Name: Nitrógeno cavitación y centrifugación diferencial permite el monitoreo de la distribución periférica de proteínas de membrana en células cultivadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprende a homogeneizar células cultivadas mediante cavitación con nitrógeno y centrifugación diferencial para analizar la partición de proteínas periféricas de membrana sin detergentes. Este protocolo mejora la detección de proteínas endógenas.

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Este trabajo fue financiado por GM055279, CA116034 y CA163489.

1. buffer y preparaciones de equipo <ol><li>enfriar 45 mL celular interrupción bombas, tubos de 15 mL y tubos de ultracentrifugación a 4 ° C.</li>
	<li>Preparación y 25 mL de buffer de homogenización por 2 x 10 7 células a 4 ° C. agregar una proteasa inhibidor tableta antes de uso. 
	Nota: Reservas de homogeneización normalmente contienen KCl en vez de NaCl para mejor reflejar la composición sal intracelular. Buffer de homogeneización utilizado en este protocolo se compone de 10 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM KCl y 1,5 mM de MgCl 2 (en lo sucesivo como buffer de homogeneización hipotónica). Almacenadores intermediarios la mayoría pueden ser adaptados para la cavitación del nitrógeno (ver discusión).</li>
	<li>Preparación y 6 mL de 1 x de buffer de Phosphate-Buffered salina (PBS) por muestra a 4 ° C. agregar proteasa inhibidor tabletas frescas antes de su uso. 
	Nota: Tampón PBS utilizado en este protocolo consiste en Na 2 HPO 4 de 10 mm a pH 7.4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl y KCl de 2.7 mM.</li>
	<li>Preparación y 4 mL de tampón de solubilización por muestra a 4 ° C. agregar una proteasa inhibidor de la tableta antes de uso. 
	Nota: Tampón de solubilización utilizado en este protocolo es 1 Tampón de ensayo (RIPA) x Radioimmunoprecipitation, que consiste en 25 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, desoxicolato de sodio 0.5% y 1% NP-40. Véase la nota 4.6.</li>
</ol> 2. La cosecha de la célula medios de cultivo <ol><li>crece 2 x 10 7 -10 x 10 9 células de cultivo de tejidos con la recomendada para el tipo de célula. Por lo general, un plato de 15 cm rinde 2 x 10 7 células HEK-293 cultivadas en DMEM en confluencia de 90% ( figura 1).</li>
	<li>Quitar el medio de crecimiento por el vacío de.</li>
	<li>Para las células adherentes, coloque los platos de la cultura en hielo, lavar las células directamente en los platos de la cultura con buffer de homogeneización fría dos veces (10 mL de tampón por plato 15 cm por lavado) y cosechar las células con una espátula grande de la célula en un volumen adecuado de buffer de homogeneización; Para las células de suspensión, recolectar y lavar el precipitado de células en frío homogeneización buffer dos veces (10 mL de tampón por cultura de 50 mL por lavado) con giro de 500 x g a 4 ° C por 5 min y resuspender el precipitado de células lavadas en un volumen adecuado del buffer de homogeneización en el hielo. Nota: el volumen debe basarse en los requisitos para la concentración de proteína en los experimentos previstos, así como el mínimo/máximo volumen permitido en la bomba de disrupción celular. Una pauta general es 2-10 x 10 7 células/mL, o unos 10 volúmenes de la celda de pellets. Este protocolo está optimizado para tres platos de 15 cm de las células HEK-293 en 2 mL de buffer de homogenización.</li>
</ol> 3. Cavitación de nitrógeno <ol><li>traslado de la suspensión celular a una bomba limpia y enfriada en un baño de hielo en un revuelo placa. 
	Atención: La bomba tiene alta presión, baja temperatura, nitrógeno &#8211; Utilice protección personal adecuada .</li>
	<li>Colocar una barra de agitación magnética micro dentro de la bomba y encienda la placa de agitación para mantener la homogeneidad de la suspensión.</li>
	<li>Añadir una tableta de inhibidor de proteasa a la suspensión y cierre de la bomba por el fabricante &#39; instrucción s.</li>
	<li>Gradualmente presurice la bomba con un tanque de gas nitrógeno por fabricante &#39; instrucción de s hasta el medidor de presión de bomba Lee 300 a 600 psi. Todas las válvulas de cierre y desconecte el tanque de nitrógeno. 
	Nota: La presión requerida puede variar con el tipo de célula. Aquí realizamos cavitación a 350 a 400 psi para las células HEK-293, NIH-3T3 y Jurkat.</li>
	<li>Espere 20 minutos permitir que el nitrógeno a disolver y a alcanzar equilibrio dentro de las células.</li>
	<li>Eliminar exceso de agua alrededor de la válvula de descarga con una toalla. Abra la válvula de descarga suavemente para lograr una liberación gota a gota de homogeneizado y recoger en un tubo previamente enfriado 15 mL. 
	Nota: Cerca del final de la colección habrá un chorro de homogeneizado y gas saldrá con un silbido. Asegúrese de que el gas no causa recogieron cavitará para tirar del tubo (por lo tanto, la utilización de 15 mL tubos en lugar de tubos de 1,5 mL). Una vez que el chorro se inicia, cierre la válvula de descarga y abra la válvula de entrada de nitrógeno abruptamente para despresurizar la bomba y lograr la cavitación de las celdas restantes de la bomba. Abrir la bomba para cavitará recuperación y limpieza. 
	Nota: Cavitate final debe tener un aspecto lechoso con espuma en la parte superior. Revuelva suavemente con una pipeta para permitir que la espuma antes de centrifugación a. 
	Nota: Examine el cavitate por microscopia de contraste de fase para determinar la eficacia de la homogeneización. Añadir una gota de 15 μl de cavitará a la superficie de un portaobjetos de microscopía y cubrir con un cubreobjetos. Repita el paso 3.4-3.6 sólo si demasiadas células intactas se detectan con objetivo 20 X. 
	Nota: Si el buffer de homogeneización no contiene EDTA o EGTA, añadir a la recogida cavitará a una concentración final de 1 mM dentro de 5 minutos después de la descarga.</li>
</ol> 4. Separación de Cytosolic y fracciones de la membrana <ol><li>centrífuga cavitate a 500 x g por 10 min a 4 ° C para eliminar las células intactas y núcleos. 
	Nota: Repita el paso de centrifugación hasta no pellet visible se produce y recoge el Post Nuclear flotante (PNS) evitando la espuma flotante en la parte superior. Volver a centrifugar la espuma para recoger y combinar PNS, si es necesario ( figura 1).</li>
	<li>Proceso de PNS como desee para obtener fracciones de interés. Con el fin de separar citosólica y fracciones de la membrana, el PNS la transferencia a un tubo de ultracentrífuga y realizar ultracentrifugación como desee. Este protocolo está optimizado para una &#60; 3,5 mL de muestra en un tubo de ultracentrífuga de policarbonato y de ultracentrifugación a 350.000 x g durante 1 h a 4 ° C.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante (fracción S) usando una pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Cuidadosamente Lave el precipitado con 3 mL de PBS frío sin perturbarla. Retirar el PBS por el vacío de. 
	Nota: Si la contaminación de la fracción de membrana por las proteínas citosólicas es una preocupación mayor que la pérdida de muestra, Resuspender el precipitado en 3 mL de PBS y re-ultracentrífuga como en el paso 4.2. Retirar el PBS por el vacío de.</li>
	<li>Resuspender el precipitado totalmente en un volumen adecuado de tampón de solubilización que contiene detergente de preferencia. Para lograr la equivalencia de celda, usar el mismo volumen de tampón de solubilización como la fracción citosólica. 
	Nota: Se sugiere utilizar 1 x RIPA buffer como tampón de solubilización para la extracción de proteínas de membrana eficiente. Si no análisis aguas abajo es necesario para la fracción de membrana, usar 1 x laemmli solución tampón de muestra para la extracción de proteínas de membrana máxima. 
	Nota: Le sugerimos desalojando y transferir el precipitado en tampón de solubilización a un tubo limpio en un rotador de tubo a 4 ° C para la extracción de proteínas de membrana máxima. 
	Nota: Si el pellet es demasiado pegajosos (demasiados lípidos) ser eliminado eficientemente de thtubo de ultracentrífuga e en tampón de solubilización, se aconseja ajustar la pelotilla de la congelación en nitrógeno líquido y rápidamente removiendo el sedimento del tubo de ultracentrífuga con una espátula de metal mini antes de la pelotilla deshiela. 
	Nota: Alternativamente, pelotillas de la membrana pueden ser sólo serán suspendidas y no solubilizados en un búfer que contiene detergente no para producir una fracción P de la suspensión de la vesícula de membrana, en cuyo caso la centrifugación paso 4.6 no es necesario. Esas fracciones de P son útiles al investigar funciones tales como actividades enzimáticas dependientes de la Asociación de la membrana.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión de pellets completamente solubilizado de paso 4.5 a 20.000 x g en una centrífuga de mesa durante 10 min a 4 º C. recoger el sobrenadante con una pipeta de 1 mL (la fracción de P) y descartar el precipitado (lípidos insolubles).</li>
	<li>Realizar ensayos deseados como el borrar occidental con las fracciones citosólicas o membrana, o salvar a-80 ° C para su uso futuro.</li>
</ol>

<ol><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+on+the+move%3A+insights+gained+from+fluorescent+protein+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).</li>
<li>Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+commercial+extraction+kits+for+subsequent+membrane+protein+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling.</a> Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+cultured+cells+by+nitrogen+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).</li>
<li>Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+plasma+membranes.+I.+High-yield+purification+of+human+neutrophil+plasma+membrane+vesicles+by+nitrogen+cavitation+and+differential+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation.</a> J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).</li>
<li>Philips, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+molecular+weight+GTP-binding+proteins+in+human+neutrophil+granule+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).</li>
<li>Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phospholipides+of+Ehrlich+ascites+carcinoma+cells%3A+composition+and+intracellular+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution.</a> Cancer Res. 20, 397-402 (1960).</li>
<li>Hunter, M. J., Commerford, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+homogenization+of+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Pressure homogenization of mammalian tissues.</a> Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).</li>
<li>Wallach, D. F., Kamat, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+Cytoplasmic+Membrane+Fragments+from+Ehrlich+Ascites+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).</li>
<li>Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).</li>
<li>Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+5-lipoxygenase+to+the+nucleus+of+unstimulated+rat+basophilic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells.</a> J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).</li>
<li>Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+liver+and+muscle+polyribosomes+in+high+yield+after+cell+disruption+by+nitrogen+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation.</a> FEBS Letters. 2 (1), (1968).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+prenylcysteine+carboxyl+methyltransferase+is+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum.</a> J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).</li>
<li>Wynne, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1-interacting+adapter+molecule+%28RIAM%29+associates+with+the+plasma+membrane+via+a+proximity+detector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector.</a> J Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS35+binds+farnesylated+N-Ras+in+the+cytosol+to+regulate+N-Ras+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking.</a> J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).</li>
<li>Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+possess+and+require+an+active+protein+palmitoylation+pathway+for+agonist-mediated+activation+and+in+vivo+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).</li>
<li>Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxidized+peroxiredoxin+2+interacts+with+the+protein+disulfide-+isomerase+ERp46%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46.</a> Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).</li>
<li>Annis, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+localized+Bcl-2+prevents+apoptosis+when+redistribution+of+cytochrome+c+is+a+late+event%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event.</a> Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).</li>
<li>Berkowitz, S. A., Wolff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+calcium+sensitivity+of+tubulin+polymerization.+The+contributions+of+temperature%2C+tubulin+concentration%2C+and+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins.</a> J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Son múltiples las ventajas de la cavitación de nitrógeno sobre otros métodos de alteración mecánica. Quizás el beneficio más significativo es su capacidad para suavemente y eficientemente homogeneizar a muestras. Los principios físicos de descompresión enfría muestras en lugar de generar daño de calentamiento local como ultrasonidos y fricción/cizallamiento basado en técnicas. La cavitación también es extremadamente eficaz en alterar la membrana plasmática. Porque el nitrógeno de las burbujas se generan dentro de cada cé...

Proteínas celulares se pueden dividir en dos clases: los que están asociados a membranas y aquellos que no son. No-membrana las proteínas asociadas se encuentran en el citosol, nucleoplasia y lumina de orgánulos como el retículo endoplásmico (ER). Hay dos clases de proteínas asociadas a membrana, integrales y periféricas. Proteínas integrales de membrana también son conocidas como proteínas transmembranales porque uno o más segmentos de la cadena polipeptídica atraviesa la membrana, por lo general como una α-hélice compuesta de aminoácidos hidrofóbicos. Proteínas transmembranales co-translationally se insertan en las membranas en el curso de su biosíntesis y permanecerán así configuradas hasta que catabolizan. Proteínas de la membrana periférica secundario son conducidas a las membranas, generalmente como consecuencia de la modificación poste-de translación con moléculas hidrofóbicas como los lípidos. En contraste con las proteínas de membrana integral, la Asociación de las proteínas periféricas de membrana con las membranas celulares es reversible y puede ser regulada. Muchos periférica de membrana proteínas función en vías de señalización y asociación regulada con membranas es uno de los mecanismos de activación o inhibición de una vía. Un ejemplo de una molécula de señalización que es una proteína periférica de membrana es la pequeña GTPasa, RAS. Después de una serie de modificaciones post-traduccionales que incluyen modificación con un lípido farnesil, el c-término modificado de una proteína madura de RAS inserta en el folleto de citoplásmico de la membrana celular. En concreto, la membrana plasmática es donde el RAS se dedica a su efector downstream RAF1. Para evitar la activación constitutiva de vía de mitógeno-activada proteína quinasa (MAPK), varios niveles de control de RAS están en lugar. Además de renderización RAS inactivo por hidrolizando GTP en PIB, RAS activa también se puede lanzar desde la membrana plasmática por modificaciones o interacciones con factores para inhibir la señalización de solubilización. Aunque la proyección de imagen vivo fluorescente ofrece a biólogos de célula la oportunidad de observar la localización subcelular de fluorescente etiquetado proteína periférica de membrana proteínas1, existe una necesidad crítica para evaluar la Asociación de la membrana de proteínas endógenas semi-cuantitativamente con enfoques bioquímicos simples.
La evaluación bioquímica adecuada de proteína repartir entre fracciones solubles y de membrana es críticamente dependiente de dos factores: celular homogeneización y eficiente separación de fracciones solubles y de membrana. Aunque algunos de los protocolos, incluyendo los kits comercializados más utilizados, dependen de homogeneización de la célula base de detergente, estos métodos pueden confundir análisis mediante la extracción de proteínas de la membrana en la fase soluble2. Por consiguiente, no detergente mecánicos, basado en métodos de disrupción celular proporcionan resultados limpiador. Existen varios métodos de interrupción mecánica de células cultivadas en cultivo o cosecha de sangre o de órganos. Estos incluyen Dounce homogeneización, interrupción de fina de la aguja, rodamientos de bolas homogeneización, sonicación y cavitación de nitrógeno. Aquí evaluamos cavitación de nitrógeno y se compara con otros métodos. Cavitación de nitrógeno depende del nitrógeno que está disuelto en el citoplasma de las células bajo alta presión. Después de equilibrar, la suspensión de células se expone bruscamente a la presión atmosférica que burbujas de nitrógeno se forman en el citoplasma que rasgar abierto la célula como consecuencia de su efervescencia. Si la presión es suficientemente alta, efervescencia de nitrógeno puede perturbar el núcleo3 y membrana destino organelos como lisosomas4. Sin embargo, si la presión se mantiene lo suficientemente baja, la descompresión alteran la membrana plasmática y ER pero no otros organelos, derramando así citosol y orgánulos citoplásmicos intactos en el homogeneizado que se señala el cavitate5. Por esta razón, la cavitación de nitrógeno es el método de elección para aislar organelos como lisosomas y mitocondrias.
Sin embargo, también es una excelente manera de preparar un homogeneizado que puede ser fácilmente separado en fracciones solubles y de membrana. El recipiente del reactor (de aquí en adelante llamado "la bomba") usado durante la cavitación consiste en una carcasa de acero inoxidable grueso que soporta alta presión, con una entrada para la entrega del gas nitrógeno desde un tanque y un puerto de salida con una válvula de descarga ajustable.
Cavitación de nitrógeno se ha utilizado para la homogeneización de la célula desde la década de 19606. En 1961, cazador y Commerfold7 estableció cavitación de nitrógeno como una opción viable para la interrupción de tejidos de mamíferos. Desde entonces, los investigadores han adaptado la técnica a diferentes células y tejidos con éxito y cavitación de nitrógeno se ha convertido en una grapa en múltiples aplicaciones, incluyendo membrana preparación8,9, núcleos y organelas preparación10,11y extracción bioquímica lábil. En la actualidad, biólogos de la célula más a menudo emplean otros métodos de homogeneización de la célula porque las ventajas de la homogeneización de nitrógeno no han sido ampliamente anunciadas, bombas de nitrógeno son caras y hay una idea errónea de que un número relativamente grande de células es Obligatorio. No se han publicado protocolos para la cavitación de nitrógeno alcanzar homogenados sin células con núcleos intactos, y en evaluaciones más publicadas se utilizaron volúmenes de 20 mL de la suspensión celular. Para adaptar esta técnica clásica para los requerimientos actuales de trabajar con muestras pequeñas, presentamos un protocolo modificado de cavitación de nitrógeno diseñado específicamente para las células cultivadas. Después de la cavitación del nitrógeno, el homogenado se separa en fracciones de membrana (P) y soluble (S) por centrifugación diferencial, primero con un exprimido a velocidad baja para extraer los núcleos y células intactas y luego con un exprimido a alta velocidad (&#62; 100.000 x g) para separar membranas de la fracción soluble. Analizar la eficiencia de la separación con los immunoblots y comparar cavitación de nitrógeno con otras técnicas de interrupción mecánica. También investigamos el efecto osmótico de buffer de homogenización durante la cavitación de nitrógeno.

<table><tbody><tr><td>Recipiente de disrupción celular (45 mL)</td><td>Parr Instrument</td><td>4639</td><td>Bomba de cavitación de nitrógeno</td></tr><tr><td>Homogeneizador Dounce (2 mL)</td><td>Kontes</td><td>885300-0002</td><td>Mortero y tubo Dounce</td></tr><tr><td>Jeringa de insulina U-100 28G&frac12;</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td>Needle Anticuerpo</td></tr><tr><td>Atg12</td><td>Santa Cruz</td><td>271688</td><td>Anticuerpo de ratón, uso con dilución 1:1000</td></tr><tr><td>&beta;-anticuerpo de actina</td><td>Santa Cruz</td><td>47778</td><td>Anticuerpo de ratón, uso con dilución 1:1000</td></tr><tr><td>&beta;-anticuerpo de tubulina</td><td>DSHB</td><td>E7-s</td><td>Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:5000</td></tr><tr><td>Anticuerpo de calnexina</td><td>Santa Cruz</td><td>23954</td><td>Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo contra la calregulina</td><td>373863 Santa Cruz</td><td></td><td>Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo contra la catalasa</td><td>271803 de Santa Cruz</td><td></td><td>Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo CIMPR</td><td>Abcam</td><td>124767</td><td>Anticuerpo de conejo, uso con una dilución de 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo EEA1</td><td>Santa Cruz</td><td>137130</td><td>Anticuerpo de ratón, uso con dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo EGFR</td><td>Santa Cruz</td><td>373746</td><td>Anticuerpo de ratón, uso con dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo F0-ATPasa</td><td>Santa Cruz</td><td>514419</td><td>Anticuerpo anticuerpo de ratón, uso con dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo F1-ATPasa</td><td>Santa Cruz</td><td>55597</td><td>Anticuerpo de ratón, uso con dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo</td> <td>fibrilarinaSanta Cruz</td><td>374022</td><td>Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo contra Golgin 97</td><td>Anticuerpo de ratón Santa Cruz</td><td>59820</td>, <td>uso con dilución de 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo HDAC1</td><td>Santa Cruz</td><td>81598</td><td>Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo contra la hexoquinasa 1</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>2024S</td><td>Anticuerpo de conejo, uso con dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo</td> <td>Lamin A/CSanta Cruz</td><td>376248</td><td>Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo LAMP1</td><td>DSHB</td><td>H4A3-c</td><td>Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:1000</td></tr><tr><td>Na+/K+ Anticuerpo ATPasa</td><td>Santa Cruz</td><td>48345</td><td>Anticuerpo de ratón, uso con dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo Rab7</td><td>Abcam</td><td>137029</td><td>Anticuerpo de conejo, uso con una dilución de 1:1000</td></tr><tr><td>Rab9 anticuerpo</td><td>Thermo</td><td>MA3-067</td><td>Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo RCAS1</td><td>398052 Santa Cruz</td><td></td><td>Anticuerpo de ratón, uso con dilución de 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo RhoGDI</td><td>Santa Cruz</td><td>360</td><td>Anticuerpo de conejo, uso con una dilución de 1:3000</td></tr><tr><td>Anticuerpo S6 de proteína ribosómica</td><td>Santa Cruz</td><td>74459</td><td>Anticuerpo de ratón, uso con dilución de 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo Sec61a</td><td>Santa Cruz</td><td>12322</td><td>Anticuerpo de cabra, uso en dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Tubo de ultracentrífuga de policarbonato de pared gruesa</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td>Tubo de muestra para ultracentrifugación</td></tr><tr><td>Rotor TLK-100.3</td><td>Rotor Beckman Coulter</td><td>349481</td><td>para ultracentrifugación</td></tr><tr><td>Optima MAX Ultracentrífuga personal de alta capacidad</td><td>Ultracentrífuga</td> <td>Beckman Coulter</td><td>364300</td></tr><tr><td>cOmplete inhibidor de la proteasa comprimidos cóctel Roche</td><td></td><td>11697498001</td><td>inhibidores de la proteasa</td></tr><tr><td>Raspadores celulares con mango de 25 cm y cuchilla de 3,0 cm</td><td>Corning</td><td>353089</td><td>raspador de células grandes</td></tr><tr><td>Barra de agitación magnética</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-57SIX</td><td>micro barra de agitación</td></tr><tr><td>Agitador magnético de cerámica</td><td>Fisher Scientific</td><td>S504501AS</td><td></td></tr></tbody></table>

nitrógeno cavitación y centrifugación diferencial permite el monitoreo de la distribución periférica de proteínas de membrana en células cultivadas

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Las células cultivadas son útiles para estudiar la distribución subcelular de proteínas, incluyendo proteínas de membrana periférica. Codificada genéticamente fluorescente etiquetadas proteínas han revolucionado el estudio de la distribución subcelular de la proteína. Sin embargo, es difícil cuantificar la distribución con microscopia fluorescente, especialmente cuando las proteínas son parcialmente citosólicas. Por otra parte, a menudo es importante para el estudio de proteínas endógenas. Bioquímicos de ensayos como immunoblots siguen siendo el estándar de oro para la cuantificación de la distribución de la proteína después de fraccionamiento subcelular. Aunque existen kits comerciales que tienen como objetivo aislar citosólica o ciertas fracciones de la membrana, la mayoría de estos kits se basa en la extracción con detergentes, que puede ser inadecuado para el estudio de proteínas de membrana periférica que se extraen fácilmente las membranas. Aquí presentamos un protocolo libre de detergente para celular homogeneización por nitrógeno cavitación y posterior separación de las proteínas citosólicas y membrana-limitan por ultracentrifugación. Confirman la separación de orgánulos subcelulares en soluble y fracciones de pellets a través de diferentes tipos de células y comparar la extracción de proteínas entre varios métodos de homogeneización mecánica no-base de detergente común. Entre varias ventajas de nitrógeno la cavitación es la superior eficacia de disrupción celular con daño mínimo de físico y químico delicada organelos. Combinado con ultracentrifugación, nitrógeno la cavitación es un método excelente para examinar el cambio de las proteínas periféricas de membrana entre citosólica y fracciones de la membrana.

La figura 2 muestra la partición de proteínas celulares del PNS en la fracción citosólica soluble (S) o fracción de la pelotilla de membrana (P). Examinamos tres líneas de células representativas de diferentes tipos de células: HEK-293 (epiteliales), NIH-3T3 (fibroblastos) y Jurkat (linfocito). Inhibidores de disociación de guanina de Rho (RhoGDI) y receptor de manosa-6-fosfato catión independiente (CIMPR) fueron utilizados como controles positivos para citos...

Aquí presentamos los protocolos para la homogeneización de detergente libre de células de mamíferos cultivadas basado en nitrógeno cavitación y posterior separación de las proteínas citosólicas y membrana-limitan por ultracentrifugación. Este método es ideal para el monitoreo de la partición de proteínas periféricas de membrana entre soluble y fracciones de la membrana.

Nitrógeno cavitación y centrifugación diferencial permite el monitoreo de la distribución periférica de proteínas de membrana en células cultivadas

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

El objetivo general de este procedimiento experimental es homogeneizar de manera óptima células cultivadas y analizar la distribución de las proteínas celulares entre las fracciones membranales y solubles. Este método puede ayudar a abordar uno de los desafíos clave en biología celular, es decir, la compartimentalización subcelular de proteínas periféricas de membrana. La principal ventaja de esta técnica es que puede detectar de forma reproducible la distribución de proteínas endógenas entre fracciones sólidas y membranales, con gran precisión y sin el uso de detergentes.Para comenzar, cultive células HGK293 al 90 % de confluencia, de modo que el rendimiento por un plato de 15 centímetros sea aproximadamente 2 x 10⁷ células cuando se cultiven en DMEM a 37 °C con 5 % de dióxido de carbono. A continuación, aspire el medio de crecimiento mediante vacío. Luego, coloque los platos de cultivo sobre hielo y lave suavemente las células dos veces en los platos de cultivo con 10 mililitros de tampón de homogenización frío por plato.Después del lavado, use un raspador celular grande para recolectar las células, utilizando un volumen apropiado de tampón de homogenización. A continuación, tran

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Bioquímica

Este video demuestra la acción capilar radial diferencial del ensayo de ligandos, una técnica para el cribado sistemático de alto rendimiento de proteínas de unión a segundo mensajero de nucleótidos intracelulares. Esta técnica permite la unión directa de los mensajeros a la proteína diana sobreexpresada en el lisado celular, evitando la necesidad de purificación de la proteína.

Acción capilar radial diferencial del ensayo de ligando: una técnica de alto rendimiento para identificar proteínas intracelulares de unión a segundo mensajero de nucleótidos bacterianos

Aquí se describe un método robusto para el fraccionamiento de las membranas de plasma de plantas en las membranas solubles resistentes y detergentes detergente a base de una mezcla de no marcado e in vivo completamente 15 N cultivos de células de Arabidopsis thaliana etiquetados. El procedimiento se aplica para los estudios proteómicos comparativos para entender los procesos de señalización.

Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensión celular

Aquí, se desarrolla un novedoso ensayo de fluorescencia cuantitativa para medir los cambios en el nivel de una proteína, específicamente en los centrosomas, normalizando la intensidad de fluorescencia de esa proteína a la de un estándar interno apropiado.

Cuantitativa inmunofluorescencia Ensayo para medir la variación en los niveles de proteína en centrosomas

Aquí, presentamos un protocolo para aislar la membrana plasmática, citoplasma y mitocondrias de las células U937 sin el uso de la centrifugación de alta velocidad. Esta técnica se puede utilizar para purificar fracciones subcelulares para la examinación subsecuente de la localización de la proteína mediante immunoblotting.

Fraccionamiento de la célula de las células U937 en ausencia de centrifugación de alta velocidad

Este artículo presenta métodos para generar, purificar y cuantificar vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans.

Purificación y análisis de las vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans

Aquí se presenta un protocolo para la determinación del estado oligomérico de las proteínas de membrana que utiliza un sistema de nanopartículas de membrana celular nativa junto con microscopía electrónica.

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análisis de interacción proteína-proteína de membrana

Este protocolo de fraccionamiento permitirá a los investigadores aislar proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriales y de membrana de células de mamíferos. Las dos últimas fracciones subcelulares se purifican aún más a través del gradiente de densidad isopícnica.

Fraccionamiento celular de células U937 por purificación de gradiente de densidad isopícnica

Este protocolo describe la configuración de un biorreactor de RMN para mantener viables las células humanas encapsuladas durante un máximo de 72 h, seguido de la adquisición y el análisis de datos de RMN en las células resueltos en el tiempo. La metodología se aplica para monitorizar las interacciones proteína-ligando intracelular en tiempo real.

Monitoreo de las interacciones proteína-ligando en células humanas mediante RMN cuantitativa en células en tiempo real utilizando un biorreactor de alta densidad celular

Este artículo describe los protocolos para la preparación de muestras, la reducción de datos y el análisis de datos en estudios de eco de espín de neutrones (NSE) de membranas lipídicas. El etiquetado juicioso de los lípidos con deuterio permite el acceso a diferentes dinámicas de membrana en escalas de longitud y tiempo mesoscópicas, sobre las cuales ocurren procesos biológicos vitales.

Espectroscopía de eco de espín de neutrones como una sonda única para la dinámica de la membrana lipídica y las interacciones membrana-proteína

Este artículo describe un método para evaluar las interacciones y ensamblajes de proteínas integrales de membrana in vitro con varios factores asociados en un entorno proximal de lípidos.

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal In Vitro

Aprende a homogeneizar células cultivadas mediante cavitación con nitrógeno y centrifugación diferencial para analizar la partición de proteínas periféricas de membrana sin detergentes. Este protocolo mejora la detección de proteínas endógenas.

Nitrógeno cavitación y centrifugación diferencial permite el monitoreo de la distribución periférica de proteínas de membrana en células cultivadas (Video) | JoVE Journal

Nitrógeno cavitación y centrifugación diferencial permite el monitoreo de la distribución periférica de proteínas de membrana en células cultivadas

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