R21HD076828). El trabajo en el laboratorio de Ryder es apoyado por las concesiones de NIH R01GM117237 y R01GM117008. Megan Dowdle es apoyada por una Beca de Oportunidades Avanzadas de SciMed GRS a través de la Escuela de Graduados de la Universidad de Wisconsin-Madison y el Programa de Capacitación en Biotecnología a través del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (T32GM008349).

1. Preparación del gel de poliacrilamida nativa horizontal 4 . <ol><li> Preparación de los materiales necesarios. <ol><li> Para el aparato de gel horizontal, utilice una caja de gel (37 cm x 24 cm) con una bandeja de 27 cm x 21 cm y una capacidad para dos peines de 24 pocillos. Esta configuración proporciona un total de 48 muestras que pueden analizarse simultáneamente. </li><li> Preparar los siguientes reactivos: 40% de Acrilamida-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borato-EDTA pH 8,0), TEMED y 10% de APS (persulfato de amonio). </li></ol></li><li> Generación de un gel natural de acrilamida al 10%. <ol><li> En un matraz de 500 ml, se añaden 80 ml de TBE 5x, 100 ml de acrilamida al 40% y agua hasta un volumen final de 400 ml. </li><li> Añadir 4 ml de APS al 10% y 400 μl de TEMED. Mezclar bien. </li><li> Verter la mezcla en la bandeja de colada horizontal y dejar que el gel se polimerice durante 30 min. El gel tendrá aproximadamente 2 cm de espesor. NOTA: Los geles pueden fundirse en una campana para acelerarPolimerización. Después de la polimerización, una fina capa de líquido permanecerá en la parte superior del gel. </li><li> Vierta el líquido y enjuague con buffer de funcionamiento. Retire el (los) peine (s) cuidadosamente y enjuague los pocillos con tampón de funcionamiento con una jeringa. </li></ol></li><li> Preparación del tampón de funcionamiento. <ol><li> Preparar 2 L de tampón de funcionamiento 1x TBE para la caja de gel. Diluir 400 ml de 5XTBE con 1600 ml y mezclar. Coloque el tampón TBE 1x en la habitación fría para enfriar. </li></ol></li><li> Pre-Ejecutar el gel <ol><li> Añadir 2 l de buffer de funcionamiento en frío a la caja de gel e insertar el gel. </li><li> Pre-ejecutar el gel a 120 V durante 1 h a 4 ° C en una habitación fría. Durante este tiempo, preparar la reacción de unión. </li></ol></li></ol> 2. Reacción de unión 8 <ol><li> 2.1.Preparar los siguientes componentes de la reacción. DTT 20 mM BSA 10 mM 10 mM de ARNt de levadura 5X (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 25KCl 0 mM, Tween-20 al 0,2%), 100 nM de ARN marcado con fluoresceína comprado comercialmente Concentrado de proteína Bicaudal-C Glicerol al 50% en H _ { 2} O H 2 O tratado con DEPC </li><li> Ensamble los componentes de la reacción de unión en un tubo de microcentrífuga libre de RNasa. <ol><li> Añadir al tubo 5 μl de BSA 10 mM, 5 μL de DTT 20 mM, 5 μL de tRNA de levadura 10 mM, 10 μl de Tampón de Unión 5x. </li></ol></li><li> Añadir proteína a una concentración final de 250 nM en 50 μ l. Añadir agua hasta un volumen final de 45 μl. </li><li> Añadir 5 μl de sustrato de ARN marcado fluorescentemente. Utilizar un sustrato de 32 nucleótidos marcado con fluoresceína comercialmente comprado en 3 &#39;. </li><li> Mezclar e incubar en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Análisis de muestras sobre el gel de poliacrilamida horizontal nativo <ol><li> A cada reacción, añadir 15 μL de glicerol al 50% y mezclar suavemente. </li><li> CarefuAgregue 30 μL de cada reacción al gel. La cantidad de muestra que puede cargarse en un solo pocillo varía dependiendo del espesor del gel y del tamaño de los pocillos. Hemos cargado volúmenes tan poco como 15 μL y hasta 45 μL en un solo pozo de geles creados con un peine de 24 pocillos y vertidos hasta un espesor de 2 cm. </li><li> Después de conectar la fuente de alimentación al aparato del gel encender la energía y ajustar la tensión. Ejecutar el gel a 4 ° C a 120 V. NOTA: Para el aparato de gel horizontal, éste termina siendo de aproximadamente 5 V / cm. Para el aparato de gel vertical, éste es de 16 V / cm. <ol><li> Para evitar dañar o blanquear el ARN marcado fluorescentemente, conduzca la electroforesis en la oscuridad. </li><li> Varían los tiempos de electroforesis dependiendo de los específicos del complejo ARN-proteína que se está analizando. NOTA: Una ventaja importante del análisis EMSA horizontal es que se puede detener la electroforesis, la imagen del gel y luego la geL se puede volver a colocar en el aparato y la electroforesis puede continuar durante más tiempo. </li></ol></li></ol> 4. Imaging el gel <ol><li> Realice el análisis con cualquier instrumento diseñado para la detección e imagenología de sustratos fluorescentes. </li><li> Coloque el gel en la cámara. </li><li> Ajuste los ajustes del imager. Para los ligandos de ARN marcados con fluoresceína, utilice los siguientes ajustes: FAM (longitud de onda 473 nm), 750 Voltaje del fotomultiplicador (PMT), 100 μm de tamaño de píxel. </li><li> Escanee el gel para capturar la imagen. </li></ol>

<ol><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+characterization+of+bacterial+polyribosomes+in+agarose-acrylamide+composite+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels.</a> J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+by+the+embryonic+cell+fate+determinant+and+germline+totipotency+factor+MEX-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).</li>
<li>Royer, C. A., Scarlata, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+approaches+to+quantifying+biomolecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions.</a> Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).</li>
<li>Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoresis+of+proteins+and+protein-protein+complexes+in+native+polyacrylamide+gels+using+a+horizontal+gel+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus.</a> Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).</li>
<li>Buczek, P., Horvath, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+Characterization+of+Binding+Oxytricha+nova+Single+Strand+Telomere+DNA+with+the+Alpha+Protein+N-terminal+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain.</a> J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA+binding+and+translational+repression+by+the+Bicaudal-C+regulatory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).</li>
<li>Gamberi, C., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bic-C+family+of+developmental+translational+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Bic-C family of developmental translational regulators.</a> Comp Funct Genomics. , 141386(2012).</li>
<li>Saffman, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+bicaudal-C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li>
<li>Chicoine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis%2C+cytoskeletal+organization%2C+and+its+own+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li>
<li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal+C%2C+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies%2C+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li>
<li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17 (1), 14-20 (2011).</li>
<li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los geles nativos de poliacrilamida son una herramienta invaluable para investigar las interacciones proteína-ARN y tradicionalmente estos geles son sometidos a electroforesis vertical 2 , 3 . Hemos utilizado una modificación del protocolo que sustituye los geles de poliacrilamida nativos creados y electrophoresed horizontalmente 1 , 4 , 6 , <sup class="xref"...

Los ensayos electroforéticos de cambio de movilidad (EMSA) han demostrado ser una herramienta bioquímica inestimable para analizar las interacciones proteína-ácido nucleico específicas 1 , 2 , 3 . Estos ensayos pueden proporcionar información importante con respecto a la afinidad de unión de las proteínas al ARN o al ADN 3 , a la estequiometría de componentes de los complejos ácido nucleico-proteína 1 y aportan nuevas e importantes ideas sobre la especificidad de unión de las proteínas de unión al ARN mediante experimentos de competición de sustratos 1 . La configuración experimental tradicional para estos ensayos consiste en mezclar proteína purificada con un sustrato de ARN radiomarcado. Los complejos resultantes se analizan a continuación con geles de poliacrilamida no desnaturalizantes (nativos) vertidos entre dos placas de vidrio seguido por electroforesis de muestra en un aparato vertical 3. Si bien este enfoque se ha utilizado exhaustivamente para proporcionar importantes conocimientos en los mecanismos bioquímicos que subyacen a la unión de proteínas a los ácidos nucleicos, también tiene varias limitaciones. Por ejemplo, esta estrategia básica tiene un rendimiento relativamente bajo y no es fácilmente adaptable para aplicaciones que requieren analizar muchas reacciones de unión en paralelo. Además, con el aparato vertical tradicional es un desafío para potencialmente monitor de complejos en múltiples ocasiones durante la electroforesis [ 3 , 4] . Aquí presentamos una adaptación del ensayo EMSA que utiliza geles nativos de poliacrilamida moldeados en un aparato de superficie plana, electroforesis horizontal y sustratos de ARN marcados fluorescentemente 4 , 5 , 6 , 7 . La incorporación de estas modificaciones relativamente simples a laTegy ofrece algunas ventajas poderosas. En particular, el formato de superficie plana horizontal se presta fácilmente para analizar docenas de muestras simultáneamente 4 . También, para algunos complejos de ARN-proteína, tales como los formados entre la proteína Bicaudal-C y su electroforesis de sustrato de ARN en un gel horizontal proporciona una mayor capacidad para resolver complejos de ARN-proteína distintos y discriminar éstos a partir del sustrato de ARN no unido.

<table><tbody><tr><td>Caja de gel horizontal</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>El producto ya no se fabrica. Se pueden encontrar cajas de gel similares en Thermo Scientific, cajas de gel de la serie A. Número de catálogo: A2-BP</td></tr><tr><td>Peines de electroforesis de gel horizontal grande grande de 24 pocillos</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>El producto ya no se fabrica. Se pueden encontrar cajas de gel similares en los peines de caja de gel de la serie A de Thermo Scientific. Número de catálogo: A2-24C</td></tr><tr><td>Powerpac 300</td><td>Bio-Rad</td><td>1655050</td><td></td></tr><tr><td>Célula de electroforesis mini-Protean II</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2940</td><td></td></tr><tr><td>InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrilamida/Bis</td><td>IBI</td><td>IB70015</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>IBI</td><td>IB70120</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>IBI</td><td>IB70080</td><td></td></tr><tr><td>ARNt de levadura</td><td>Ambion</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína marcada con RNA</td><td>IDT</td><td>N/A</td> El <td>pedido se puede personalizar según la longitud y la secuencia deseada</td></tr><tr><td>EDTA hidrato de sal tetrasódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5391-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Ultrapure</td><td>US Biológico</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotritol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483 12 3</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr></tbody></table>

electroforesis en gel horizontal para la detección mejorada de los complejos proteína-arn

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

La electroforesis nativa de gel de poliacrilamida es una herramienta fundamental de la biología molecular que se ha utilizado ampliamente para el análisis bioquímico de las interacciones ARN-proteína. Estas interacciones se han analizado tradicionalmente con geles de poliacrilamida generados entre dos placas de vidrio y muestras sometidas a electroforesis vertical. Sin embargo, los geles de poliacrilamida moldeados en bandejas y sometidos a electroforesis horizontalmente ofrecen varias ventajas. Por ejemplo, los geles horizontales utilizados para analizar complejos entre sustratos de ARN fluorescentes y proteínas específicas pueden ser visualizados múltiples veces a medida que avanza la electroforesis. Esto proporciona la oportunidad única de monitorear los complejos ARN-proteína en varios puntos durante el experimento. Además, la electroforesis en gel horizontal hace posible analizar muchas muestras en paralelo. Esto puede facilitar enormemente los experimentos en el curso del tiempo, así como analizar múltiples reacciones simultáneamente para comparar diferentes componentes y condiciones. Aquí estamosOvide un protocolo detallado para generar y usar electroforesis en gel nativa horizontal para analizar las interacciones ARN-Proteína.

Para demostrar la potencia y versatilidad de la electroforesis horizontal en gel natural se analizó la unión de la proteína Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) a un ARN marcado fluorescentemente que contenía un sitio de unión a Bicc1. Las proteínas Bicc1 funcionan como represores translacionales específicos de mRNA para controlar las decisiones de destino celular durante las etapas maternas de desarrollo animal 9 , 10 ,</sup...

La electroforesis en gel de poliacrilamida nativa es una herramienta fundamental para analizar las interacciones ARN-proteína. Tradicionalmente, la mayoría de los experimentos han utilizado geles verticales. Sin embargo, los geles horizontales proporcionan varias ventajas, tales como la oportunidad de monitorizar complejos durante la electroforesis. Proporcionamos un protocolo detallado para generar y usar electroforesis en gel nativa horizontal.

Electroforesis en gel horizontal para la detección mejorada de los complejos proteína-ARN

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

El objetivo general de este protocolo es analizar las interacciones entre ARN y proteínas utilizando electroforesis nativa horizontal en gel. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en bioquímica del ARN, como definir las características de interacciones específicas entre ARN y proteínas. La principal ventaja de esta técnica es que permite monitorear la formación de complejos varias veces durante la electroforesis.Para el aparato de electroforesis horizontal, utilice una cubeta con una bandeja de colado de 27 centímetros por 21 centímetros y capacidad para dos peines de 24 pozos. Esta configuración permite analizar simultáneamente un total de 48 muestras. Prepare dos litros de tampón de electroforesis 1x TBE diluyendo 400 mililitros de TBE 5x con 1.600 mililitros de agua y mezclando.Coloque el tampón TBE en la cámara fría para enfriarlo. Prepare los siguientes reactivos siguiendo los procedimientos estándar: acrilamida al 40% mejor 19:1, TBE 5x, temed y sulfato de amonio al 10%. Para preparar un gel de acrilamida nativo al 10%, agregue lo siguiente a un matraz de 500 mililitros: 80 mililitros de TBE 5x, 100 mililitros de acrilamida al 40% y agua hasta un volumen final de 400 mililitros.Añada cuatro mililitros de sulfato de amonio al 10 % y 400 microlitros de TEMED y mezcle bien. Vierta la mezcla en la bandeja horizontal para moldear y deje que el gel se polimerice en la campana extractora durante 30 minutos. El gel polimerizado tendrá aproximadamente dos centímetros de grosor y quedará una capa delgada de líquido sobre la superficie del gel.Coloque el gel en la cámara de electroforesis y llévela al cuarto frío. A continuación, vierta el líquido y enjuague con tampón de corrida. Retire cuidadosamente los peines, agregue dos litros de tampón de corrida frío a la cámara de electroforesis y luego use una jeringa para enjuagar los pocillos con tampón de corrida.Corra previamente el gel a 120 voltios durante una hora a cuatro grados centígrados en una cámara fría. Mientras el gel se está corriendo previamente, prepare las reacciones de unión. Añada los siguientes componentes de la reacción de unión a cada tubo microcentrífugo libre de ARN en este orden: cinco microlitros de BSA 10 milimolar, cinco microlitros de DTT 20 milimolar, cinco microlitros de ARNt de levadura 10 milimolar, 10 microlitros de tampón de unión 5x, proteína bicaudal-c hasta una concentración final de 250 nanomolar en 50 microlitros, agua tratada con DEPC hasta un volumen final de 45 microlitros y cinco microlitros de sustrato de ARN marcado con fluorescencia.Cierre los tubos y agite suavemente para mezclar; centrifugue brevemente los tubos e incube en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando las reacciones de unión hayan finalizado, añada 15 microlitros de glicerol al 50 % a cada reacción y mezcle suavemente. Cargue cuidadosamente 30 microlitros de cada reacción en los pocillos del gel; la cantidad de muestra que puede cargarse en un solo pocillo varía según el grosor del gel y el tamaño de los pocillos.Conecte la fuente de alimentación al aparato de electroforesis, encienda el equipo, ajuste el voltaje a 120 voltios y realice la electroforesis a cuatro grados Celsius. Para evitar dañar o decolorar el ARN marcado con fluorescencia, realice la electroforesis en la oscuridad. Los tiempos de electroforesis variarán según las características específicas del complejo proteína-ARN que se analice.Una ventaja importante del análisis de desplazamiento de movilidad por electroforesis horizontal es que la electroforesis puede detenerse en la imagen del gel antes de que finalice la corrida. Realice el análisis con cualquier instrumento diseñado para detectar sustratos fluorescentes por imagen. Ajuste la configuración del equipo de imagen; para ligandos marcados con fluorescencia, utilice la siguiente configuración.Longitud de onda de fluoresceína de 473 nanómetros, voltaje del fotomultiplicador de 750 voltios y tamaño de píxel de 100 micrómetros. Escanee el gel para capturar la imagen. Después del análisis de imagen, el gel puede colocarse nuevamente en el aparato y la electroforesis puede continuarse durante períodos más largos.Se analizó la unión de la proteína xenopus bicaudal-C o Bicc1 a un ARNm de Cripto1 marcado con fluorescencia que contenía un sitio de unión a Bicc1, mediante electroforesis nativa vertical y horizontal. Como control negativo, Bicc1 se mezcló con un ARN marcado con fluorescencia derivado del ARNm de CyclinB1. Fue claramente evidente, utilizando cualquiera de los dos métodos, que Bicc1 se une al ARN de Cripto1 y forma un complejo específico. Sin embargo, los complejos de Bicc1 y Cripto1 fueron significativamente más definidos cuando se analizaron con el gel horizontal, lo que facilitó su detección y permitió discriminar los complejos proteína-ARN del ARN no unido.Después de la obtención de imágenes, el gel se devolvió al aparato de gel, se realizó la electroforesis durante tres horas y media adicionales y se volvió a obtener la imagen. Como se muestra aquí, los complejos habían migrado más y aún eran fácilmente detectables, lo que indica su estabilidad. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cuatro a cinco horas, si se lleva a cabo correctamente.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar las interacciones entre ARN y proteínas utilizando electroforesis nativa en gel horizontal.

horizontal-gel-electrophoresis-for-enhanced-detection-protein-rna

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Fuente: Stenum, T. S., et al. Cuantificación de la abundancia y los niveles de carga de ARN de transferencia en Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demuestra el uso de electroforesis en gel y blot septentrional para detectar y comparar los niveles de carga de los ARN de transferencia en E. coli separando las formas aminoaciladas y desaciladas.

Electroforesis en gel y Northern Blot para detectar los niveles de carga del ARNt en E. coli

Este video muestra una técnica de separación de proteínas basada en poliacrilamida desnaturalizante. Esta técnica ayuda en la identificación preliminar de proteínas en función de sus pesos moleculares.

Electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio para el análisis de proteínas: una técnica para separar y visualizar proteínas basada en el peso molecular

En este video, demostramos un método de electroforesis en gel bidimensional que separa proteínas individuales de una mezcla compleja de proteínas obtenidas de tejidos tumorales de adenoma hipofisario humano no funcional (NFPA). Las proteínas se separan en función de su carga eléctrica en la primera dimensión y se separan aún más en función de los pesos moleculares en la segunda dimensión.

Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida: una técnica de separación para el análisis de proteínas en mezclas complejas de proteínas basada en la carga y el peso molecular

En este video, demostramos el ensayo de cambio de movilidad electroforética para detectar interacciones proteína-ADN utilizando sondas de ADN marcadas con fluorescentes infrarrojos. Cuando la proteína se une a la sonda de ADN, forma un gran complejo que migra lentamente y aparece como una banda desplazada en el gel.

Ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética para la detección de complejos de factor de transcripción-ADN

Aquí se presenta un protocolo para analizar las interacciones RNA / proteína. El ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) se basa en la migración diferencial de los complejos de ARN / proteína y ARN libre durante la electroforesis en gel nativo. Mediante el uso de una sonda de RNA radiomarcada, complejos / proteína de ARN pueden ser visualizados por autorradiografía.

La movilidad electroforética cambio de ensayo (EMSA) para el estudio de las interacciones RNA-proteína: El IRE / IRP Ejemplo

Se describe aquí un protocolo optimizado de ensayos fluorescentes cambio de movilidad electroforética (FEMSA) utilizando purificados Sox-2 proteínas, junto con sondas fluorescentes infrarrojos marcado tinte de ADN como un estudio de caso para hacer frente a una importante cuestión biológica.

Un protocolo optimizado para el ensayo de cambio de movilidad electroforética utilizando oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo

Divulgamos los protocolos para la síntesis y purificación de oligómeros del péptido de ácido nucleico (PNA) incorporando modificado residuos. Se describen los métodos bioquímicos y biofísicos para la caracterización del reconocimiento de dúplex RNA por las PNAs modificados.

Reconocimiento de secuencia específica y selectivo de RNAs de doble cadena sobre ARN monocatenario de modifica químicamente los ácidos nucleicos péptidos

Se presenta un protocolo para perfiles metabólicos de muestras biológicas mediante electroforesis capilar de espectrometría de masas utilizando un diseño de interfaz de punta porosa sheathless.

Sheathless electroforesis capilar-espectrometría de masas de perfiles metabólicos de muestras biológicas

Este artículo describe un protocolo simple y rápido para evaluar el estado oligomérico de la proteína GTPasa MxA similar a la dinamina a partir de lisados de células humanas utilizando una combinación de PAGE no desnaturalizante con análisis de Western blot.

Caracterización de complejos de proteínas de múltiples subunidades de MxA humano Usando no desnaturalizante en gel de poliacrilamida-electroforesis

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

Aprenda electroforesis en gel horizontal nativo para analizar interacciones ARN-proteína con monitoreo en tiempo real. Este método permite estudiar 48 muestras simultáneamente y examinar la formación de complejos durante el proceso.

Electroforesis en gel horizontal para la detección mejorada de los complejos proteína-ARN

Explorar más videos