Utilizan en Vivo y tejido y célula explante enfoques para el estudio de la morfogénesis y la patogenesia de la Aorta embrionaria y Perinatal

El objetivo general de estos procedimientos es estudiar la formación de las paredes aórticas embrionarias y perinatales durante el desarrollo normal, así como las perturbaciones en este proceso durante la enfermedad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo vascular, como por ejemplo, cuál es la fuente de las células que contribuyen al medio vascular embrionario y perinatal. La principal ventaja de estas técnicas es que permiten evaluar la patogenia y morfogénesis del músculo liso que se producen durante las etapas embrionarias y perinatales del desarrollo.

La implicación de estas técnicas se deriva hacia la terapia de enfermedades vasculares como la estenosis aórtica supravalvular de enfermedad periódica que provoca una producción excesiva de células de sumo. El procedimiento de colocación de la mini bomba será realizado por el Dr. Jiasheng Zhang, un científico investigador que dirige un núcleo de microcirugía y la Universidad de Yale. Comience por establecer parejas de apareamiento entre ratones de dos a seis meses de edad con Cre ER y ratones con un reportero de Cre.

Con una sonda de metal, revise si hay tapones vaginales todas las mañanas, separando a la hembra del macho cuando se detecte un tapón. Para la inducción embrionaria temprana, inyecte tamoxifeno por vía intraperitoneal en la humedad de la embarazada. Para marcar las células en el período gestacional medio y tardío y rastrear su destino o clonalidad en el ratón postnatal, inyecte progesterona en la cavidad intraperitoneal de la embarazada húmeda incompetentemente con tamoxifeno en una proporción de dosis de uno a dos.

Para recolectar los embriones en la fecha embrionaria adecuada, limpie el abdomen de la embarazada húmedo con etanol al 70% y use tijeras para abrir el abdomen y extraer el útero. Recoja los embriones del útero con fórceps y un microscopio estereoscópico para separarlos cuidadosamente de la placenta y el saco vitelino. Fijar los embriones en paraformaldehído al 4% a cuatro grados centígrados durante dos horas.

Seguido de tres lavados en PBS para eliminar el exceso de fijador. Después del tercer lavado, incubar los embriones en sacarosa al 30% en PBS, en tubos individuales de 15 mililitros hasta que los embriones se hundan. A continuación, llene los moldes de congelación de plástico con un compuesto de temperatura de corte óptima hasta dos tercios del volumen máximo y coloque un embrión verticalmente en cada molde.

Después de 10 minutos a temperatura ambiente, congele los tejidos en posición vertical en un baño de hielo seco con etanol al 70% y ajuste la temperatura del criostato a 22 grados centígrados. Seccione los bloques de tejido para generar cortes de tejido transversal de 10 a 20 micrómetros de espesor a través de la totalidad de cada aorta, capturando cada sección en un portaobjetos de microscopio de vidrio a medida que se obtienen. Cuando se hayan adquirido todas las muestras, seque los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de almacenarlos a 80 grados centígrados.

Para teñir las muestras de tejido, descongele los portaobjetos a temperatura ambiente, protéjalos de la luz para evitar el blanqueo con fluoróforos y lave los portaobjetos con PBS twin 20 al 0,1%. Para el análisis clonal, tiña los tejidos con un tinte nuclear apropiado y toma imágenes directamente de los otros fluróforos del reportero de cre arco iris en un microscopio fluorescente. Para el mapeo del destino, con el reportero mTmG cre, visualice la expresión de GFP mediante imágenes directas con o sin inmunotinción.

Para cultivar y explantar una aorta embrionaria, coloque el embrión en posición supina y asegure las extremidades extendidas a una tabla de disección bajo un microscopio estereoscópico. Con unas tijeras, haga una incisión vertical desde el abdomen a través del esternón hasta la parte superior del tórax. Disecciona los pulmones traqueales, el esófago, el hígado y el intestino más finos.

Use fórceps para tirar suavemente del corazón ventralmente, usando tijeras para diseccionar la aorta lejos de la cara dorsal de las cavidades torácica y abdominal. Cortar la aorta en la raíz proximal y en las posiciones abdominales distales para liberarla y colocar la aorta extraída en PBS estéril y frío con hielo en una campana de cultivo celular. Después de un breve lavado, transfiera la aorta a un pocillo de una placa de 24 pocillos, que contenga medio DMEM suplementado con 0,5% de PBS y coloque la placa en una incubadora de cultivo celular durante un máximo de 24 horas.

Al final de la incubación, lavar la aorta dos veces con PBS y fijar el tejido en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos. Después de tres lavados más de PBS, transfiera la aorta a un tubo de 1,5 mililitros que contenga un 30% de sucrosina PBS hasta que el tejido se hunda. Para el aislamiento de células de músculo liso de la aorta perinatal, use una aguja de calibre 23 para perforar el ventrículo izquierdo de un ratón de día posnatal 0.5 y use un tubo de plástico para conectar la aguja a una jeringa estéril que contiene PBS, sostenida verticalmente en una posición elevada, de modo que el PBS fluya hacia el ventrículo izquierdo por gravedad.

Cuando el hígado se blanquee, use fórceps para extraer el tejido adventicio en el exterior de la aorta y extraiga la aorta como se acaba de demostrar. Disociar el tejido aórtico en 500 microlitros de solución de digestión con agitación manual cada cinco a 10 minutos. Después de 45 minutos, transfiera el tubo a una campana de cultivo celular estéril y use una pipeta de 200 microlitros para triturar la suspensión de tejido hasta obtener una suspensión de una sola célula.

Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros y luego, agregue dos mililitros de DMEM y recoja las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en tres mililitros de medio de cultivo de células de músculo liso y siembre las células en una placa de cultivo de 35 milímetros. Luego, coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados, refrescando el medio de cultivo celular cada tres días.

Para colocar una mini bomba osmótica subcutánea, comience por afeitar la parte inferior de la espalda de un ratón anestesiado con maquinillas y coloque el ratón en posición prona sobre una placa quirúrgica calentada. Frote la espalda con betadine y alcohol isopropílico y coloque al ratón bajo un microscopio estereoscópico. Luego, use un bisturí para hacer una incisión horizontal en la piel de 0,5 a un centímetro aproximadamente de tres a cinco centímetros rostral hasta la base de la cola, sin lesionar el músculo subyacente.

Inserte un hemostático en la incisión y abra y cierre los maxilares del hemostático para crear una bolsa subcutánea. Inserte una minibomba osmótica llena del agente de interés en el bolsillo y use 6 o suturas no absorbibles para cerrar la incisión. Luego, permita que el ratón se recupere con monitoreo hasta el logro de la decúbito esternal.

Los embriones mutantes para el gen que codifica la proteína de la matriz extracelular, la elastina, acumulan un exceso de células musculares lisas en las capas internas de la aorta, a partir del día embrionario 15.5. El análisis clonal de las células del músculo liso con el reportero de cre multicolor durante este proceso, indica que las células son de múltiples colores y, por lo tanto, son policlonales. La inmunotinción de secciones de aorta explantadas revela que las aortas embrionarias mutantes de elastina del día 15,5 se vuelven hipermusculares y esnódicas dentro de las 18 horas posteriores al cultivo, un proceso que se atenúa con la adición de un anticuerpo bloqueante anti antegrina beta tres.

Células musculares lisas aisladas de la aorta de ratones de tipo salvaje que después del día natal 0,5 expresan marcadores de células musculares lisas, pero no CD31. La infusión continua de un inhibidor de la integrina beta tres en embarazadas a partir del día embrionario 13.5, atenúa significativamente la estenosis aórtica y la hipermuscularización en ratones mutantes para la proteína de la matriz extracelular, elastina. Pero no altere las aortas de los ratones de tipo salvaje.

Una vez dominada, la técnica de colocación de la minibomba osmótica puede completarse en menos de 10 minutos si se realiza correctamente. Siguiendo estos procedimientos, estos enfoques también se pueden extrapolar para estudiar el músculo liso codificado, no vascular, como el tejido del tracto gastrointestinal o las áreas pulmonares. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar el mapeo de ajuste embrionario in vivo y el análisis clonal, el cultivo de aortas embrionarias explantadas, células de músculo liso aórtico perinatal y minibombas osmóticas subcutáneas explantadas.

No olvide que trabajar con ratones, tamoxifeno y un reductor fijo puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y una bata de laboratorio y tener especial cuidado al realizar estos procedimientos.