Name: Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprende a realizar imágenes en vivo de la fusión del paladar secundario en ratón mediante microscopía confocal. Este protocolo permite observar directamente los procesos celulares durante el desarrollo craneofacial en tiempo real.

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Damos las gracias al Sr. Douglas Benson para las conversaciones iniciales con respecto a la imagen secundaria del paladar. También reconocemos a David Castaneda-Castellanos (Leica) y Chris Rieken (Zeiss) por su ayuda para ajustar las condiciones de imagen en microscopía confocal. Agradecemos a Lynsey Hamilton (Bitplane) por sugerencias útiles para el análisis cuantitativo de imágenes usando el software Imaris. Este trabajo fue financiado por NIH / NIDCR R01 DE025887.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos de la Universidad de California en San Francisco Cuidado de Animales institucional y Comité de Uso. 1. Preparación de medios de imagen en vivo <ol><li> Preparación de medios de cultivo líquidos <ol><li> Añadir 20% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mu g / ml de estreptomicina, 200 mu g / ml de ácido L-ascórbico, 15 mM de HEPES a Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium medios de comunicación. NOTA: Los medios de imagen en vivo se han fabricado justo antes de la obtención de imágenes. Este medio contiene fenol-rojo que puede conducir a la fototoxicidad a lo largo de cursos de tiempo de imágenes en vivo. La sustitución de los medios sin rojo de fenol puede mejorar la imagen a largo plazo. </li></ol></li><li> Preparación de solución de agarosa de bajo punto de fusión <ol><li> Disolver 350 mg de agarosa de bajo punto de fusión en 10 ml de agua destilada en autoclave para obtener una solución madre al 3,5%. </li><li> Mezclar el pocillo de la solución de agarosa e incubar a 70 ° C en un baño de agua para disolver completamente la agarosa. </li><li> Enfriar la solución de agarosa en un baño de agua a 37 ° C antes de añadirlo a los medios de imagen en vivo. </li><li> Añadir 1 ml de la solución madre de agarosa a 5 ml del medio de formación de imágenes en vivo líquido para obtener una concentración final (0,6%). </li><li> Mantenga el medio con agarosa en un baño de agua a 37 ° C para evitar la solidificación prematura. </li></ol></li></ol> 2. Preparación del cultivo de explantes de paladar para imágenes en directo <ol><li> Disección de estanterías palatales secundarias E14.5 recientemente adheridas NOTA: En nuestra experiencia, la fusión de imágenes requiere comenzar con un par ligeramente adherido de estantes palatales; Esta adherencia evita movimientos de explante que evitan que se produzca fusión durante la formación de imágenes. <ol><li> Dissect E14.5 embriones etapa en 1 x salino fosfato-tamponado (PBS) y elegir la proteína fluorescente verde (GFP) -expresando (deK14 - cre; ROSA26-mTmG flox ) o (proteína fluorescente roja) que expresan RFP (de Lifeact-mRFPruby ) embriones positivos utilizando un microscopio de disección equipado con lámparas fluorescentes. Transferir el tejido a medios de cultivo de imagen viva precalentados sin agarosa. </li><li> Corte la cabeza del embrión y retire el área superior del cerebro usando dos pinzas finas No. 5 ( Figura 1 A-C ). Utilice una pinza No. 5 para sostener el embrión mientras que la otra pinza No. 5 cortará el tejido adicional fuera de los estantes palatales. NOTA: Las tijeras finas se pueden utilizar para cortar la cabeza del embrión (el primer paso) en vez de una pinza No. 5. Sin embargo, dos fórceps finos No. 5 darán un mejor control para hacer cortes precisos. </li><li> Retire la mandíbula cuidadosamente sin dañar las estanterías palatinas como se muestra en la Figura 1 D y 1E . Para reducir la posibilidad de dañar los paladares, mantener la lengua a través de la disección de la mandíbula, fOllowed por la eliminación cuidadosa de la lengua. </li><li> Después de retirar la mandíbula y la lengua, examinar el lado oral del paladar secundario con un estereomicroscopio con fluorescencia para confirmar la señal de un reportero fuerte en el MES ( Figura 1 M ). </li><li> Disecar las partes posteriores, incluyendo el trasero y el tronco cerebral después de extraer la mandíbula y la lengua ( Figura 1 F ). </li><li> Retire ambos maxilares con estantes palatinos adheridos ( Figura 1 G ). </li><li> Corte el tejido anterior de la mandíbula superior manteniendo intacto el paladar primario y secundario ( Figura 1 H e I ). </li><li> Quitar el tabique nasal en el lado nasal del explante exponiendo el MES. NOTA: Estos pasos posteriores de las disecciones necesitan una atención cuidadosa para no interrumpir los contactos entre dos estantes palatales secundarios. La extirpación del tabique nasal ayuda aReducir la señal de fondo de otras áreas y también reducir el movimiento vertical del tejido, lo que permite una imagen estable ( Figura 1 J-L ). </li><li> Después de diseccionar las estanterías palatales, examine nuevamente la señal del reportero de la línea media para asegurarse de que no haya daños en la capa epitelial entre los tejidos. </li></ol></li><li> Preparación de explantes de paladar en un plato de cultivo con medios de imagen en vivo <ol><li> Coloque los medios de imagen en vivo en un plato inferior de vidrio de 35 mm. </li><li> Coloque los estantes palatales disecados con el lado oral hacia abajo, lo más cerca posible del fondo de vidrio, para obtener imágenes con un microscopio confocal invertido ( Figura 1 N ). </li><li> Coloque pastillas de hielo seco en una superficie conductora cerca de la placa de cultivo para acelerar la solidificación de agarosa disminuyendo rápidamente la temperatura o poner la cápsula de cultivo a 4 ° C. Una placa fría, como la que se utiliza para la incrustación de parafina también podría ser utilizado en este sTaje NOTA: Cuando se usa hielo seco, el cambio de los medios de agarosa necesita ser monitoreado cuidadosamente para prevenir el congelamiento de los medios. </li></ol></li></ol> 3. Confocal Time-lapse Imaging de Palate Explant <ol><li> Imaging y adquisición de datos <ol><li> Después de semi-solidificar la agarosa, montar el plato de cultivo en un microscopio confocal invertido equipado con cámara de incubación a 37ºC. Utilice un microscopio confocal de luz blanca y un microscopio confocal de disco giratorio de observador de células. NOTA: Utilizamos un medio modificado que contenía HEPES 15 mM sin gas CO 2 . </li><li> Colocar vaselina entre el plato de cultivo y cubrir con una jeringa para evitar la evaporación de los medios de comunicación ( Figura 1 N ). NOTA: Se produce algo de condensación en la parte superior de la cubierta del plato de cultivo después de un cultivo durante la noche (O / N), pero el volumen de medio no cambia, lo que sugiere que la vaselina evita que los medios se evaporen. </li><li> Localice la región de interés con objetivos de ampliación baja (10x) y utilice objetivos de ampliación más altos (objetivo 20x con zoom digital de 3x o objetivo de 40x con Immersol W) para imágenes en tiempo real. NOTA: Los estantes palatales secundarios disecados no son planos. El paladar secundario es una estructura curvada y esto hace que sea difícil imaginar el MES completo en el mismo plano. Las imágenes de baja ampliación (10x) pueden permitir imágenes en paladar completo, pero los objetivos 40x proporcionarán una mejor resolución de imagen para examinar los movimientos celulares detallados en posiciones Z más profundas. La curvatura es alta en la región del paladar medio. El paladar anterior y posterior son relativamente planos en comparación con el paladar medio. A menudo nos fijamos en la mitad anterior del paladar secundario para evitar las regiones de mayor curvatura. </li><li> Escanear múltiples pilas Z con 5 μm cada paso durante 16-24 h usando la excitación láser apropiada (488 nm para GFP y 532/561 nm para RFP) ( Figura 2 ). NOTA: Para reducir la fototoxicidad potencial, use la potencia láser mínima y el tiempo de exposición. Esto es importante especialmente en el caso de imágenes multicolor. Utilice un 22% de potencia láser de 552 nm para membranaTomato (mT), un 30% de potencia láser de 495 nm para membranaFPG (mG) y un 25% de potencia láser de 561 nm para membranaRFP. El tiempo medio de exposición fue de 550 ms. </li><li> Utilice el software de análisis de imágenes para realizar seguimiento celular y análisis cuantitativo. </li></ol></li></ol> 4. Análisis de la imagen de datos NOTA: Aquí, Imaris fue utilizado. Análisis de datos similares también pueden realizarse con paquetes de software ImageJ o Volocity. <ol><li> Representación de superficies tridimensionales (3D) a partir de secuencias de imágenes. NOTA: Esta sección permite generar una superficie a partir de una película generada con una señal GFP de membrana. <ol><li> Haga clic en Editar | Muestre el ajuste de la pantalla y utilice el deslizador del histograma para ajustar la intensidad de la señal de modo que la señal de membrana quede clara a través deLa duración de la película ( Figura 3 A ). </li><li> Corregir la señal blanqueada utilizando Image Procesamiento | Corrección de atenuación . Ajuste los valores Intensity Front (Frente de intensidad) e Intensity Back (Retorno de intensidad) para que la señal de membrana se aclare a lo largo de la película. Es posible que se requieran algunas pruebas y errores al establecer estos valores. NOTA: El valor de Intensity Back (posición de profundidad Z) será menor que el valor de Intensity Front (superficie Z) debido a la penetración limitada del láser. Estos valores también pueden cambiarse para normalizar la intensidad de la señal en la serie Z. Ambos valores pueden ajustarse para lograr la corrección de blanqueo. La corrección de atenuación también se denomina corrección de atenuación de emisiones 19 . </li><li> Con el fin de generar una superficie a partir de la señal de membrana, seleccione Surpass | Superficies , elija un canal de origen y un tipo de Umbral (Intensidad absoluta) y bajo los ajustes de algoritmoLección Segmente sólo una Región de Interés Y Proceso de la imagen entera finalmente , seguido haciendo clic en la flecha hacia adelante; Continúe presionando la flecha hacia adelante (utilice la configuración predeterminada o especifique los niveles de detalle de superficie y el método de umbral por ensayo y error), verificando si la superficie generada refleja la señal de fluorescencia. Para especificar una Región de Interés, seleccione la región y la (s) hora (s) a renderizar recortando las posiciones X, Y, Z. NOTA: Seleccione Proceso de toda la imagen finalmente para que los ajustes y los umbrales se apliquen a través de toda la película. </li><li> Genere una superficie haciendo clic de nuevo en el botón de flecha hacia delante. A continuación, ajuste el umbral cambiando el histograma en Filtros para que corresponda a la señal de membrana. </li><li> Después de que se genera la superficie, elija superficie en Superficies / Ajustes para visualizar la señal de superficie y terminar el proceso de generación de superficie empujando el doble remolqueArd ( Figura 3 B ). </li><li> Ir a la superficie | Edite y haga clic en Mascarar todo en las propiedades de máscara para generar una imagen de canal enmascarada. </li><li> Después de hacer clic en Aceptar, la ventana Canal de máscara se abrirá automáticamente; Seleccione el canal GFP, ajuste los voxels fuera de la superficie al valor máximo de intensidad de la señal (que se encuentra en el ajuste Edit | Display ) y voxels dentro de la superficie al valor mínimo de intensidad GFP (también encontrado en Editar | Ajuste de la pantalla ), en Ajustes de máscara para generar una máscara de la señal de membrana. </li><li> Como la máscara de la señal de membrana se mostrará en la vista de volumen , generar imágenes invertidas mediante el procesamiento de imágenes | Cambio de Contraste | Invertir ( Figura 3 C ). </li></ol></li><li> Detección de manchas de imágenes de superficie invertida. NOTA: Esta sección permite que el centro de cada celda seaMarcado con un lugar único y rastreado sobre el espacio y el tiempo. <ol><li> Seleccione Surpass Scene | Spots | Crear ; En Ajustes de Algoritmo seleccione Segmento sólo una Región de Interés , Proceso de toda la imagen finalmente y Puntos de Pista (con el tiempo) . </li><li> Haga clic en la flecha hacia adelante y especifique una región de interés; Seleccione la región y la (s) hora (s) para rastrear los puntos; Continúe presionando la flecha delantera, elija el canal enmascarado como canal fuente y determine el diámetro estimado de puntos XY. </li><li> Al hacer clic en el botón de flecha hacia adelante se abrirá automáticamente una ventana de filtro; Ajustar el umbral de detección de puntos cambiando los valores en el histograma para generar puntos únicos en el centro de cada celda ( Figura 3 D ). </li><li> Al hacer clic de nuevo en el botón de flecha hacia delante, se abrirá la ventana de Algoritmo ., Seleccione el modelo de seguimiento de movimiento automático 20 y especifique los datos de seguimiento máximoY el tamaño máximo de hueco para conectar las vías que se convierten en discontinuas durante un corto período de tiempo. </li><li> Al hacer clic de nuevo en el botón de flecha hacia delante se abrirá la ventana Filtros, establezca el umbral de duración de pista ajustando el histograma para que cada celda sea rastreada. Al hacer clic en el botón de flecha de avance doble se finalizará la detección de puntos. </li><li> Para corregir la deriva de tejido, haga clic en Spots | Track Editor y seleccione Correct Drift . Se abrirá automáticamente una ventana Algoritmo ; Seleccione la opción Derivación translacional, Incluir resultado completo y Posiciones correctas de objetos . </li></ol></li><li> Generación de parcelas ventajosas para el análisis cuantitativo. NOTA: El Scatterplot del programa es una herramienta para generar gráficos multidimensionales (X, Y, Z, Color y Escala) con múltiples objetos. Estas parcelas son útiles para ver las tendencias de muchos movimientos celulares en el tiempo. <ol><li> Realice tramas 2D o 3D de datos de seguimiento de celdasVantage-Añadir nuevo menú de trazado Vantage ( Figura 3 E y 3F ). </li><li> Seleccione Volume o Spots y elija Create / Category y Plot Type </li><li> Ajuste los valores de trazado para generar diferentes gráficos de Vantage. </li><li> Exportación de gráficos mediante la función Snapshot . NOTA: Los datos estadísticos también se pueden exportar como una hoja de cálculo para un análisis cuantitativo adicional haciendo clic en Área de números de trazado | Guardar . </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Imágenes en vivo de la morfogénesis del tejido con el cultivo de explante de órganos 3D puede proporcionar información detallada sobre los procesos celulares que no se puede mostrar en el análisis de tinción convencional de secciones de tejido fijo. Utilizando cultivo de explantes in vitro de paladar secundario embrionario de ratón, se observaron varios comportamientos celulares interesantes que nos llevaron a proponer un nuevo mecanismo de fusión del paladar que implica la convergencia epitelial y la extrusión...

La fusión de tejidos es un paso importante en el desarrollo de múltiples órganos. Los principales defectos de nacimiento humanos, tales como labio leporino y paladar hendido, espina bífida y malformaciones del corazón pueden ser resultado de defectos en la fusión de tejidos 1 . La fusión del paladar secundario del ratón ha sido ampliamente estudiada para identificar los mecanismos celulares y moleculares que controlan la fusión de tejidos en el desarrollo 2 , 3 , 4 . En el ratón, el desarrollo del paladar secundario comienza alrededor de E11.5 con el crecimiento de un estante palatino secundario de cada uno de los procesos maxilares bilaterales. El crecimiento inicial de los estantes palatales se produce verticalmente a lo largo de la lengua, hasta aproximadamente E14.0, momento en el cual los estantes palatales se elevan horizontalmente por encima de la lengua. El crecimiento medialmente dirigido da como resultado el contacto físico entre los epitelios de las dos estanterías palatinas, formando el epitelio de la línea mediaAl costura (MES) en E14.5. El MES intermedio debe ser removido de entre los estantes palatales secundarios para permitir la confluencia mesenquimal y el desarrollo de un paladar secundario intacto, completamente fusionado por E15.5 3 . La forma en que se forma una capa epitelial compartida de células MES entre dos estantes palatales separados, y luego se eliminan para lograr la confluencia mesenquimal, ha sido una cuestión central en el desarrollo del paladar. Basado en estudios histológicos y de microscopía electrónica de ratón (EM), estudios de cultivos de explantes y experimentos genéticos de ratón, varios comportamientos celulares fundamentales han sido implicados en este proceso. Las proyecciones de tipo filopodia del epitelio del borde mediano MEE de cada estante palatino facilitan el contacto inicial 5 , 6 , seguido de la intercalación de estas células epiteliales a una MES única compartida 6 , 7 . Eliminación de la MES compartida resultanteHa sido propuesto para proceder por tres mecanismos no exclusivos. Los primeros estudios que emplean observación histológica y ex vivo linaje rastreo con colorantes vitales indicaron que las MES pueden ser removidos por transición epitelial a mesenquimal (EMT) de células MES 8, 9, aunque más recientemente, genética rastreo de linaje de las células epiteliales ha planteado incertidumbre en cuanto a La contribución a largo plazo de las células epiteliales al mesénquima del estante palatal 10 , 11 , 12 . Un número significativo de células apoptóticas, y una reducción en su número en algunos mutantes que no se someten a la fusión adecuada paladar ha llevado a la idea de que la apoptosis puede ser un importante conductor de MES disolución [ 2 , 3] . Finalmente, basándose inicialmente en estudios con etiquetado epitelial y observación estática en puntos de tiempo progresivos, las células MESSe propusieron migrar en las dimensiones oronasal y anteroposterior 11 , 13 , pero estos comportamientos celulares dinámicos fueron inicialmente no confirmados debido a la incapacidad de observarlos en tejido palatino vivo. Recientemente, hemos sido capaces de observar directamente estos comportamientos mediante el desarrollo de una nueva metodología de imagen en vivo que combina los métodos genéticos de ratón de marcado fluorescente con confocal imágenes en vivo de estantes palatales explantados. Primero, para visualizar los comportamientos celulares dinámicos en las células epiteliales del paladar durante la fusión del paladar, se generó un ratón reportero epitelial específico cruzando ROSA26- mTmG ratones flox con ratones Keratin14-cre 14 , 15 . Confocal imágenes en vivo del cultivo de explante paladar de los embriones resultantes confirmó algunos propuesto anteriormente los comportamientos celulares e identificaron nuevos eventos en el proceso de fusión 6 </Sup Las protrusiones de la membrana de las células epiteliales precedieron al contacto inicial célula-célula, seguido por la convergencia epitelial por intercalación celular y desplazamiento celular oronasal. En particular, también descubrió que la extrusión celular, un proceso que se informó que desempeñan un papel importante en la homeostasis epitelial, fue un importante mecanismo de conducción del ratón paladar secundario fusión 6 , 16 . Este método de formación de imágenes se puede usar con otras líneas de reportero; Utilizamos Lifeact-mRFPruby ratones transgénicos 17 , 18 para examinar la dinámica del citoesqueleto actina durante el proceso de fusión. También se pueden emplear otros reporteros para observar otros aspectos específicos de la fusión del paladar y este método puede adaptarse a microscopía confocal de barrido láser o microscopía confocal de disco giratorio, dependiendo de las necesidades de formación de imágenes y de la disponibilidad del microscopio. La imagen en vivo se está convirtiendo cada vez más en un enfoque clave en la biología del desarrollo. PartiCularmente, la morfogénesis craneofacial es compleja y los defectos congénitos humanos que afectan la cara son comunes. Este método confocal de imágenes en vivo ayudará a permitir una mejor comprensión de los mecanismos básicos de desarrollo subyacentes, así como los orígenes de las anomalías craneofaciales humanas.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Tecnología Life</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Tecnología Life</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Tecnología Life</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Life technology</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>BioExpress</td><td>E-3111-125</td><td></td></tr><tr><td>Plato con fondo de vidrio de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina (Vaselina)</td><td>Sigma</td><td>16415-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Ratones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratin14-cre</td><td></td><td>MGI: J:65294</td><td>Alelo = Tg(KRT14-cre)1Amc</td></tr><tr><td>ROSA26mTmG</td><td></td><td>MGI: J:124702</td><td>Alelo = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td></tr><tr><td>Lifeact-mRFPruby</td><td></td><td>MGI: J:164274</td><td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>White Light Microscopio confocal SP5</td>Microscopio confocal de disco giratorio <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Observer</td><td>Microscopía</td><td></td><td></td> Zeiss</tr></tbody></table>

imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

La fusión de los estantes palatales secundarios para formar el paladar secundario intacto es un proceso clave en el desarrollo de los mamíferos y su alteración puede conducir a la hendidura del paladar secundario, una anomalía congénita común en los seres humanos. La fusión del paladar secundario ha sido ampliamente estudiada conduciendo a varios mecanismos celulares propuestos que pueden mediar en este proceso. Sin embargo, estos estudios se han realizado principalmente en tejidos embrionarios fijos en puntos de tiempo progresivos durante el desarrollo o en cultivos de explantes fijos analizados en puntos de tiempo estáticos. El análisis estático es limitado para el análisis de los procesos morfogenéticos dinámicos tales como una fusión del paladar y qué tipos de comportamientos celulares dinámicos median en la fusión palatal se entiende incompletamente. Aquí se describe un protocolo para la imagen en vivo de fusión de paladar secundario ex vivo en embriones de ratón. Para examinar los comportamientos celulares de la fusión del paladar, Keratin14 -cre específico epitelial se utilizó para etiquetar las células epiteliales del paladar en ROSEmbriones reporter flox A26-mTmG. Para visualizar la actina filamentosa, se utilizaron ratones reporteros Lifeact-mRFPruby . La imagen en vivo de la fusión del paladar secundario se realizó mediante la disección de estanterías palatales secundarias recientemente adheridas de embriones embrionarios de día (E) 14.5 y el cultivo en medios que contenían agarosa en un plato inferior de vidrio para permitir la formación de imágenes con un microscopio confocal invertido. Usando este método, hemos detectado una variedad de nuevos comportamientos celulares durante la fusión palatina secundaria. Una apreciación de cómo distintos comportamientos celulares se coordinan en el espacio y el tiempo contribuye en gran medida a nuestra comprensión de este proceso dinámico morfogenético. Este protocolo se puede aplicar a líneas de ratones mutantes, o cultivos tratados con inhibidores farmacológicos para avanzar en la comprensión de cómo se controla la fusión de paladar secundaria.

La visualización en vivo del cultivo de explantes de paladar reveló múltiples procesos celulares que median la fusión del paladar 6 . Los contactos iniciales entre dos células epiteliales se hacen por protrusiones de membrana ( Figura 2 B-2E ). Cuando dos capas epiteliales se encuentran, forman una MES multicelular, seguida de intercalación para formar una MES de capa celular integrada a través de la convergencia epit...

Aquí, presentamos un protocolo para la imagen en vivo de la fusión del paladar secundario de ratón mediante microscopía confocal. Este protocolo puede usarse en combinación con una variedad de líneas de ratón fluorescentes de reportero, y con inhibidores de vía para una visión mecánica. Este protocolo puede ser adaptado para imágenes en vivo en otros sistemas de desarrollo.

Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

El objetivo general de este método de imagenología confocal en vivo es observar directamente los procesos celulares de la fusión del paladar secundario durante el desarrollo craneofacial. Comience separando la cabeza del cuerpo del embrión bajo un microscopio estereoscópico en una placa de Petri que contenga PBS fresco a temperatura ambiente. Sujete la cabeza con un par de pinzas finas número cinco y utilice un segundo par de pinzas para retirar el cerebro superior, cortando cualquier tejido adicional fuera de las repisas palatinas con un segundo par de pinzas.Retire la mandíbula cuidadosamente sin dañar los estantes palatinos. Una vez que la mandíbula haya sido separada, retire cuidadosamente la lengua y confirme la presencia de una señal robusta del reportero en la línea media de la unión epitelial. Es importante no dañarla; palatal explicado durante la disección para mantener la unión epitelial de la línea media intacta.A continuación, retire el cerebro posterior, el tronco encefálico y ambas maxilas con las repisas palatinas adheridas. Corte el tejido de la mandíbula superior anterior, manteniendo intactos tanto el paladar primario como el secundario. Retire el tabique nasal del lado nasal del explante para exponer la línea media de la unión epitelial y confirme que la capa epitelial entre los tejidos esté intacta.Ahora, agregue medio de imagenología en vivo a una placa de fondo de vidrio de 35 milímetros y coloque los estantes palatinos disecados, con la cara oral hacia abajo en la placa, lo más cerca posible del fondo de vidrio. Luego, coloque pellets de hielo seco sobre una superficie conductora cerca de la placa de cultivo para acelerar la solidificación del agarosa dentro del medio de imagenología. Cuando el agarosa esté semisólido, monte la placa de cultivo en un microscopio confocal invertido equipado con una cámara de incubación de 37 grados celsius y use una jeringa para aplicar vaselina entre la placa de cultivo y la cubierta de cultivo para prevenir la evaporación del medio de imagenología.Seleccione un objetivo de baja magnificación para localizar la región de interés. A continuación, seleccione un objetivo de alta magnificación y escanee múltiples z-stacks con pasos de cinco micrones durante 16 a 24 horas, utilizando la excitación láser adecuada. El imagenado en vivo de cultivos de explantes de paladar revela múltiples procesos celulares que median la fusión del paladar, siendo los primeros contactos entre las dos células epiteliales establecidos por protrusiones de la membrana.Cuando las dos capas epiteliales se encuentran, forman una unión epitelial media de múltiples capas celulares, seguida de una intercalación para generar una capa celular única e integrada, la unión epitelial media, mediante la convergencia epitelial. Las células epiteliales en niveles z más profundos también se desplazan progresivamente hacia el lado oral de la unión epitelial media, contribuyendo así al proceso de convergencia epitelial. Se observa una migración celular dirigida hacia la parte posterior en la unión epitelial media del paladar medio.Con eventos de extrusión celular epitelial observados durante la fusión del paladar, lo que sugiere que las células epiteliales en la unión epitelial media pueden eliminarse mediante este proceso activo. Esta unión epitelial integrada se degradará finalmente para lograr la confluencia. Además, la actina filamentosa se enriquece en el límite entre las áreas epitelial y mazenkemo, formando una estructura similar a un cable a lo largo del eje anterior-posterior.Se puede utilizar software para rastrear comportamientos celulares específicos de interés durante la fusión del paladar, siendo el mejor método para el seguimiento celular dependiente de la señal del reportero utilizada en el experimento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Un método para hacer un seguimiento de la fusión celular en los organismos vivos con el tiempo se describe. El enfoque utiliza...

A Cre-Lox P Enfoque de recombinación para la detección de la fusión celular En Vivo</em

Fuente: Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomía e implantación de ventana de la médula espinal en el ratón. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la implantación de una ventana de la médula espinal en un ratón anestesiado para imágenes in vivo. El protocolo estabiliza la médula espinal expuesta utilizando una cubierta de vidrio de borosilicato y una placa posterior impresa en 3D. Este método permite la microscopía de dos fotones de alta resolución para estudiar la dinámica de la barrera...

Implantación de ventana de la médula espinal en un ratón para imágenes in vivo

La mitosis progenitoras neurales es un parámetro crítico de la neurogénesis. Gran parte de nuestra comprensión de la mitosis progenitoras neurales se basa en el análisis de tejido fijado. Formación de imágenes en vivo en rodajas de cerebro de embriones es una técnica versátil para evaluar la mitosis con alta resolución temporal y espacial en un entorno controlado.

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Los estudios sobre el desarrollo del paladar están motivados por la incidencia de paladar hendido, un defecto de nacimiento que impone una carga de salud tremenda y puede dejar la desfiguración permanente. Se demuestra aquí una técnica para estantes cultura palatinas que se pueden utilizar para estudiar diferentes vías de señalización implicadas en el desarrollo de paladar y la fusión.

Método de estudio palatina Fusión usando estático Organ Culture

Este protocolo describe la detección de la migración de células madre esqueléticas periósticas mediada por CCL5 en tiempo real utilizando microscopía intravital de animales vivos.

Imágenes en tiempo real de la migración inducida por CCL5 de células madre esqueléticas periósticas en ratones

Presentamos un protocolo para el aislamiento y cultivo de células mesenquimales palatales embrionarias primarias de ratón para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento bidimensional (2D) y ensayos de reparación de heridas. También proporcionamos la metodología para el análisis de los datos de imágenes de lapso de tiempo para determinar la formación de flujo celular y la motilidad direccional.

Aislamiento e imágenes de lapso de tiempo de células mesenquimas palatinas embrionarias primarias de ratón para analizar los atributos del movimiento colectivo

Este protocolo describe una nueva ventana de imágenes mamarias con una tapa reemplazable (R.MIW). La microscopía intravital después de la implantación del R.MIW permite obtener imágenes longitudinales y de varios días de la glándula mamaria sana y enferma con una resolución celular durante las diferentes etapas del desarrollo.

Microscopía intravital longitudinal con una ventana de imágenes mamarias con tapa reemplazable

Este artículo describe un procedimiento paso a paso para establecer un modelo de ratones con una fístula oronasal. La fístula oronasal se creó mediante el empleo de cauterización oftalmológica calentada para dañar la porción de la línea media del paladar duro, lo que resultó en la formación de una abertura entre las cavidades oral y nasal.

Establecimiento de un modelo de ratones con fístula oronasal

Las imágenes inmunofluorescentes están limitadas por la capacidad de observar procesos biológicos complejos y dependientes del tiempo en una sola instantánea en el tiempo. Este estudio describe un enfoque de imágenes en vivo realizado en cortes de glándula submandibular de ratón cortados con precisión. Este enfoque permite la observación en tiempo real de las interacciones célula-célula durante la homeostasis y los procesos de regeneración y reparación.

Interrogación de las interacciones célula-célula en la glándula salival a través de imágenes de células vivas ex vivo

La imagen en vivo ex vivo es una técnica poderosa para estudiar los procesos dinámicos de los movimientos e interacciones celulares en los tejidos vivos. Aquí, presentamos un protocolo que implementa la microscopía de dos fotones para rastrear en vivo las células epiteliales dentales en incisivos de ratones adultos enteros cultivados.

Uso de imágenes en vivo ex vivo para investigar las divisiones celulares y los movimientos durante la renovación dental del ratón

La traslación de los hallazgos de la microscopía intravital se ve desafiada por su poca profundidad de penetración en el tejido. Aquí describimos un modelo de ratón de cámara de ventana dorsal que permite el registro conjunto de la microscopía intravital y las modalidades de imagen clínicamente aplicables (p. ej., TC, RM) para la correlación espacial directa, lo que podría agilizar la traducción clínica de los hallazgos de la microscopía intravital.

Un modelo de ratón tumoral con cámara de ventana de pliegue cutáneo dorsal para la microscopía intravital combinada y la resonancia magnética en la investigación traslacional del cáncer

Aprende a realizar imágenes en vivo de la fusión del paladar secundario en ratón mediante microscopía confocal. Este protocolo permite observar directamente los procesos celulares durante el desarrollo craneofacial en tiempo real.

Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

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