Nanotubos de ADN como una herramienta versátil para el estudio de polímeros Semiflexible

El objetivo general de este nuevo sistema modelo basado en el ADN es comprender las propiedades fundamentales de una clase de polímeros semiflexibles, que también describe el comportamiento de una clase vital de biopolímeros. Este nuevo método nos permite estudiar cuestiones clave en el campo de la metafísica blanda, en concreto, permite explorar el comportamiento de los filamentos semiflexibles y su disposición en redes. La principal ventaja de esta técnica es que las propiedades mecánicas de los filamentos intravisivos son accesibles experimentalmente y se pueden ajustar con precisión.

Los polímeros semiflexibles se definen por las propiedades especiales de los filamentos, que anteriormente solo se trataban en el marco teórico debido a la falta de sistemas experimentales sintonizables. Aunque este método proporciona información sobre la cantidad definida de polímeros semiflexibles, también se puede aplicar como un nuevo hidrogel para estudiar la migración celular en matrices de diferentes rigideces sin cambiar el tamaño de la malla subyacente. La unidad repetitiva más pequeña del nanotubo puede considerarse como un anillo unitario.

Varios de estos anillos unitarios se apilan durante la hibridación. Esto conduce a la formación de nanotubos alargados. Para comenzar, vuelva a suspender los oligonucleótidos liofilizados en agua purificada y siga los pasos adicionales de resuspensión que se dan en el manual correspondiente de la empresa.

Ajustar la cantidad de agua para obtener una concentración final de 200 micromolares. Determine la concentración de las hebras individuales de ADN para verificar los valores proporcionados por el distribuidor, ya que la estequiometría exacta es crucial para el proceso de ensamblaje. Con una micropipeta, mezcle las hebras de ADN, cada una de la misma concentración, en un recipiente adecuado para el termociclador para formar los tubos de ADN y hélice deseados.

Hibride el ADN y los tubos helicoidales en un termociclador utilizando los parámetros que se encuentran en el protocolo de texto. Almacene el ADN híbrido y los tubos helicoidales durante un máximo de 3 semanas a 4 grados centígrados sin degradación detectable. Antes de realizar la reología, diluya cuidadosamente la muestra hasta la concentración final deseada utilizando el tampón de muestra si es necesario.

Elija una geometría adecuada para el reómetro de cizallamiento dinámico. A continuación, cargue la muestra en el reómetro. Para evitar los posibles efectos de evaporación, pasivar la interfaz aire-agua de la muestra y el entorno a través de 1 de 3 técnicas.

O bien rodee la muestra con 2,5 mililitros del baño tampón de muestra. O bien, agregue un surfactante justo por debajo de la concentración de micelas a la muestra. Alternativamente, use la jeringa Hamilton para rodear la muestra con lípidos para evitar el contacto directo de la muestra con el aire.

Selle la cámara de muestras con una tapa equipada con esponjas húmedas. Y, si es posible, use un baño de agua adicional para suprimir aún más la evaporación. Inicie la medición utilizando el software específico del reómetro a temperatura ambiente, permitiendo que la muestra se equilibre durante 2 horas a temperatura ambiente.

El tiempo de equilibrio es crucial para permitir que el sistema de termoflecta alcance un estado aleatorio isotrópico completo, ya que esta es la única confirmación que permite la comparación entre las diferentes mediciones. Después de la medición, procese los datos como se describe en el protocolo de texto. Prepare 8 alícuotas de 12 microlitros para cada muestra utilizando de 1 a 4 micromolares de ADN por hebra, 12,5 milimolares de cloruro de magnesio y 1x tinción de gel de ácido nucleico.

Además, haga un control negativo sin ADN, pero incluya la tinción de gel de ácido nucleico. Transfiera las alícuotas a una placa de PCR en tiempo real y selle con una película adhesiva. Centrifugar la placa a 100 veces G durante 1 minuto a temperatura ambiente para eliminar las burbujas de gas.

Es fundamental eliminar las burbujas de gas porque pueden expandirse durante las mediciones y las muestras no se pueden analizar. Después de la centrifugación, cargue la placa sellada en un sistema de PCR cuantitativo en tiempo real. Programe un programa de recocido para desnaturalizar el ADN a noventa grados centígrados durante 10 minutos y bajar la temperatura rápidamente a setenta y dos grados centígrados.

Luego, la temperatura debe disminuir lentamente en 0,5 grados centígrados cada treinta minutos. Después de que la señal haya disminuido, acelere la rampa de temperatura. Asegúrese de que la tapa del ciclador se caliente al menos a cien grados centígrados para evitar la condensación de la muestra evaporada en la película adhesiva.

Durante el montaje, excite las muestras con un láser de iones de argón a cuatrocientos ochenta y ocho nanómetros y detecte la fluorescencia a quinientos cincuenta nanómetros cuando utilice un colorante CY3. Para otros tintes, elija una combinación adecuada de emisión de excitación. Mida la señal de fluorescencia con la mayor frecuencia posible para aumentar la calidad general de la señal utilizando la cámara incorporada.

Se muestran datos brutos representativos de una medición reológica que revelan la elasticidad de la red. Aquí se muestra el barrido de tiempo durante el tiempo de equilibrio. Este gráfico revela el comportamiento dependiente de la deformación de la red.

En este gráfico, el comportamiento de la red en función de la frecuencia es evidente. En este punto se eligen los valores a una frecuencia específica. Los valores para la población específica del tubo helicoidal de ADN se trazaron en función de la concentración.

Este proceso se repitió para todos los tubos de ADN y hélice. A continuación, se extrajo la pendiente en una parcela de troncos que produjo el exponente de la ley de potencia. Finalmente, los valores se volvieron a trazar en función de la longitud persistente para cada concentración medida.

Estos gráficos permiten extraer el escalado del módulo de la meseta elástica con respecto a la concentración y la longitud de persistencia. Después del desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la física de la materia blanda y los polímeros exploraran el efecto de la rigidez del filamento para la clase de polímeros semiflexibles. Siguiendo este procedimiento, se pueden abordar efectos adicionales como la recitación de las redes entrelazadas, el cruce de redes en general y el proceso de formación de estructuras.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hibridar nanotubos de ADN y cómo medir las propiedades reológicas de sus redes.