De neuropéptido Y-pHluorin de la proyección de imagen confocal: una técnica para visualizar la exocitosis de gránulos de insulina en islotes humanos y murinos intactos

El objetivo general de este ensayo es visualizar la exocitosis de gránulos de insulina en tiempo real en islotes pancreáticos intactos mediante microscopía confocal. Este método responderá preguntas clave en el campo de la diabetes. Por ejemplo, ¿qué regula la exocitosis de insulina?

Esto es crítico porque la fusión de gránulos es el evento más importante en la vida de una célula beta. La principal ventaja de esta técnica es que podemos utilizar islotes intactos y observar eventos de fusión en células dentro de su entorno natural. Madina Mahkmutova, una estudiante de doctorado de nuestro laboratorio, demostrará la técnica.

Comience, al llegar los islotes pancreáticos, transfiriéndolos a tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugando la suspensión de islotes a 1.000 rpm durante cinco minutos. Los islotes se acumularán en el fondo del tubo; transfiéralos en dos mililitros de medio de cultivo CMRL a placas de Petri de 35 milímetros no tratadas para cultivo de tejidos e incúbelos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas antes de la infección viral. Tras su aislamiento, re-suspenda aproximadamente equivalentes de islotes pancreáticos de ratón en dos mililitros de medio de cultivo CMRL y transfiéralos a placas de Petri de 35 milímetros no tratadas para cultivo de tejidos.

Incube el tejido a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas antes de la infección viral. Para realizar la infección viral, agregue de cinco a 10 microlitros de virus stock a cada placa de Petri de 35 milímetros que contenga islotes humanos o de ratón en dos mililitros de medio de cultivo CMRL. Después de cultivar los islotes durante 24 horas, aspire el medio y reemplácelo con dos mililitros de medio de cultivo CMRL sin virus.

Cultive los islotes durante cuatro a seis días, reemplazando el medio cada tres días. Prepare la solución extracelular combinando los reactivos enumerados aquí y luego esterilice el tampón por filtración. Prepare el medio de glucosa basal hasta una concentración final de glucosa de tres milimolares, agregando 75 microlitros de una solución stock de glucosa dos molar a 50 mililitros de solución extracelular.

Luego, para preparar un medio hiperglucémico con una concentración final de glucosa de 16 milimolares, añada 400 microlitros de una solución stock de glucosa 2 M a 50 mililitros de solución extracelular. Diluya cualquier estímulo adicional y la solución extracelular que contenga tres milimolares de glucosa. Antes de comenzar un experimento, trate previamente las laminillas con 30 microlitros de una solución de poli-d-lisina al uno miligramo por mililitro e incube durante una hora.

Luego, use agua para enjuagar completamente las laminillas. Al menos una hora antes del experimento, transfiera un grupo de islotes a una placa de Petri de 35 milímetros que contenga solución extracelular con tres milimolares de glucosa. Mantenga los islotes restantes a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

30 minutos antes de comenzar un experimento, sujete el cubreobjetos a la cámara de imagen usando grasa de silicona para sellarlo. Luego, fije la cámara de imagen a la plataforma de imagen. A continuación, mediante una pipeta, transfiera de 20 a 30 islotes al área del cubreobjetos tratada con poli-d-lisina y deje que los islotes se adhieran a la superficie durante 20 minutos.

Este paso es fundamental para el éxito del experimento y recolectamos aproximadamente de 20 a 30 islotes en menos de 10 microlitros de tampón y esperamos 20 minutos. Es importante no permitir que la laminilla se seque por completo, para evitar dañar los islotes. Mientras los islotes se adhieren a la laminilla, prepare el sistema de perfusión utilizando agua para enjuagarlo completamente.

Luego agregue cada solución a un canal diferente, según esta tabla. Elimine todas las burbujas del sistema abriendo cada canal por separado y dejando que la solución fluya durante unos minutos. Asegúrese de que el flujo sea constante y de que los tubos no tengan fugas.

A continuación, conecte el calentador de solución en línea al tubo de salida de la perfusión y ajuste la temperatura del tampón que fluye hacia afuera a 37 grados Celsius. Luego, prepare la bomba de succión. Conecte el tubo, encienda la bomba y asegúrese de que el líquido esté siendo aspirado.

Coloque la plataforma de imagen con los islotes sobre la platina del microscopio y conéctela al sistema de perfusión y a la bomba de succión. Luego, llene suavemente la cámara de imagen con la solución extracelular que contiene tres milimolares de glucosa. Para realizar la imagen confocal, localice los islotes en el campo del microscopio con baja magnificación.

Una vez enfocado en los islotes, cambie a objetivos de mayor aumento. Abra el software de adquisición y active el modo de escaneo residente. Seleccione la imagen xyzt y, a continuación, para configurar los parámetros de adquisición, encienda el láser de argón y ajústelo al 30 % y luego la línea láser de 488 nanómetros, ajustando la potencia del láser a aproximadamente el 50 % para la excitación de pHluorina.

Recopile la emisión a 505 a 555 nanómetros, utilizando el espectro de emisión de EGFP como guía. Elija una resolución de 512 por 512 píxeles. Inicie la adquisición de imágenes pulsando el botón de vista en directo y ajuste los niveles de ganancia.

Establezca el extremo inicial del corte en z enfocando la parte superior del islote y seleccionando inicio, luego muévase al último plano que se pueda enfocar y seleccione n. Elija un tamaño de corte en z de cinco micrómetros. Establezca el intervalo de tiempo para la adquisición de cada corte en z cercano a 1,5-2 segundos y seleccione la opción adquirir hasta detener para obtener imágenes continuas.

Luego, presione el botón de inicio para iniciar la adquisición de imágenes. Consulte el protocolo escrito para los protocolos de estimulación que inducen la exocitosis de gránulos. Utilizando el escáner integrado, se adquieren imágenes confocales del islote como grabaciones de lapso de tiempo en menos de dos segundos.

Además, esta técnica puede combinarse con colorantes para imágenes funcionales, como colorantes de potencial de membrana o de calcio libre citosólico. Para determinar si NP Y-pHluorin es realmente una herramienta adecuada para monitorear la dinámica de los gránulos de insulina, los islotes infectados se inmunomarcaron con anticuerpos contra GFP para NP Y-pHluorin y las hormonas de los islotes: insulina, somatostatina o glucagón. La mayoría de las células que expresaban NP Y-pHluorin eran células beta, ya que también expresaban insulina.

Solo unas pocas células alfa positivas para glucagón o células delta positivas para somatostatina estuvieron marcadas con GFP. Importante en las células infectadas, la fusión de NP Y se co-localizó con insulina. Esta figura demuestra que el pHluorin es un sensor de pH eficaz.

Como aumentar el pH intracelular con 50 milimolares de cloruro de amonio resultó en un incremento mayor al 500 % en la fluorescencia intracelular. A medida que el pH dentro del gránulo aumenta al fusionarse con la membrana plasmática durante la apertura del poro de fusión, los gránulos que contienen NP Y-pHluorin se vuelven visibles bajo condiciones que estimulan la exocitosis de insulina, como la despolarización de la membrana con cloruro de potasio. Mediante imágenes confocales de lapso de tiempo de islotes infectados con NP Y-pHluorin, pueden visualizarse eventos secretorios individuales en células beta dentro de islotes intactos.

Estos ocurren en respuesta a la des-polarización directa de la membrana con cloruro de potasio o varios otros estímulos fisiológicos. En la concentración basal de glucosa extracelular, se observa poca actividad secretora. Sin embargo, la fusión de los gránulos con la membrana plasmática se desencadena en respuesta a la estimulación con alta glucosa.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunohistoquímica para responder preguntas adicionales, como por qué la fusión de gránulos ocurre en regiones específicas de la célula. Después de su desarrollo, esta técnica se ha utilizado para explorar el patrón temporal de la secreción de gránulos de insulina en poblaciones de células beta, en islotes humanos.