Name: In Vitro Caracterización de las propiedades electrofisiológicas de las fibras aferentes colónicas en ratas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprende a registrar la actividad electrofisiológica de nervios aferentes colónicos en preparaciones ex vivo de rata. Este método permite analizar propiedades mecanosensoriales y sensibilidad farmacológica en neurociencia.

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Este protocolo fue apoyado por becas de investigación de la Ciencia Natural la Fundación de China nacional (#31171066, #81270464) y el centro de Ciencias de China-alemán (GZ919).

el protocolo experimental divulgado aquí ha sido aprobado por el Animal ético Comité de Shangai Jiaotong University School of Medicine (# SYXK2013-0050). la disección del colon con intacto ganglio y el nervio tronco tiene un mínimo de 15 minutos para una persona de bastante experiencia en esta técnica. Por lo tanto es necesario mantener el animal vivo pero bajo anestesia profunda y realizar disecciones, para asegurar la viabilidad del tejido para posterior grabación electrofisiológica.
 1. preparación de la solución de perfusión y compuestos de prueba <ol><li>preparar 5 L de solución de Krebs: 113 mM NaCl, KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM de MgSO 4, de 5,9 mM 25 mM NaHCO 3, 1,2 mM CaCl 2 y 11,5 mM de glucosa. Saturar la solución con un 95% O 2 + 5% CO 2 gas mezcla. Pre-enfriar ~ 500 mL de oxigenada Krebs en la nevera.</li>
	<li>Preparar alícuotas de stock prueba compuestos (capsaicina de 1 mM en etanol y 10 mM 5-hidroxitriptamina (5-HT) en solución salina) según sea necesario. Diluir el caldo en Krebs (para aplicación de baño) y en solución salina (para administración intraluminal) a la concentración final justo antes del uso.</li>
</ol> 2. Preparación del electrodo de grabación <ol><li>tire el electrodo de vidrio estándar de grabación tubos sin filamentos internos (1,5 mm de diámetro externo) utilizando un extractor de electrodo convencional. Ajustar la configuración del extractor de calor y tirar de modo que la caña de los electrodos tirados es entre 20 y 25 mm.</li>
</ol> 3. Colección de tejido <ol><li>anestesie la rata profundamente utilizando pentobarbital sódico (80 mg/kg, i.p.). </li> <li>Garantizando esterilidad, exponer la cavidad abdominal al realizar una incisión de línea media de la pared abdominal usando un bisturí. Tire el mesentery y otros tejidos a un lado para exponer la colon.</li>
	<li>Colocar el animal con el microscopio de disección. Mediante disección cuidadosa, localice la izquierda PG e identifique el PN y el LSN lo a. Cortar estos nervios unos milímetros de la pág. 
	Nota: El PG se encuentra cerca de la Unión colon. Por lo general, 3-4 PN de la médula lumbosacra y un proyecto LSN a PG ( figura 1).</li>
	<li>Cortar el hueso sínfisis para exponer el recto. Eliminar los tejidos (es decir, vejiga urinaria, etc.) sobre el colon; Tenga cuidado de dejar intacta la PG.</li>
	<li>Sacrificio de la rata por la inyección intravenosa de una sobredosis de pentobarbital. Transecto de colon unos 3 cm por encima de la PG y quitar el colon del animal usando fórceps.</li>
	<li>Transferir el colon a una placa de Petri con solución de Krebs previamente enfriado. Eliminar las heces enjuagándolo suavemente el colon. Quitar la vejiga remanente y otros tejidos cuidadosamente, sin comprometer la pág.</li>
</ol> 4. Disección de los nervios aferentes colon <ol><li>el colon en una cámara de grabación (20 mL) y perfusión del tejido continuamente con carbogenated solución de Krebs. Ajustar la velocidad de perfusión en 15 mL/min</li>
	<li>Canule el colon en los extremos orales y anales. Comience la infusión intraluminal del colon con solución salina a razón de 10 mL por hora en oral anal dirección.</li>
	<li>Localizar la PG principal bajo el microscopio de disección. Utilizar insectos pasadores para exponer el ganglio. Con disección cuidadosa, encontrar una fina rama del nervio que emana desde el ganglio y corriendo hacia el colon ( figura 1). Cortar el nervio cerca del ganglio. 
	Nota: La figura 1 muestra una grabación de una rama del nervio distal a la PG El nervio contiene probablemente una mezcla de fibras aferentes esplácnicos pélvicas y lumbares. Alternativamente, se puede hacer una grabación de la PN o el LSN proximal a la pág.</li>
	<li>A su vez en el baño de calor y caliente la solución de Krebs para mantener la temperatura de la cámara 34 ± 0.5 ° C.</li>
</ol> 5. Preparación del electrodo de succión <ol><li>tomar una pipeta de vidrio pre-tirado (paso 2) y examine bajo el microscopio de disección. Romper la punta del electrodo con un par de pinzas para que sea de un tamaño compatible con el diámetro del nervio a grabarse.</li>
	<li>La punta en bisel colocando cerca de una encendedor de la llamarada.</li>
</ol> 6. Grabación electrofisiológica <ol><li>Conecte el electrodo del electrodo al portaelectrodo biselado. Conecte una jeringa de 10 mL al puerto lateral en el soporte para aplicar presión positiva o negativa al electrodo de.</li>
	<li>Conecte el soporte a la headstage de la bioamplifier y montar el headstage en un manipulador de.</li>
	<li>Mover el electrodo hasta el baño del tejido y llenar el electrodo con la solución de Krebs aplicando una succión suave, hasta que toque el alambre de plata del titular. Coloque la punta del electrodo cerca del extremo cortado del nervio y aplicar presión negativa para succionar el nervio en el electrodo. Aplicar presión más negativa para que ~ 1 mm del nervio se tira en el electrodo y forma un sello apretado.</li>
	<li>Vuelta en el bioamplifier y el filtro de 300-3.000 Hz. monitorizar la señal en el osciloscopio y graba la señal del nervio (frecuencia de muestreo de 20 kHz) y la señal de presión intraluminal (frecuencia de muestreo de 100 Hz) utilizando un ordenador con un procesamiento de datos de punto software.</li>
</ol> 7. Determinar la sensibilidad aferente colon <ol><li>aplicar distensión de rampa del colon por cerrar el grifo de tres vías en la cánula de salida al mismo tiempo continuamente intraluminally. Monitorear la presión intramural hasta 60 mmHg, momento en el que abrir el grifo de tres vías en la cánula de drenaje.</li>
	<li>Repetir este procedimiento cada 15 minutos aplicar medicamentos adicionales o intraluminally para probar la sensibilidad química de los nervios aferentes.</li>
</ol>

<ol><li>Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+basis+of+visceral+pain%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Biological basis of visceral pain: recent developments.</a> Pain. 96 (3), 221-225 (2002).</li>
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<li>Nullens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Recording+of+Mesenteric+Afferent+Nerve+Activity+in+Mouse+Jejunal+and+Colonic+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li>
<li>Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jejunalafferent+nerve+sensitivity+in+wild-type+and+TRPV1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice.</a> J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).</li>
<li>Brierley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+chemosensory+function+and+receptor+expression+of+splanchnic+and+pelvic+colonic+afferents+in+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice).</a> J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).</li>
<li>Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).</li>
<li>La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+expression+of+transient+receptor+potential+channel+V1%2C+transient+receptor+potential+channel+A1+and+mechanosensitive+two+pore-domain+K%2B+channels+between+the+lumbar+splanchnic+and+pelvic+nerve+innervations+of+mouse+urinary+bladder+and+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon.</a> Neuroscience. 186, 179-187 (2001).</li>
<li>Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+processing+of+noxious+colonic+input+by+thoracolumbar+and+lumbosacral+dorsal+horn+neurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat.</a> J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

El protocolo presentado aquí es un método experimental relativamente sencillo para determinar las propiedades electrofisiológicas de las aferentes colon de ratas. El protocolo (de disección del tejido para configurar la grabación de nervio) generalmente toma aproximadamente 2 horas para completar. Tejido (paso 3) y preparación de la toma de aspiración (paso 5) son los pasos críticos. Es crucial para poder localizar el PG, el LSN y el PN y tenga cuidado de no para dañar el ganglio y nervios durante la disección del tejido...

El tracto gastrointestinal (TGI) es ricamente inervado con nervios aferentes extrínsecos que trasmiten las señales sensoriales del intestino al sistema nervioso central y que contribuyen a la interacción del intestino-cerebro. Excitabilidad alterada de estos aferentes extrínsecas, así como procesamiento central alterada de las entradas aferentes, es la base visceral del dolor y otros síntomas de afecciones GI, incluyendo enfermedades de intestinos inflamatoria y funcional1. Información sensorial desde el colon se transmite principalmente a través de toracolumbar/hipogástrico y los nervios sacrolumbares pélvica (PN)2. Ha habido un creciente interés en el estudio de las propiedades electrofisiológicas de estas fibras aferentes primarias en modelos de roedores de la enfermedad. Sin embargo, en vivo grabaciones electrofisiológicas de los aferentes colon en los roedores es un desafío técnico y requiere considerables habilidades quirúrgicas. Además, cambios hemodinámicos, el movimiento de tejido y anestésicos también pueden afectar actividad del nervio y sensibilidad a la prueba estímulos en vivo. Por lo tanto, en los últimos años, un creciente número de estudios ha empleado en vitro (ex vivo) preparados de diferentes especies, incluyendo ratones, ratas, conejillos de Indias y los seres humanos, a examinar los mecanismos de transducción sensorial en colon aferentes y la excitabilidad alterada en condiciones de enfermedad. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
Principalmente se han reportado dos tipos de ex vivo de colon preparación: la preparación de la "hoja plana"5,9,10 y el "tubo" preparación3,4. Un video protocolo para la preparación de colon murino "hoja plana" ha sido previamente publicado11. En el presente Protocolo, el colon de ratón, con el PN) o los nervios esplácnicos lumbares (LSN) Unidos, es cosechada y sobrefundido en una cámara de tejido. El colon es abrir longitudinalmente, y el paquete del nervio que se extiende en un compartimiento de grabación llenado de aceite de parafina. Actividad del nervio es registrada mediante un electrodo monopolar de platino-iridio. El protocolo permite la identificación de los campos receptivos de las fibras aferentes individuales mediante el uso de estimulación eléctrica imparcial. Localiza la aplicación de estímulos químicos, así como la aplicación de paradigmas de estimulación mecánica diferentes (por ejemplo, focal mucosa sondeo y estiramiento circunferencial), a las terminaciones nerviosas aferentes. Debido a que el nervio debe ampliarse a una cámara separada de la cámara de tejido, es crítico para mantener el nervio conectado relativamente largo; la disección exitosa de los nervios plantea un desafío a los nuevos a esta metodología. Más recientemente, Nullens et al. publicó un protocolo de vídeo para la grabación en vitro de los aferentes mesentéricas yeyunal murino y segmentos colónicos12. En la preparación de este "tubo", el segmento de intestino con el mesenterio Unido se mantiene intacto, lo que permite la distensión gradual y la administración intra y extra luminal de diferentes productos químicos. Puesto que el nervio del mesenterio se registra utilizando un electrodo de succión, que puede colocarse cerca del tejido, se puede grabar actividad aferente a pesar de que el nervio del mesenterio es relativamente corto. Sin embargo, el nervio de mesenterio consiste en poblaciones mixtas de fibras aferentes vagales y espinales que inervan el yeyuno o toracolumbar hipogástrica. Lumbosacra pélvicos aferentes inervan el colon, que no puede ser discriminado en el presente Protocolo. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el registro electrofisiológico de aferentes colon de rata mediante la preparación de colon "tubo" con un PG intacto Este método puede permitir la caracterización de las propiedades funcionales de lumbar esplácnico (hipogástrica) y aferentes pélvico lumbosacra.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Shanghai Westang Bio-Tech</td><td>B558</td><td></td></tr><tr><td>Capsaicina</td><td>Sigma</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de electrodos</td><td>MicroData Instrument Inc</td><td>PMP107</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Neurolog (Bioamplificador)</td><td>Digitimer, Ltd</td><td>Convertidor</td> A/D del sistema <td></td>Neurolog</tr><tr><td></td><td>Cambridge Diseño Electrónico</td><td>Micro1401</td><td></td></tr><tr><td>Software de procesamiento de datos</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Spike2 versión 6</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de plata</td><td>World Precision Instruments</td><td>EP12</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de vidrio World</td><td>Precision Instruments</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Portaelectrodos</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH3SBW</td><td></td></tr><tr><td>Baño calefactor</td><td>Grant</td><td>GR150</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Leica</td><td>Zoom2000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>World Precision Instruments</td><td>PZMIII-BS Encendedor de cigarrillos</td> cualquier NA Herramientas quirúrgicas <td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres de insectos</td><td>hechos en casa con alambre de acero inoxidable de 0,1 mm</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Manipulador de tres vías <td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>KITF-R</td><td></td></tr><tr><td>Ratas</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td>Se puede utilizar cualquier cepa/sexo.</td></tr></tbody></table>

in vitro caracterización de las propiedades electrofisiológicas de las fibras aferentes colónicas en ratas

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Disfunción de los nervios sensoriales colónicas ha sido implicada en la fisiopatología de varias condiciones comunes, incluyendo la diabetes y las enfermedades de intestino inflamatorias y funcional. Aquí, describimos un protocolo para la caracterización en vitro de las propiedades electrofisiológicas de los aferentes de colon en ratas. El colon, con el ganglio pélvico intacto (PG) adjuntado, se retira de la rata; sobrefundido con carbogenated solución de Krebs en la sala de grabación; y canulado en los extremos orales y anales para permitir la distensión. Se identifica un paquete del nervio fino que emana de la PG, y la actividad reciente del nervio aferente se registra utilizando un electrodo de succión. Distensión del segmento colónico provoca aumentos graduales en descarga multiunit. Se realiza un análisis de componentes principales para diferenciar el bajo umbral, el umbral alto y las fibras aferentes de rango dinámico ancho. Sensibilidad química de los aferentes colónicos puede ser estudiada a través de la administración baño o intramural de prueba compuestos. Este protocolo puede modificarse para su aplicación a otras especies, tales como ratones y conejillos de Indias y para estudiar las diferencias en las propiedades electrofisiológicas de los aferentes hipogástrica/toracolumbar y lumbosacra pélvica del colon descendente en normal y condiciones patológicas.

La figura 1 es la ilustración esquemática de la disposición experimental para la preparación de colon ex vivo "tubo", con un representante de la grabación de un nervio distal a la PG El nervio contiene probablemente una mezcla de aferentes esplácnicos pélvicos y lumbares. En preparaciones de ratas normales, los nervios aferentes colon suelen tienen un bajo nivel de actividad espontánea irregular. Distensión de la rampa del colon provoca un aumento gr...

Función sensorial anormal subyacente visceral del dolor y otros síntomas de enfermedad intestinal inflamatoria y funcional. Aquí se presenta un protocolo para el registro electrofisiológico de los nervios aferentes colónicos en una preparación de colon ex vivo rata.

In Vitro Caracterización de las propiedades electrofisiológicas de las fibras aferentes colónicas en ratas

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

El objetivo general de este protocolo es demostrar la metodología para realizar registros electrofisiológicos de nervios sensoriales del colon y recto in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave in vitro en el campo, como la contribución de la sensibilidad eferente periférica externa a la hiperalgesia correcta. La principal ventaja de esta técnica es que permite distinguir el colon y recto de manera similar a como se realiza la distinción carotídea in vivo, en animales o en pacientes.La demostración visual de este método es fundamental porque localizar los ganglios y diseccionar los nervios es relativamente difícil. Para comenzar este procedimiento, exponga la cavidad abdominal de una rata profundamente anestesiada realizando una incisión media en la pared abdominal utilizando un escalpelo. Posteriormente, retire el mesenterio y otros tejidos para exponer el colonrecto.Luego, coloque el animal bajo el microscopio de disección. Mediante una disección cuidadosa, localice el ganglio pélvico izquierdo e identifique los nervios pélvicos y los nervios esplácnicos lumbares que se unen a él. Posteriormente, corte estos nervios a unos pocos milímetros de distancia del gan

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra un método para registrar la actividad de los nervios aferentes colónicos en un colon de rata ex-vivo, canulado en ambos extremos e infundido con solución salina para aumentar la presión intraluminal. A medida que aumenta la presión, la señal nerviosa aumenta, lo que indica su estimulación.

Registro electrofisiológico de nervios aferentes colónicos en un colon de rata ex vivo

Este video muestra el proceso de registro de señales eléctricas de nervios aferentes mesentéricos en un segmento yeyuno de ratón disecado para estudiar los efectos de la presión tisular y los cambios de movimiento en la actividad de los nervios aferentes.

Registro de la actividad del nervio aferente mesentérico en un segmento de yeyuno de ratón ex vivo

Este video muestra una grabación de una sola fibra de la conducción nerviosa de la fibra C en ratas. Se incide una incisión en una rata anestesiada para exponer el nervio ciático, que proporciona suministro sensorial y motor a las extremidades inferiores. A continuación, se exponen las fibras C individuales. La estimulación eléctrica se proporciona mediante electrodos de estímulo implantados en el pie, y se registra una respuesta a partir de una sola fibra nerviosa.

Registro in vivo de fibras C del nervio ciático en ratas

Fuente: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Imágenes del sistema nervioso entérico. J. Vis. Exp.  (2015)Este video muestra el calcio imágenes para visualizar y analizar la actividad de las neuronas entéricas y la glía en preparaciones de plexo mientérico colónico de ratón.

Imágenes de calcio de las actividades de las neuronas entéricas y la glía en un plexo mientérico colónico de ratón

Demostramos un protocolo de cultivo celular para el estudio directo de los componentes neuronales y gliales del sistema nervioso entérico. Se prepara un cultivo mixto de neurona/glía en cubreobjetos a partir del plexo mientérico de un ratón adulto, lo que proporciona la capacidad de examinar la función individual de las neuronas y la glía mediante electrofisiología, inmunohistoquímica, etc.

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparación de las neuronas entéricas aisladas y células gliales del plexo mientérico del ratón adulto

Este video demuestra un protocolo para realizar registros electrofisiológicos de una sola fibra en una preparación in vitro del nervio colorrectal de ratón.

In vitro Caracterización funcional de ratón colorrectal aferente Endings

Los nervios aferentes mesentéricos transmiten información desde el tracto gastrointestinal hacia el cerebro con respecto a la homeostasis normal, así como a la fisiopatología. La actividad del nervio aferente gastrointestinal se puede evaluar mediante el montaje de segmentos intestinales aislados con nervios aferentes adjuntos en un baño de órganos, aislando el nervio y evaluando la actividad basal y estimulada.

In Vitro de grabación de la actividad nerviosa aferente mesentérica en ratón yeyunal y segmentos del colon

La excitabilidad axonal técnicas proporcionan una poderosa herramienta para analizar la fisiopatología y los cambios biofísicos que preceden acontecimientos degenerativos irreversibles. Este manuscrito muestra el uso de estas técnicas en el nervio cubital de ratas anestesiados.

En Vivo Medición electrofisiológica del nervio cubital con la excitabilidad Axonal prueba rata

La grabación de una sola fibra es una técnica electrofisiológica eficaz que es aplicable a los sistemas nerviosos central y periférico. Junto con la preparación de DRG intacto con el nervio ciático adjunto, se examina el mecanismo de falla de conducción. Ambos protocolos mejoran la comprensión de la relación del sistema nervioso periférico con el dolor.

Uso de la grabación de una sola fibra In Vivo y el ganglio de raíz dorsal intacto con nervio ciático adjunto para examinar el mecanismo de falla de conducción

Responder a las señales de alimentos o medicamentos por pares aumenta a lo largo de un período de abstinencia y esto puede relacionarse con una mayor susceptibilidad a las conductas recaída. Aquí detallamos un procedimiento para la evaluación de esta "incubación del deseo" en las ratas que se han auto-administrado sacarosa.

Un método general para la evaluación de incubación de sacarosa en ratas Deseo

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