Trasplante de células de germen primordiales para basada en CRISPR/Cas9 Leapfrogging en Xenopus

El objetivo general del método leapfrogging es facilitar la creación de líneas mutantes para genes esenciales en la embriogénesis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en Genética del Desarrollo y otros campos. La ventaja principal de esta técnica es que se pueden obtener mutantes en genes esenciales en la generación F1.

Para comenzar este procedimiento, microinyecte complejos de Cas9-sgRNA en embriones de Xenopus en el estadio de una célula, tal como se describe en el protocolo escrito. Cuando los embriones alcancen las 4,5 horas posteriores a la fertilización, en el estadio de blástula temprana nueve, retírelos del incubador a 25 grados Celsius para permitir que continúen su desarrollo a temperatura ambiente. Para iniciar el trasplante a las cinco horas posteriores a la fertilización, utilice una pipeta de Pasteur para transferir un embrión no inyectado a un platillo de agarosa de 60 milímetros que contenga depresiones, el cual servirá como receptor del injerto.

Transfiera también un embrión donante PGC al platillo. Utilice pinzas para eliminar manualmente las envolturas vitelinas de cada embrión. Gire ambos embriones de modo que sus polos vegetales queden visibles y accesibles para la cirugía.

A continuación, mientras se estabiliza el embrión receptor con el lazo de cabello, inserte la punta afilada de un bisturí de pelo de ceja en el polo vegetal, justo debajo de la superficie. Y con movimientos rápidos de corte ascendentes, realice cuatro incisiones superficiales con forma de cuadrado, dentro de la zona donde se formarán las futuras células en botella que marcan el blastoporo. Una vez delineados los cuatro lados del cuadrado, utilice el bisturí de pelo de ceja para profundizar cada incisión usando movimientos de corte similares hasta una profundidad aproximada de 1/3 a 1/2 de la distancia hasta el piso del blastocele.

Liberar el explante de tejido vegetal del embrión receptor realizando uno o varios cortes horizontales en la región vegetal profunda. Luego, trabajando rápidamente, repetir este procedimiento en el embrión donante de CPG para crear un fragmento de tejido vegetal de tamaño similar para trasplante. Una vez que el tejido que contiene las CPG se ha extraído del embrión donante, utilizar el bisturí de pelo de ceja y el lazo de pelo para colocar el explante en la abertura creada en el embrión receptor.

Utilice el vástago del cuchillo para pelo de ceja, sostenido paralelo a la superficie del injerto, para presionar suavemente el injerto dentro de la abertura en la superficie vegetal del embrión receptor. Use el lazo de pelo para deslizar suavemente el cadáver del embrión donante sobre la superficie de agarosa y hacia un pocillo. Asegúrese de que la herida abierta del cadáver esté orientada hacia el líquido principal.

Deslice el embrión receptor hacia un pocillo adyacente y, de manera similar, asegúrese de que el tejido del polo vegetal injertado esté orientado hacia el volumen principal del líquido. Repita el trasplante de células germinales primordiales en embrios adicionales para crear más pares de cadáveres trasplantados, hasta que los embriones alcancen aproximadamente la etapa 10 de gastrulación temprana, transfiriendo los embriones a pocillos vacíos a medida que se realizan los trasplantes. Una vez que los injertos se hayan cicatrizado en su lugar, típicamente entre 30 y 45 minutos después del trasplante, utilice una pipeta de Pasteur para transferir muy suavemente los embriones desde las depresiones a pocillos individuales en una placa de 24 pocillos recubierta con agarosa.

Gire los embriones para que queden posicionados con el polo vegetal hacia arriba, enfrentado a la solución bulk. Coloque los cadáveres donantes y los receptores del injerto en pozos adyacentes para ayudar a llevar un registro de los pares de embriones y anote esta información. Luego, transfiera la placa de 24 pozos que contiene los embriones a un incubador a 25 grados Celsius durante la noche.

Al día siguiente, traslade cada receptor del injerto, que ahora se encuentra en la etapa inicial de yema de cola, a un pocillo individual de una placa nueva de seis pocillos recubierta con agarosa. Eleve los embriones leapfrog y realice el análisis del ADN del donante obtenido de los cadáveres según el protocolo descrito en el texto. Dado que el salto genético produce animales con un reemplazo eficiente de su línea germinal por alelos mutantes, los fenotipos mutantes pueden obtenerse en la generación F1.

Como se presenta en esta tabla, Blitz et al. informaron que la mayoría de los animales F0, dirigidos al locus de la tirosinasa, que es necesario para la pigmentación de melanocitos y retina, muestran una transmisión germinativa del 100 % de los genomas mutantes derivados del donante, medida mediante cruzamientos externos con animales albinos tyr negativos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo trasplantar células germinales primordiales de Xenopus.