In Vitro Caracterización de las propiedades electrofisiológicas de las fibras aferentes colónicas en ratas
27 de septiembre de 2017
Función sensorial anormal subyacente visceral del dolor y otros síntomas de enfermedad intestinal inflamatoria y funcional. Aquí se presenta un protocolo para el registro electrofisiológico de los nervios aferentes colónicos en una preparación de colon ex vivo rata.
El objetivo general de este protocolo es demostrar la metodología para el registro electrofisiológico de los nervios sensoriales del colorrecto in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la pluma in vitro, como la contribución de la sensibilidad periférica externa para corregir la hiperalgesia. La principal ventaja de esta técnica es que permite distinguir el colorrecto de forma similar a como se realiza la distinción carotídea in vivo, en animales o en pacientes.
La demostración visual de este método es fundamental porque la localización de los ganglios y la disección de los nervios son relativamente difíciles. Para comenzar este procedimiento, exponga la cavidad abdominal de una rata profundamente anestesiada realizando una incisión en la línea media de la pared abdominal con un bisturí. Después, aparta el mesenterio y otros tejidos para exponer el colorrectal.
Luego, coloque al animal bajo el microscopio de disección. A través de una disección cuidadosa, localice el ganglio pélvico izquierdo e identifique los nervios pélvicos y los nervios esplácnicos lumbares que lo unen. Posteriormente, corta estos nervios a unos milímetros del ganglio pélvico.
La localización del ganglio pélvico y la disección de los nervios es el paso más crítico y difícil de este procedimiento. A continuación, corte el hueso de la sínfisis para exponer el recto. Retire los tejidos por encima del colorrecto y tenga cuidado de dejar intacto el ganglio pélvico.
Después de sacrificar a la rata por inyección intravenosa de una sobredosis de pentobarbital, se secciona el colon unos tres centímetros por encima del ganglio pélvico y se retira el colorrecto del animal con fórceps. Posteriormente, transfiera el colorrecto a una placa de Petri llena de solución Krebs preenfriada. Retire las heces enjuagando suavemente el colon.
A continuación, retire la vejiga urinaria remanente y otros tejidos con cuidado, sin comprometer el ganglio pélvico. En este procedimiento, coloque el colon en una cámara de registro y profuse el tejido continuamente con solución de Krebs carbugenada. A continuación, canula el colorrecto en ambos extremos oral y anal, luego comience la infusión intraluminal del colon con solución salina en la dirección oral a anal, después de eso, ubique el ganglio pélvico principal bajo el microscopio de disección y use alfileres de insectos para exponer el ganglio.
Con una disección cuidadosa, encuentre una rama fina de nervio que emane del ganglio y corra hacia el colon, luego, corte el nervio cerca del ganglio. Antes del siguiente paso, encienda el baño térmico y mantenga la solución Krebs a 34 grados centígrados. Ahora, inspeccione una pipeta de vidrio preextraída bajo el microscopio de disección.
Romper la punta del electrodo con un par de pinzas para que tenga un tamaño compatible con el diámetro del nervio que se va a registrar. A continuación, bisela la punta colocándola cerca de un destello más ligero. Los nuevos en esta metodología también pueden encontrar complicado biselar la punta del electrodo de manera compatible con el tamaño del nervio.
A continuación, coloque el electrodo biselado en el portaelectrodos, luego conecte una jeringa de 10 mililitros al puerto lateral del soporte para la aplicación de presión negativa o positiva al electrodo. Después de eso, conecte el soporte a la etapa principal del bioamplificador y monte la etapa principal en un manipulador. A continuación, mueva el electrodo al baño de tejido y llene el electrodo con la solución de Krebs aplicando una succión suave hasta que entre en contacto con el alambre de plata del soporte.
A continuación, coloque la punta del electrodo cerca del extremo cortado del nervio y aplique presión negativa para succionar el nervio en el electrodo. Luego, aplique más presión negativa, de modo que aproximadamente un milímetro del nervio se introduzca en el electrodo y forme un sello hermético. Ahora, encienda el bioamplificador y configure el filtro entre 300 y tres mil hercios.
Monitoree la señal en el osciloscopio y registre la señal nerviosa y la señal de presión intraluminal en el software de procesamiento de datos de picos. A continuación, aplique la distensión en rampa del colon cerrando el grifo de tres vías en la cánula de salida mientras se infunde continuamente por vía intraluminal. Controle la presión intraluminal hasta que alcance los 60 milímetros de mercurio, luego abra el grifo de tres vías en la cánula de drenaje.
Repita este procedimiento a intervalos regulares de quince minutos y aplique medicamentos extra o intraluminalmente para probar la sensibilidad química de los nervios aferentes. A continuación se muestra la ilustración esquemática de la configuración experimental para la preparación del colorrecto en tubo ex vivo con un registro representativo desde un nervio distal hasta el ganglio pélvico. En las preparaciones de ratas normales, los nervios aferentes del colon suelen tener un nivel bajo de una actividad espontánea regular.
La distensión en rampa del colon induce un aumento gradual en la tasa de disparo. La propiedad mecanosensorial de cada nervio se representa trazando la curva de respuesta nerviosa aferente de presión intraluminal. Alternativamente, el registro se puede realizar a partir de una rama de los nervios pélvicos proximal al ganglio pélvico.
El perfil de la actividad mecanosensorial de los nervios pélvicos proximales suele ser similar al observado en el nervio distal al ganglio pélvico. El análisis de componentes principales de las formas de onda de los potenciales de acción del registro multiunidad se puede realizar para discriminar la actividad de una sola unidad. Aquí están las formas de onda superpuestas de dos aferenas pélvicas individuales.
Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de la anatomía de los ganglios pélvicos principales y los otros nervios y ser capaz de localizar los ganglios para diseccionar los nervios y registrar la actividad aferente. Una ventaja de este protocolo es que puede permitir la comparación de las propiedades electrofisiológicas y los perfiles farmacológicos de los nervios aferentes pélvicos y esplácnicos.
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Descripción general
Este estudio presenta un protocolo para registros electrofisiológicos de nervios sensoriales en el colon y recto mediante una preparación de rata ex vivo. El método tiene como objetivo esclarecer el papel de los nervios aferentes colónicos en el dolor visceral asociado a enfermedades intestinales funcionales e inflamatorias, aportando información fundamental sobre sus propiedades mecanosensoriales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Gastroenterología
Antecedentes
- El dolor visceral está relacionado con una función sensorial anormal en las enfermedades intestinales.
- Los registros electrofisiológicos pueden revelar sensibilidades neuronales y mecanismos del dolor.
- Los métodos existentes no diferencian adecuadamente las contribuciones nerviosas.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método confiable para registrar la actividad nerviosa aferente del colon.
- Evaluar las respuestas mecanosensoriales y las propiedades nerviosas in vitro.
- Facilitar la comprensión de las respuestas neuronales al distensión y a agentes farmacológicos.
Métodos Utilizados
- El estudio utiliza una preparación ex vivo del colon-recto de rata para las grabaciones.
- Los nervios aferentes del colon se disecan a partir del ganglio pélvico para estudiar sus propiedades.
- No se mencionan flujos de trabajo de multiómica.
- Los pasos clave incluyen la exposición quirúrgica, la disección nerviosa y las grabaciones eléctricas mediante un bioamplificador.
Resultados principales
- La grabación de los nervios aferentes distales muestra una baja frecuencia de disparo espontáneo en condiciones normales.
- La distensión colónica provoca un aumento en la frecuencia de disparo, lo que indica la activación de los nervios mecanosensoriales.
- Las pruebas farmacológicas revelan la sensibilidad química de los nervios aferentes.
Conclusiones
- Este protocolo permite un análisis electrofisiológico detallado de las estructuras aferentes del colon.
- Los hallazgos mejoran la comprensión de los mecanismos neuronales que subyacen al dolor visceral relacionado con el intestino.
- Los conocimientos obtenidos podrían tener implicaciones para el desarrollo de tratamientos para enfermedades intestinales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la desestimación mecanicista de dianas del dolor visceral mediante la caracterización de subtipos de fibras aferentes colónicas en un sistema relevante para la enfermedad. Facilita la validación de dianas a través de lecturas electrofisiológicas cuantitativas que diferencian aferentes de umbral bajo, umbral alto y rango dinámico amplio. El enfoque proporciona confianza predictiva para la selección de candidatos analgésicos en modelos de trastornos gastrointestinales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas respecto a las vías del dolor visceral mediante la caracterización específica por subtipos de aferencias.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico al aislar las respuestas aferentes del colon a estímulos mecánicos y químicos.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al distinguir poblaciones de fibras nerviosas con umbrales de activación diferenciales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para evaluar los efectos de compuestos sobre la mecanosensibilidad colónica.
- Valor operativo: Proporciona mediciones estandarizadas y reproducibles de actividad nerviosa multicanal bajo distensión controlada.
- Preparación del ensayo: Permite la evaluación confiable de compuestos mediante la aplicación intraluminal o en baño de agentes de prueba.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Traduccional: Permite la alineación con modelos de enfermedad de trastornos funcionales e inflamatorios del intestino mediante fenotipado aferente.
- Modelo Preclínico: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad para estudiar las diferencias entre aferentes toracolumbares/hipogástricos y lumbosacros/pélvicos.
- Avance Ajustado al Riesgo: Orienta las decisiones de continuar o no continuar basadas en perfiles de activación aferente y sensibilidad farmacológica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la biología del descubrimiento mediante la prueba de hipótesis sobre los mecanismos del dolor visceral y en la selección mediante salidas cuantitativas de respuesta nerviosa.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías y la reducción del riesgo mecanicista de dianas del dolor visceral.
- Cribado: Proporciona preparaciones listas para ensayos con respuestas cuantificables en la frecuencia de disparo aferente a la distensión y a fármacos.
- Análisis: Permite el análisis de componentes principales de las formas de onda del potencial de acción para discriminar la actividad de unidades individuales de las grabaciones multirunitarias.
- Investigación Traductiva: Conecta con la continuidad preclínica mediante la modelización de las propiedades aferentes en estados colónicos normales y patológicos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la caracterización aferente interspecies (rata, ratón, cobayo).
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de dianas mediante la disección mecanicista de subtipos aferentes.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad de los registros electrofisiológicos bajo distensión colónica controlada.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de continuar/descartar candidatos al reducir riesgos biológicos en fases avanzadas en programas de dolor visceral.
- Impacto en el portafolio: Priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en perfiles de activación aferente y sensibilidad química.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos especializados en neuroanatomía y disección quirúrgica del ganglio pélvico y las aferencias colónicas.
- Instrumentación que incluye amplificador bioeléctrico, electrodo de succión, sistema de control de presión y software para el procesamiento de datos de potenciales de acción.
- Requisitos de estandarización entre equipos para el aislamiento de nervios, preparación de electrodos y protocolos de distensión.
- Consideraciones para la adaptación en sistemas modelo, incluyendo ratones y cobayas, y subtipos de aferencias (pélvicas frente a esplácnicas).
- Limitaciones prácticas incluyen la complejidad de la disección y la sensibilidad en el manejo del nervio, lo que afecta la calidad de la señal.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Tissue Collection
2:50
Dissection of the Colonic Afferent Nerves
3:49
Electrophysiological Recording and Testing Colonic Afferent Sensitivity
6:09
Electrophysiological Recording of Rat Colonic Efferent Nerves and Pelvic Nerves
7:27
Conclusion
