Tirando de nanotubos de membrana de las vesículas unilaminar gigante

El objetivo general de esta metodología de extracción de nanotubos es estudiar cuantitativamente las interacciones entre proteínas específicas de interés y membranas altamente curvadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología de las membranas celulares, como la endocitosis y el tráfico intracelular. Esta técnica nos permite cuantificar directamente cómo las proteínas se unen a las membranas curvas y las deforman recíprocamente.

Inicialmente, este método se utilizó para medir las propiedades mecánicas básicas de las membranas lipídicas. Recientemente, se ha aplicado para dilucidar mecanismos importantes en las interacciones entre las membranas de las proteínas, en particular las membranas formadoras de proteínas. Comience recogiendo las vesículas unilaminares gigantes directamente de los cables de platino de la cámara de electroformación.

Para construir la cámara experimental, coloque dos cubiertas de vidrio rectangulares separadas por un milímetro sobre una base metálica, dejando aberturas a lo largo de los bordes largos lo suficientemente grandes como para permitir que una punta de micropipeta de vidrio llegue al menos al centro de la cámara. Llene tanto la cámara experimental como una micropipeta de vidrio con cinco miligramos por mililitro de una solución de beta-caseína de alta pureza, teniendo cuidado de evitar burbujas. Mientras se pasiva la cámara, móntela en un microscopio óptico centrado sobre el objetivo e inserte la punta de la micropipeta de aspiración a través de la abertura a lo largo del borde largo hasta que la punta esté por encima del objetivo.

Ajuste el nivel del tanque de agua para que la presión de aspiración sea cercana a cero y llene una micropipeta de inyección con la molécula de interés disuelta en tampón experimental a la concentración experimental adecuada. Monte la micropipeta de inyección dentro de un micromanipulador e inserte la micropipeta a través del otro lado de la cámara experimental. Al final de la incubación, retire la solución de beta-caseína de la cámara y enjuague la cámara varias veces con tampón experimental.

A continuación, añada unos pocos microlitros de solución de vesícula a la cámara, seguidos de unos pocos microlitros de perlas recubiertas de estreptavidina, hasta una concentración final de 0,1 veces 10 a la tasa negativa de perlas del 3% por volumen o menos. Después de que las vesículas y las perlas se hayan asentado en el fondo de la cámara, deje que el tampón experimental se evapore durante unos 15 minutos, momento en el que las vesículas deben ondular visiblemente bajo un microscopio óptico. Cuando las vesículas estén adecuadamente flexibles, aspire las vesículas individuales en la micropipeta hasta que las longitudes de las membranas dentro de la pipeta sean iguales o mayores que el radio de la pipeta.

Cuando se haya identificado una lengua de aspiración del tamaño adecuado, selle los bordes abiertos de la cámara con aceite mineral. Para establecer la posición cero de la presión de aspiración, coloque el extremo de la pipeta de aspiración cerca de un cordón y ajuste la altura del depósito de agua para que el cordón no sea aspirado ni arrastrado por la pipeta. El ajuste de la altura del agua es fundamental para controlar la tensión de la membrana de la vesícula que es aspirada por la micropipeta.

Aspire una vesícula y mueva la micropipeta hacia arriba y fuera de foco sin romper la micropipeta. Con pinzas ópticas, atrape una cuenta a aproximadamente 20 micrómetros del fondo de la cámara. Vuelva a enfocar la vesícula lejos de la cuenta y alineándola con la trampa óptica, y registre el movimiento de la cuenta durante uno o dos minutos para medir la posición de equilibrio.

Reduzca la presión dentro de la micropipeta tanto como sea posible sin perder la vesícula para disminuir la tensión de la membrana, y ponga cuidadosamente la vesícula en contacto con el cordón durante aproximadamente un segundo para establecer los enlaces estreptavidina-biotina. Luego, usando un actuador piezoeléctrico, tire suavemente de la vesícula hacia atrás para crear un nanotubo. Aumente la presión de aspiración para recrear la lengüeta de aspiración y alinee el tubo dentro del eje de la pipeta de aspiración.

Coloque el tubo y la vesícula completamente enfocados, y registre el movimiento de la cuenta a una velocidad de adquisición de 30 hercios y la altura del tanque de agua con respecto a la posición cero durante unos minutos bajo microscopía de campo claro. Cuando se hayan obtenido todas las imágenes, registre nuevamente el movimiento del cordón a diferentes presiones de aspiración y tensiones de membrana. Para inyectar proteínas o moléculas de interés, acerque la micropipeta de inyección al nanotubo, teniendo cuidado de que la perla de la trampa óptica no se perturbe, e inyecte suavemente las proteínas a uno o dos pascales de presión.

Una vez que la unión a proteínas se haya equilibrado, repita las mediciones escalonadas en presencia de las proteínas añadidas, como se demuestra para la membrana desnuda. Las mediciones de fuerza y radio en nanotubos extraídos de vesículas 100% DOPC son independientes, ya que la fuerza se mide a partir del desplazamiento de la perla en la trampa óptica y el radio a partir de la intensidad de fluorescencia, lo que proporciona dos formas de calcular la rigidez de flexión de la membrana. El enriquecimiento relativo de BAR o proteínas de canal de potasio en los tubos de membrana sobre las vesículas subyacentes indica que es más probable que las proteínas se unan a las membranas curvas.

De hecho, la unión de la proteína N-BAR endofilina A2 a la membrana reduce gradualmente la fuerza del tubo a cero, lo que indica la formación de un andamio tridimensional que mantiene el tubo estable. Siguiendo este procedimiento, se pueden combinar otras técnicas para responder a preguntas adicionales, por ejemplo, la microscopía de alta resolución para detectar la organización de proteínas en los tubos de membrana o el seguimiento de una sola partícula para medir la movilidad de las proteínas.