Proyección de alto rendimiento para la herencia basados en proteína en S. cerevisiae

El objetivo general de este fenotipado de levaduras de alto rendimiento es detectar proteínas que provoquen una memoria fenotípica duradera de la expresión transmitida, como un indicador de la herencia basada en proteínas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los priones de levadura, como por ejemplo, cuántas proteínas puede heredar de este tipo. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden cribar muchas proteínas y vías de forma imparcial.

Comience este procedimiento cultivando las células de levadura apropiadas en una placa de 96 pocillos a 30 grados centígrados, como se describe en el protocolo de texto. Inspeccione visualmente los cultivos para confirmar que los cultivos están saturados, las células deben ser visibles a simple vista, en el fondo de cada pocillo. Utilice un robot de manejo de líquidos para preparar placas de 384 pocillos, que contienen 45 microlitros del medio apropiado por pocillo.

Primero, dispense Scal-URA en los pocillos de una placa de 384 pocillos. A continuación, dispense Scal-URA más el estresor de interés en los pocillos de una segunda placa, se utilizan 20 milimolares de cloruro de manganeso como estresor en este experimento. En tercer lugar, dispense SD-URA, que no inducirá la expresión de plásmidos, más cloruro de manganeso en otra placa.

Baje la placa de 96 pocillos que contiene los cultivos en el robot de manejo de líquidos e inocule una matriz de uno a cuatro de un microlitro de cada pocillo de la placa de 96 pocillos, en cuatro pocillos separados de cada placa de 384 pocillos llenos con un medio diferente. Coloque inmediatamente las placas con celdas en un apilador de microplacas a temperatura ambiente y dióxido de carbono atmosférico. Configure el protocolo para un bucle continuo de 72 horas, midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros con el lector de microplacas.

Después de las mediciones de crecimiento, transfiera un microlitro por pocillo de los cultivos inducidos por SCal-URA que experimentaron sobreexpresión de proteínas a nuevas placas de 384 pocillos, que contienen 45 microlitros por pocillo de medio ST-URA que no permite la expresión proteica del plásmido. Paralelamente, realice inoculaciones análogas de un segundo conjunto de placas de 384 pocillos que contengan 45 microlitros por pocillo de ST-URA de los cultivos que se cultivaron en ST-URA en presencia del estresor. Coloque las placas en una cámara humidificada y haga crecer las placas durante 48 horas a 30 grados centígrados hasta la saturación.

Después de 48 horas, use las placas para volver a inocular un microlitro por pocillo en placas de 384 pocillos que contienen 45 microlitros por pocillo de ST-URA. Luego, realice una reinoculación separada de un microlitro por pocillo de la misma placa de origen en una placa de 384 pocillos separada que contenga 45 microlitros por pocillo de ST-URA con el estresador. Coloque inmediatamente las placas con las celdas del microstacker a temperatura ambiente y dióxido de carbono atmosférico y configure el protocolo para un bucle continuo de 48 horas, midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros con un lector de microplacas.

Cuando se completen las mediciones de crecimiento, utilice el software del lector de placas para exportar el tiempo frente a la densidad óptica en mediciones de 600 nanómetros como una tabla XY. Agrupe las columnas de las mediciones de densidad óptica para cada réplica biológica y calcule la media. Cree un gráfico XY de tiempo frente a densidad óptica a 600 nanómetros para generar curvas de crecimiento.

Para los cultivos que eligieron diferencias significativas de crecimiento en respuesta a un factor estresante dado, dependiendo de la sobreexpresión de proteínas ancestrales, se debe tomar un microlitro de cada réplica biológica, diluir en 10 mililitros de agua y luego colocar 50 microlitros en placas que contengan 5-FOA. Crece a 30 grados centígrados durante tres días. Si esto da como resultado demasiadas o muy pocas colonias por plato, ajuste el factor de dilución en consecuencia.

Lo ideal es de 100 a 200 colonias por plato. Elija de ocho a 32 colonias individuales con palillos de dientes de autoclave y fíjelas a placas de 96 pocillos que contengan 150 microlitros de SDCSM por pocillo. Coloque las placas en una cámara humidificada y crezca hasta la saturación durante 48 a 72 horas a 30 grados centígrados.

Utilice estos cultivos para inocular dos nuevos conjuntos de placas de 96 pocillos que contienen 150 microlitros por pocillo de SDCSM, con y sin el factor estresante. Coloque las placas en un apilador de microplacas y configure el protocolo para medir la densidad óptica a 600 nanómetros en un bucle continuo de 48 horas. Después de 48 horas, analice los datos como se muestra anteriormente y confirme que las diferencias de crecimiento significativas observadas anteriormente se mantienen después de la pérdida de plásmido.

A continuación, se analizan las células que mantienen los fenotipos inducidos para determinar las características clásicas de la herencia basada en proteínas, tal y como se describe en el protocolo de texto. Este cribado de herencia basado en proteínas reveló la sobreexpresión transitoria del marco de lectura abierto PSP1, lo que impulsa una resistencia al cloruro de manganeso que se mantuvo durante cientos de generaciones en las células, mucho después de que la sobreexpresión hubiera cesado. Los algoritmos de predicción de priones puntuaron el extremo final de PSP1 como moderadamente similar a un prion.

Por el contrario, los algoritmos no predijeron prácticamente ninguna característica significativa de la secuencia similar a un prión de la mayoría de las proteínas inductoras recuperadas en la pantalla, como se muestra en este análisis representativo. Las mediciones de crecimiento de las cepas y SDCSM con cloruro de manganeso, normalizadas a un control sin PSP1 vírgenes correspondiente, indicaron que la inhibición de la disagregasa HSP104 no afecta la resistencia al cloruro de manganeso dependiente de PSP1, mientras que la eliminación de la chaperona HSP70 y el gen PSP1 elimina hereditariamente este fenotipo. Todas las esporas de tétradas individuales de cruzamientos entre cepas, que albergan el estado fenotípico dependiente de PSP1 y cepas naïf, muestran resistencia al cloruro de manganeso, lo que indica una herencia no mendeliana del fenotipo.

Una comparación de la infectividad para la transformación de proteínas entre lisados simulados y PSP1 que albergan lisados como material transmisible, mostró que más del 53% de las células vírgenes transformadas con PSP1 sembrado, recibieron el fenotipo de resistencia al cloruro de manganeso correspondiente. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un par de semanas, incluidas las etapas de incubación y la preparación de la mayoría de las etapas de cribado se puede realizar en menos de dos horas al día, incluso con un gran número de placas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar planificar exactamente lo que desea probar de antemano y tener en cuenta la escala del experimento.

Ahora bien, esto es especialmente importante para los principiantes en la técnica. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos similares a los descritos en el protocolo de texto para determinar si los fenotipos observados en el cribado muestran un verdadero patrón de herencia similar al prion. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética exploraran la amplitud de la biología de los priones en el servicio de IC del sacral.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar una pantalla de alto rendimiento para nuevas formas de herencia basada en proteínas en la levadura, tanto de manera imparcial como dirigida.

No olvide que ciertos factores químicos estresantes, como los agentes que dañan el ADN, pueden ser extremadamente peligrosos y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.