Biopanning semi-automatizado de bibliotecas de exhibición bacteriana péptido afinidad reactivo descubrimiento y análisis de los aislamientos que

Los objetivos generales de este procedimiento de biopaneo son aislar rápidamente los agentes de captura de péptidos en una proteína específica objetivo de interés y eliminar de forma rápida y eficaz los candidatos no específicos de los análisis posteriores. Este método se puede utilizar para el descubrimiento de reactivos robustos de afinidad peptídica para una variedad de aplicaciones, desde la detección de amenazas biológicas hasta el diagnóstico de enfermedades. La principal ventaja de esta técnica es que los reactivos de afinidad peptídica se pueden aislar rápidamente en aproximadamente una semana sin una cantidad significativa de entrenamiento.

Aunque este método se puede utilizar para descubrir reactivos de afinidad peptídica para uso fuera de la célula, los péptidos también podrían usarse como materiales vivos. En general, el aspecto más difícil para los individuos nuevos en este método será el análisis de la secuencia descendente de los candidatos, que interactúa en gran medida con los protocolos experimentales que se muestran aquí. Las bibliotecas de visualización bacteriana de biopaneo son un proceso cíclico que comienza con la clasificación negativa contra las propias perlas magnéticas para eliminar cualquier aglutinante no específico del material de la perla o cualquier proteína de captura adherida.

Se debe retener la fracción negativa que no se une a las perlas magnéticas. Se puede realizar una clasificación negativa adicional contra cualquier objetivo potencial de proteínas de reactividad cruzada, y la fracción negativa que no se une a las perlas magnéticas se retiene nuevamente. Los siguientes pasos de clasificación positiva son muy similares a la clasificación negativa frente a una proteína objetivo, pero esta vez se conserva la fracción positiva unida a la perla magnética.

Para la clasificación positiva de la biblioteca de visualización bacteriana, primero inocule 500 mililitros de Luria Broth Miller suplementado con cloranfenicol, o LBCM-25, con aproximadamente una vez 10 a la 11ª celdas de una biblioteca de clasificación de pantalla bacteriana diversa previamente agotada de péptidos no deseados por clasificación negativa. Incubar la biblioteca a 37 grados Celsius en 225 RPM hasta que el cultivo alcance un OD 600 de 0,5 a 0,55. A continuación, inducir la expresión de péptidos con L-arabinosa al 0,04% durante 45 minutos a 37 grados centígrados con agitación.

Al final del período de inducción, coloque el cultivo en hielo. Y recolectar dos veces diez a la undécima célula bacteriana por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en 1,5 mililitros de PBS con un suave remolino.

Y divida las bacterias en múltiples tubos de microcentrífuga según sea necesario para una segunda centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS complementado con el objetivo de biotinilación de interés para una incubación de 45 minutos a cuatro grados centígrados en una plataforma giratoria. Mientras tanto, lave 100 microlitros de perlas codificadas por estreptavidina en un milímetro de PBS suplementado con albúmina sérica bovina, o BSA, por centrifugación.

Coloque las perlas lavadas en un separador de partículas magnético de sobremesa y retire con cuidado el súper nadent, teniendo cuidado de no tocar el pellet. Al final de la incubación rotativa, centrifugar las células para recoger cualquier objetivo no unido en el supernadente y volver a suspender el pellet de células bacterianas unidas a proteínas objetivo en un mililitro de PBS más BSA. Utilice todo el volumen de células bacterianas para volver a suspender la bolita de perlas.

Incubar a cuatro grados centígrados en una plataforma giratoria durante 30 minutos. A continuación, coloque la perla y la solución de bacterias en hielo. Encienda el instrumento de máx. automática para inicializar el sistema y seleccione lavar ahora, enjuagar y ejecutar en el menú de separación para cebar las líneas con los tampones de lavado y ejecución del fabricante, respectivamente.

Al final del lavado, imprime las líneas una vez más usando PBS más tampón BSA. Cuando el instrumento esté listo, transfiera la mezcla de bacterias y perlas a un tubo cónico de 15 mililitros y enjuague el tubo con 500 microlitros adicionales de PBS fresco más BSA. Tire del lavado con la mezcla de bacterias y perlas y coloque el tubo en la ranura de muestra de una gradilla de tubos cónicos de cuatro grados centígrados.

Coloque los tubos colectores vacíos de 15 mililitros en las ranuras de selección positiva y negativa del bastidor y transfiera el bastidor a la plataforma de instrumentos. Asigne un programa de separación para cada muestra en la gradilla agregando un paso de enjuague entre cada muestra y después de la última muestra. Seleccione ejecutar para iniciar la separación de celdas y aceptar o continuar para confirmar que hay suficiente búfer disponible.

Cuando se complete el programa, retire la rejilla y coloque la fracción positiva que contiene tanto las bacterias como las perlas en hielo. Después de cebar las líneas como se acaba de demostrar, con los tampones de funcionamiento y lavado del fabricante, seleccione energía y sí para apagar el instrumento y confirmar que hay un 70% de etanol en la botella de solución de almacenamiento para la descontaminación. Cuando se complete el apagado del sistema, las botellas serán de color púrpura.

La máquina se puede apagar. A continuación, utilice toda la fracción de clasificación positiva para inocular un litro de LBCM25 suplementado con glucosa D para el cultivo nocturno a 37 grados centígrados con agitación. Para analizar el éxito del aislamiento del reactivo de afinidad después de cada ronda de clasificación, al final de la inducción del péptido posterior a la clasificación, agregue cinco microlitros de células inducidas a 25 microlitros de las soluciones como se muestra en la tabla.

Después de una incubación de 45 minutos en hielo, recoja las bacterias en cada solución por centrifugación y aspire el supernadent de cada muestra. Con los tubos de muestra en hielo, seleccione administrador en el software del instrumento FAX y abra la carpeta de análisis correspondiente. Haga clic en nuevo experimento.

A continuación, haga clic con el botón derecho para cambiar el nombre del experimento y haga clic en Hojas de cálculo globales. Haga clic en el icono de diagrama de puntos en la hoja de cálculo global para crear un nuevo diagrama de dispersión. A continuación, seleccione el gráfico de diagrama de puntos y seleccione el icono del inspector.

Haga clic en las casillas junto a los ejes X e Y en la ventana abierta para ajustar los ejes a una pantalla biexponencial y cerrar la ventana del inspector. Haga clic en el experimento y cree un nuevo espécimen, haciendo clic con el botón derecho para cambiar el nombre del espécimen según sea apropiado para el experimento. A continuación, haga clic en el signo más para expandir la muestra y cambiar el nombre de la muestra.

Para ejecutar una muestra de control negativa, vuelva a suspender el pellet de solo PBS en 500 microlitros de tampón de trabajo FAX helado mezclando bien mediante pipeteo. Transfiera la muestra a un tubo de fax, agitándolo para mantener las células en solución, y cargue la muestra en el tubo de inyección de muestra o SIT del instrumento. Haga doble clic en el tubo de muestra actual y haga clic en los datos adquiridos.

A continuación, muestre los eventos en el diagrama de puntos del área de dispersión lateral frente al área de dispersión directa preparado anteriormente, ajustando el umbral de voltaje del tubo fotomultiplicador en la pestaña de umbral según sea necesario para que las celdas de control negativas caigan cerca del centro. Cuando la muestra se lea correctamente, ajuste el caudal para mostrar 200-2.000 eventos por segundo y haga clic en registrar datos para capturar un mínimo de 10.000 eventos. Cuando se hayan adquirido todos los eventos, retire el tubo de muestra del SIT.

Seleccione el icono de puerta de polígono y dibuje una puerta alrededor de la mayoría de la población de celdas en el diagrama de dispersión. Haga clic con el botón derecho en el diagrama de puntos para seleccionar mostrar jerarquía de población y haga clic en P1 en la jerarquía de población y cree un nuevo diagrama de puntos para mostrar la población P1. Haga clic con el botón derecho en cada eje para cambiar el eje Y al área FITC y el eje X al área de dispersión hacia adelante y ajuste los ejes a una visualización biexponencial.

Utilice la puerta poligonal para limitar las celdas de control negativas lo más estrechamente posible alrededor de los lados superior e izquierdo de la población, y seleccione P2 en la jerarquía de población, haciendo clic con el botón derecho para seleccionar la puerta invertida. Menos del 1% de la población debería quedar fuera de la puerta. Haga clic con el botón derecho en el diagrama de puntos con la puerta P2 para seleccionar mostrar poblaciones y seleccione las poblaciones P2 y no P2 para mostrar.

A continuación, haga clic con el botón derecho en el diagrama de puntos con la puerta P2 para seleccionar crear vista de estadísticas y haga clic con el botón derecho en la ventana de vista de estadísticas para seleccionar editar vista de estadísticas. En la pestaña poblaciones, agregue o quite las poblaciones según corresponda, incluida la población principal P1. P2 y no P2 ya debería mostrarse.

Luego, en la pestaña de estadísticas, agregue el medio del área FITC y cualquier otra estadística de interés y haga clic en Aceptar para cerrar la ventana. Haga clic con el botón derecho en el diagrama de dispersión P2 y seleccione duplicar para crear un gráfico de puntos similar para el área PE frente al área FSC. Ajuste el eje Y y utilice la muestra PBS sola para controlar la población P3.

A continuación, invierta la puerta. Y mostrar las poblaciones adecuadas. Cuando se hayan configurado todas las puertas adecuadas, utilice la hoja de cálculo para ejecutar todas las muestras, registrando unos 10.000 eventos por tubo.

Al igual que en este experimento representativo, la unión de Ypet Mona a un péptido de control positivo fijo puede ayudar a monitorear el nivel de expresión de la biblioteca de péptidos inducidos dentro de la población. Las células que carecen de péptidos mostrados en la superficie generalmente se eliminan durante el proceso de clasificación, como se observa en las rondas tres y cuatro. El enriquecimiento de la biblioteca para los péptidos que se unen al objetivo específico de interés se logra normalmente en tres rondas de clasificación positivas.

Continuar con una cuarta ronda de clasificación puede ser beneficioso, ya que es probable que las secuencias de péptidos de mayor afinidad que ya están presentes en la tercera ronda se enriquezcan aún más en la cuarta ronda, lo que ayuda a reducir la selección de posibles candidatos. La especificidad se evalúa comparando la unión al objetivo previsto con la unión a cualquier objetivo potencial de reacción cruzada, como los que se utilizaron para la clasificación negativa. El análisis de secuencias de la cuarta ronda de clasificación suele revelar secuencias repetidas que son excelentes puntos de partida para los análisis de afinidad y especificidad.

El análisis de alineación de secuencias de las secuencias repetidas se puede utilizar para revelar la presencia de una secuencia de consenso que puede ayudar en la selección descendente de candidatos. Una colonia representativa de cada secuencia repetida puede analizarse más a fondo mediante hechos de afinidad y especificidad en la célula para evaluar la unión de péptidos a proteínas diana y reactivas cruzadas. Una vez dominado, se puede realizar un experimento biológico completo con el análisis inicial de afinidad y especificidad en menos de dos semanas si se ejecuta correctamente.

Al realizar el procedimiento completo, es importante recordar que es posible que deba alternar entre la evaluación de enlace y los análisis de secuencia varias veces para comprender completamente el tránsito involucrado en la afinidad de enlace. Se incluye un archivo de macros complementario que hemos desarrollado para automatizar gran parte del análisis de péptidos y agilizar aún más la selección de candidatos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar rápidamente los agentes de captura de péptidos de una biblioteca de visualización bacteriana y cómo eliminar candidatos no específicos de análisis posteriores.

Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como ALIZA para confirmar la afinidad y especificidad de la unión fuera de la célula.