Name: Proyección de alto rendimiento para la herencia basados en proteína en S. cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprende a realizar un cribado de alto rendimiento para identificar proteínas que inducen memoria fenotípica duradera en S. cerevisiae. Este método permite estudiar mecanismos de herencia basados en proteínas de forma no sesgada.

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Agradecemos a Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She y Susan Lindquist por su asistencia en el desarrollo de los ensayos utilizados en este documento, así como los revisores por sus comentarios reflexivos.

<ol><li>Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions%2C+protein+homeostasis%2C+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity.</a> Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).</li>
<li>Byers, J. S., Jarosz, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pernicious+pathogens+or+expedient+elements+of+inheritance%3A+the+significance+of+yeast+prions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions.</a> PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).</li>
<li>Jarosz, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-kingdom+chemical+communication+drives+a+heritable%2C+mutually+beneficial+prion-based+transformation+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism.</a> Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).</li>
<li>True, H. L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion+provides+a+mechanism+for+genetic+variation+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity.</a> Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).</li>
<li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion%2C+Mod5%2C+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146 (3), 448-461 (2011).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+polymerization+underlies+signal+transduction+in+antiviral+immune+defense+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation.</a> Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).</li>
<li>Majumdar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+amyloid-like+oligomers+of+Drosophila+Orb2+in+the+persistence+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory.</a> Cell. 148 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Khan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloidogenic+Oligomerization+Transforms+Drosophila+Orb2+from+a+Translation+Repressor+to+an+Activator%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator.</a> Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).</li>
<li>Fioriti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Persistence+of+Hippocampal-Based+Memory+Requires+Protein+Synthesis+Mediated+by+the+Prion-like+Protein+CPEB3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3.</a> Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).</li>
<li>Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+affect+the+appearance+of+other+prions%3A+the+story+of+%5BPIN%28%2B%29%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)].</a> Cell. 106 (2), 171-182 (2001).</li>
<li>Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+identifies+prions+and+illuminates+sequence+features+of+prionogenic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins.</a> Cell. 137 (1), 146-158 (2009).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+chaperone+protein+Hsp104+in+propagation+of+the+yeast+prion-like+factor+%5Bpsi%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+].</a> Science. 268 (5212), 880-884 (1995).</li>
<li>Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Support+for+the+prion+hypothesis+for+inheritance+of+a+phenotypic+trait+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast.</a> Science. 273 (5275), 622-626 (1996).</li>
<li>Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BURE3%5D+as+an+altered+URE2+protein%3A+evidence+for+a+prion+analog+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">[URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 264 (5158), 566-569 (1994).</li>
<li>Sondheimer, N., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rnq1%3A+an+epigenetic+modifier+of+protein+function+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast.</a> Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).</li>
<li>Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amyloid-forming+peptide+from+the+yeast+prion+Sup35+reveals+a+dehydrated+beta-sheet+structure+for+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).</li>
<li>Glover, J. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9182769">Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.</a> Cell. 89 (5), 811-819 (1997).</li>
<li>King, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-inducing+domain+2-114+of+yeast+Sup35+protein+transforms+in+vitro+into+amyloid-like+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104+catalyzes+formation+and+elimination+of+self-replicating+Sup35+prion+conformers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers.</a> Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).</li>
<li>Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+the+yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+by+guanidine+hydrochloride+is+the+result+of+Hsp104+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation.</a> Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).</li>
<li>Caudron, F., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+super-assembly+of+Whi3+encodes+memory+of+deceptive+encounters+by+single+cells+during+yeast+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship.</a> Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).</li>
<li>Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16793280">How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta].</a> Methods. 39 (1), 3-8 (2006).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+SUP35+gene+induces+de-novo+appearance+of+psi-like+factors+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).</li>
<li>Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heritable+switch+in+carbon+source+utilization+driven+by+an+unusual+yeast+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion.</a> Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).</li>
<li>Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+product+of+the+het-s+heterokaryon+incompatibility+gene+of+the+fungus+Podospora+anserina+behaves+as+a+prion+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).</li>
<li>Chakrabortee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+Disordered+Proteins+Drive+Emergence+and+Inheritance+of+Biological+Traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits.</a> Cell. 167 (2), 369-381 (2016).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).</li>
<li>Swain, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+time+derivatives+including+cell+growth+rates+using+Gaussian+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes.</a> Nat Commun. 7, 13766(2016).</li>
<li>Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+prion-like+element+converts+wild+fungi+from+metabolic+specialists+to+generalists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists.</a> Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+high+efficiency+transformation+of+intact+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells.</a> Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425(1992).</li>
<li>Formosa, T., Nittis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressors+of+the+temperature+sensitivity+of+DNA+polymerase+alpha+mutations+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).</li>
<li>Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+proteome+turnover+analyses+of+the+Yeasts+S.+cerevisiae+and+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe.</a> Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).</li>
<li>Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLAAC%3A+a+web+and+command-line+application+to+identify+proteins+with+prion-like+amino+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition.</a> Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>Rogoza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Mendelian+determinant+%5BISP%2B%5D+in+yeast+is+a+nuclear-residing+prion+form+of+the+global+transcriptional+regulator+Sfp1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+adaptive+conduits+of+memory+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Prions as adaptive conduits of memory and inheritance.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).</li>
<li>Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+variations+in+an+infectious+protein+determine+prion+strain+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences.</a> Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).</li>
<li>Tanaka, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protein+transformation+protocol+for+introducing+prions+into+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).</li>
<li>Roberts, B. T., Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+activity%3A+a+prion+that+propagates+by+covalent+autoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation.</a> Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistability+in+the+lactose+utilization+network+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli.</a> Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los priones de levadura primeros fueron identificados por sus fenotipos inusuales y desconcertantes patrones de herencia. Las características de estos priones fueron utilizadas para construir algoritmos y herramientas computacionales para detectar proteínas priónicas adicional. El método descrito aquí, en cambio, es experimental y depende de la sobreexpresión transitoria para crear un duradero un cambio estable estado codificado en la conformación de proteínas. Sin embargo, si la eficiencia de "siembra" Asamblea del prió...

Sistemas biológicos con frecuencia experimentan fluctuaciones transitorias en abundancia de la proteína. No está claro si éstos tienen un impacto duradero en la formación del fenotipo de un organismo o de las generaciones futuras. Los casos más conocidos de esta biología implican una clase rara de las proteínas, los priones, que conducen a la aparición de rasgos hereditarios sin modificación del genoma. En cambio, estos proteinaceous y enfectious las partículas transmiten fenotipos mediante cambios perpetúa a sí mismo a la conformación de la proteína1,2. Este tipo de herencia fue descubierto como la causa de los patrones de herencia inusual de una enfermedad neurodegenerativa devastadora. Sin embargo, estudios en organismos que van desde hongos hasta mamíferos3,4,5,6,7,8,9,10 han revelado desde entonces que elementos como prión pueden conferir valor adaptativo. Sin embargo, los priones han sido vistos como una fascinante pero rara rareza biológica.
Esta sabiduría que prevalece en parte se lleva a cabo porque la caracterización de la herencia basados en proteínas durante mucho tiempo ha sido restringida por un pequeño conjunto de ejemplos. Los esfuerzos recientes de cribado sistemático han ampliado esta imagen significativamente mediante la identificación de varios nuevos priones de bona fide 11 y casi dos docenas de proteína dominios12 con capacidad de conversión conformacional de combustible-como prión. Sin embargo, debido a estos enfoques se han centrado generalmente en sesgos de secuencia del aminoácido fuerte, los priones que se han descubierto compartan las propiedades bioquímicas de la Fundación levadura prions [PSI+]13,14[URE3]15y [RNQ+]11,16. Estos incluyen: 1) modulares dominios que son ricos en tramos largos polímeros de asparagina (N) y glutamina (Q), 2) el conjunto en un amiloide [prión+] conformación17,18,19y 3) completan dependencia disaggregase Hsp104 función de propagación fiel de madre a hija13,20,21. De hecho, muchos bona fide priones, incluyendo [GAR+], [Het-s] y aun el original del prión (PrPSc), sería faltado bajo criterios estrictos. Tal vez lo más importante, serían incapaces de capturar nuevos mecanismos de herencia basados en proteína22. Así, la verdadera amplitud biológica de tales fenómenos puede ser mucho más común en la naturaleza que se suponía.
Para investigar esta cuestión, se empleó una estrategia de alto rendimiento de todo el proteoma. Una característica de los priones, incluyendo PrPSc, [GAR+], y [Het-s], es que la sobreexpresión transitoria de las proteínas causales aumenta fuertemente la tasa de prión adquisición15,23,24,25,26. Hemos aprovechado esta característica para pedir sistemáticamente, a través de toda la levadura ORFeome, si Estados estables basados en proteína, epigenéticos podrían ser iniciados por transitoriamente induce la sobreexpresión de proteínas individuales. Es bien sabido que sobreexpresión de proteína puede alterar los fenotipos27. Sin embargo, las proteínas del prión son inusuales porque su superproducción temporal produce un cambio en el fenotipo que es heredable por cientos de generaciones después de la sobreexpresión de inicial. Previamente hemos tomado ventaja de esta característica, así como los patrones de herencia inusual de elementos genéticos basados en proteínas, para identificar docenas de proteínas que son capaces de heritably re-wiring fenotípicas paisajes sin alterar el genoma28. Aunque algunos identifican proteínas fueron conocido como los priones, la mayoría eran no, lo que subraya la potencia de este enfoque para descubrir nuevas formas de herencia basados en proteína.

<table><tbody><tr><td>Clorhidrato de guanidina</td><td>Sigma</td><td>Cat#G3272-25G</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Cloruro de manganeso</td><td>Sigma</td><td>Cat#M8054-100G</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td>Químico</td></tr><tr><td>5-Ácido fluoroorótico</td><td>Sigma</td><td>Cat#F5013-50MG</td><td>Químico</td></tr><tr><td>BY4741 MATa (his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 LYS2 met15&Delta; 0 ura3 y Delta; 0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A Cepa</td><td>de levadura</td></tr><tr><td>BY4741 MAT&alpha; (his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 lys2 y Delta; 0 MET15 ura3&Delta; 0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A Cepa</td><td>de levadura</td></tr><tr><td>Hsp70 (K69M)&nbsp;</td><td>Jarosz et al., 2014b</td> N<td>/A</td><td>Plásmido</td></tr><tr><td>FLEXLa biblioteca</td><td>de Gee Hu et al., 2007</td><td>N/A</td><td>Biblioteca de plásmidos</td></tr><tr><td>Dextrosa (glucosa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>Rafinosa</td><td>Sigma</td><td>R0250-25G</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>Galactosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656-500</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>CSM</td><td>Sunrise Ciencia</td><td>1001-100</td><td>Componente multimedia</td></tr><tr><td>CSM-URA</td><td>Sunrise Science</td><td>1004-100</td><td></td></tr><tr><td>Componente multimedia CSM-LYS</td><td>Sunrise Science</td><td>1032-100</td><td>Componente</td>multimedia</tr><tr><td>CSM-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1019-100</td><td>Componente multimedia</td></tr><tr><td>CSM-LYS-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1035-100</td><td>Componente multimedia</td></tr><tr><td>extracto de levadura</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>peptona</td><td>Research Products International</td><td>P20240-5000</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>bacto-peptona</td><td>BD</td><td>211677</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-2</td><td>Componente de medios</td></tr> levadura <tr><td>base de nitrógeno sin aminoácidos</td><td>BD</td><td>291920</td><td>Componente de</td></tr><tr><td>medios agar</td><td>IBI Scientific IB49172</td><td></td><td>Componente mediático</td></tr><tr><td>Sulfato de adenina</td><td>Sigma</td><td>A3159-25G</td><td>Componente mediático</td></tr><tr><td>Acetato de potasio</td><td>Sigma</td><td>P1190-500G</td><td>Componente mediático</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Componente mediático</td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H8000-100G</td><td>Componente multimedia</td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Sigma</td><td>L8000-25G</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>Lisina</td><td>Sigma</td><td>L5501-25G</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>RNasa I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0601</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>DNasa biotinilada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1906</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>zimolyase 100T (enzima lítica de levadura)</td><td>Sunrise Science</td><td>N0766555</td><td>Enzyme Lector</td></tr> de <tr><td>microplacas</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Apilador de microplacas</td><td>BioTek BioStack3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment Plate llenadora</td><td>BiotTek</td><td>EL406</td><td>Equipment Robot</td></tr><tr><td>de manipulación de líquidos</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>Equipment</td></tr></tbody></table>

proyección de alto rendimiento para la herencia basados en proteína en s. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

La codificación de la información biológica que es accesible a las generaciones futuras se obtiene generalmente mediante cambios en la secuencia de ADN. Herencia longeva codificada en proteínas conformación (en lugar de secuencia) durante mucho tiempo ha sido visto como cambio de paradigma pero rara. Los mejores ejemplos de tales elementos epigenéticos caracterizados son los priones, que poseen un comportamiento uno mismo-montaje que puede conducir la manifestación hereditaria de fenotipos nuevos. Muchos priones arquetípicos mostrar un sesgo de secuencia impactante de N/Q-rico y montan en un doblez amiloideo. Estas características inusuales han informado de más esfuerzos de investigación para identificar nuevas proteínas del prión. Sin embargo, por lo menos tres priones conocidos (incluyendo el fundador del prión, PrPSc) no albergan estas características bioquímicas. Por lo tanto, desarrollamos un método alternativo para probar el alcance de la herencia basados en proteínas, basada en una propiedad de la acción de masas: la sobreexpresión transitoria de las proteínas del prión aumenta la frecuencia en que adquieren una conformación de plantillas de uno mismo. Este artículo describe un método para el análisis de la capacidad de la levadura ORFeome para obtener la herencia basados en proteínas. Usando esta estrategia, hemos encontrado que &gt; 1% de proteínas de levadura podrían impulsar la aparición de rasgos biológicos que duradero, estable y se presentó con mayor frecuencia que la mutación genética. Este enfoque puede ser empleado en alto rendimiento en todo ORFeomes o como un paradigma de proyección específica para redes genéticas específicas o estímulos ambientales. Como pantallas genéticas adelantados definen numerosas vías de señalización y de desarrollo, estas técnicas proporcionan una metodología para investigar la influencia de la herencia basados en proteína en procesos biológicos.

Se sabe que la sobreexpresión de proteínas altera drásticamente los fenotipos celulares27. De hecho, mediante un enfoque de cribado inicial, se recuperaron de forma reproducible cientos de nuevos fenotipos a partir de la sobreexpresión de clones del ORFeoma de levadura utilizando solo diez agentes de estrés. Sin embargo, los ensayos descritos anteriormente permiten evaluar si las células conservan algún fenotipo estable a largo plazo tras esta sobreexpresión. Una p...

Este protocolo describe una metodología de alto rendimiento para funcionalmente basados en proteína herencia en S. cerevisiae.

Proyección de alto rendimiento para la herencia basados en proteína en S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

El objetivo general de este fenotipado de levadura de alto rendimiento es detectar proteínas que provoquen una memoria fenotípica duradera tras una expresión pasajera, como un indicador de herencia basada en proteínas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los priones de levadura, como, cuántas proteínas pueden provocar este tipo de herencia. La principal ventaja de esta técnica es que permite analizar muchas proteínas y vías de manera imparcial.Inicie este procedimiento cultivando las células de levadura apropiadas en una placa de 96 pocillos a 30 grados celsius, como se describe en el protocolo escrito. Inspeccione visualmente los cultivos para confirmar que están saturados; las células deben ser visibles a simple vista en el fondo de cada pocillo. Utilice un robot manipulador de líquidos para preparar placas de 384 pocillos, conteniendo 45 µL del medio adecuado por pocillo.Primero, distribuya Scal-URA en los pocillos de una placa de 384 pocillos. Luego, distribuya Scal-URA más el agente de estrés de interés en los pocillos de una segunda placa; en este experimento se utiliza 20 milimolar de cloruro de manganeso como agente de estrés. En tercer lugar, distribuya SD-URA, que no inducirá la expresión del plásmido, junto con cloruro de manganeso en otra placa.Coloque la placa de 96 pocillos que contiene los cultivos sobre el robot de manipulación de líquidos e inocule un arreglo de uno a cuatro con un microlitro de cada pocillo de la placa de 96 pocillos en cuatro pocillos separados de cada placa de 384 pocillos, que están llenos con un medio diferente. Coloque inmediatamente las placas con las células en un apilador de microplacas a temperatura ambiente y con dióxido de carbono atmosférico. Configure el protocolo para un ciclo continuo de 72 horas, midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros con el lector de microplacas.Después de las mediciones de crecimiento, transfiera un microlitro por pocillo de las culturas inducidas en SCal-URA que experimentaron sobreexpresión proteica a nuevas placas de 384 pocillos, que contienen 45 microlitros por pocillo de medio ST-URA que no permite la expresión proteica del plásmido. En paralelo, realice inoculaciones análogas en un segundo conjunto de placas de 384 pocillos que contienen 45 microlitros por pocillo de ST-URA, a partir de las culturas que se cultivaron en ST-URA en presencia del agente de estrés. Coloque las placas en una cámara humidificada y cultívelas durante 48 horas a 30 grados Celsius hasta alcanzar la saturación.Después de 48 horas, utilice las placas para reinocular un microlitro por pocillo en placas de 384 pocillos que contienen 45 microlitros por pocillo de ST-URA. Luego, realice un reinoculo separado de un microlitro por pocillo desde la misma placa fuente en una placa de 384 pocillos diferente que contenga 45 microlitros por pocillo de ST-URA con el agente de estrés. Coloque inmediatamente las placas con las células del microdispensador a temperatura ambiente y dióxido de carbono atmosférico, y configure el protocolo para un ciclo continuo de 48 horas, midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros con un lector de microplacas.Una vez completidas las mediciones de crecimiento, utilice el software del lector de placas para exportar el tiempo frente a la densidad óptica a 600 nanómetros como una tabla XY. Agrupe las columnas de las mediciones de densidad óptica para cada réplica biológica y calcule la media. Cree un gráfico XY de tiempo frente a densidad óptica a 600 nanómetros para generar las curvas de crecimiento.Para cultivos que presentaron diferencias significativas de crecimiento en respuesta a un estrés determinado, dependiendo de la sobreexpresión de la proteína ancestral, tome un microlitro de cada réplica biológica, dilúyalo en 10 mililitros de agua y luego siembre 50 microlitros en placas que contengan 5-FOA. Incube a 30 grados Celsius durante tres días. Si esto produce demasiadas o muy pocas colonias por placa, ajuste el factor de dilución según sea necesario.De 100 a 200 colonias por placa es ideal. Seleccione de ocho a 32 colonias individuales con palillos de dientes autoclavados e insértelos en placas de 96 pocillos que contengan 150 microlitros de SDCSM por pocillo. Coloque las placas en una cámara humedecida y cultive hasta la saturación durante 48 a 72 horas a 30 grados celsius.Utilice estos cultivos para inocular dos nuevos conjuntos de placas de 96 pocillos que contengan 150 microlitros por pocillo de SDCSM, tanto con como sin el agente de estrés. Coloque las placas en un apilador de microplacas y configure el protocolo para medir la densidad óptica a 600 nanómetros en un ciclo continuo de 48 horas. Después de 48 horas, analice los datos como se mostró anteriormente y confirme que las diferencias significativas en el crecimiento observadas previamente se mantengan tras la pérdida del plásmido.Las células que mantienen los fenotipos inducidos se analizan luego en busca de signos clásicos de herencia basada en proteínas, tal como se describe en el protocolo escrito. Esta prueba de herencia basada en proteínas reveló que la sobreexpresión transitoria del marco de lectura abierto de PSP1 induce una resistencia al cloruro de manganeso que se mantuvo durante cientos de generaciones en las células, mucho después de que la sobreexpresión había cesado. Algoritmos de predicción de priones calificaron el extremo final de PSP1 como moderadamente similar a un prion.En contraste, los algoritmos predijeron prácticamente ninguna característica significativa de secuencia tipo priónica en la mayoría de las proteínas inductoras recuperadas en la pantalla, como lo muestra este análisis representativo. Las mediciones de crecimiento de cepas y SDCSM con cloruro de manganeso, normalizadas a un control negativo correspondiente de PSP1 naïve, indicaron que la inhibición de la desagregasa HSP104 no afecta la resistencia al cloruro de manganeso dependiente de PSP1, mientras que la eliminación de la chaperona HSP70 y del gen PSP1 elimina de forma heredable este fenotipo. Todas las esporas procedentes de tétradas individuales de cruces entre cepas que portan el estado fenotípico dependiente de PSP1 y cepas naïve muestran resistencia al cloruro de manganeso, lo que indica una herencia no mendeliana del fenotipo.Una comparación de la infectividad para la transformación proteica entre lisados de control y lisados que contienen PSP1 como material transmisible mostró que más del 53 % de las células naïve transformadas con PSP1 sembrado adquirieron el fenotipo correspondiente de resistencia al cloruro de manganeso. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un par de semanas, incluyendo los pasos de incubación, y la preparación de la mayor parte de los pasos de cribado puede completarse en menos de dos horas diarias, incluso con un gran número de placas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar planificar exactamente qué se desea probar de antemano y tener en cuenta la escala del experimento.Ahora bien, esto es especialmente importante para quienes comienzan con la técnica. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como los descritos en el protocolo escrito para determinar si los fenotipos observados en el cribado muestran un patrón de herencia verdadero y de tipo priónico. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética exploraran la amplitud de la biología de los priones en *Saccharomyces cerevisiae*. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo diseñar un cribado de alto rendimiento para detectar nuevas formas de herencia basada en proteínas en levaduras, tanto de manera imparcial como dirigida.No olvide que ciertos agentes estresantes químicos, como los agentes que dañan el ADN, pueden ser extremadamente peligrosos, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Aquí se describe una pantalla de la sobreexpresión del plásmido...

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