Cultivo In Vivo-como astrocitos murinos mediante el protocolo AWESAM rápido, sencillo y barato

El objetivo general de este procedimiento es producir in vivo monocultivos similares a los astrocitos utilizando un método sencillo, rápido y económico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la astroglibiología, como cuáles son los aspectos económicos de la liberación física o la absorción de astrocitos. La principal ventaja de esta técnica es que las células resultantes se parecen mucho a los astrocitos in vivo por la morfología, la expresión de ARNm y proteínas, y las fluctuaciones intercelulares de calcio.

Para comenzar este procedimiento, prepare el área de disección colocando dos placas de Petri de 10 cm llenas de medio de disección sobre hielo en una campana de disección de flujo laminar. Para cada área del cerebro que se va a aislar, prepare un tubo de 15 mL lleno de 14 mL de medio de disección y manténgalo en hielo. A continuación, rocíe las herramientas de disección con etanol al 70% y colóquelas junto al microscopio de disección en la campana.

Si se trabaja con tejido embrionario, primero se extraen los embriones del útero y se abren los sacos embrionarios. Inmediatamente, corta las cabezas con unas tijeras. Cuando se hayan cortado todas las cabezas, transfiéralas a un medio de disección preenfriado.

Una vez que las cabezas estén sumergidas en el medio, abra la piel y el cráneo con fórceps y pellizque el cerebelo. Luego, con cuidado, haga palanca con el resto del cerebro hacia arriba y fuera del cráneo. Después de eso, separa la corteza de la estructura subyacente del cerebro medio.

Coloque las pinzas dentro de la fisura longitudinal entre los hemisferios y muévalas entre la corteza y las estructuras del mesencéfalo de un hemisferio para pellizcar cada hemisferio y liberarlo. Posteriormente, retire todas las meninges de cada hemisferio y separe el hipocampo. Si se requieren los astrocitos del hipocampo, transfiera cada hipocampo a un tubo de 15 mL lleno de 14 mL de medio de disección en hielo.

Después de eso, corte cualquier tejido cortical que se utilizará para generar astrocitos en pedazos de no más de un mililitro cúbico. A continuación, recoja todos los trozos de tejido cortical en un tubo separado de 15 ml lleno de medio de disección en hielo. Una vez que se hayan recogido todos los trozos de tejido, espere a que se asienten en el fondo del tubo.

A continuación, aspire la mayor cantidad de medio posible. A continuación, añada 2-3 mL de 0,05% de tripsen EDTA e incube las muestras en un baño de agua a 37 grados centígrados durante veinte minutos. A continuación, aspire cuidadosamente el tripsen EDTA dejando los trozos de tejido en una cantidad mínima de líquido en el fondo del tubo.

A continuación, agregue 5 ml de medio de disección preenfriado para lavar el EDTA tripsen restante y pipetee al costado del tubo superior para lograr la mezcla de las piezas de tejido. A continuación, aspire el medio de disección y deje los trozos de tejido en la menor cantidad de líquido posible. Repita este paso de lavado con un medio de disección preenfriado dos veces.

Después del último paso de lavado, agregue 1 mL de D-Mem Plus a temperatura ambiente y triture el tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo sin introducir burbujas. Los astrocitos son bastante sensibles al pH, por lo que es importante evitar la producción de burbujas, ya que esto puede cambiar el pH de la solución. A continuación, coloque un filtro de células de 100 micras en la abertura de un tubo de 50 ml y humedezca previamente el filtro con 4,5 ml con D-Mem Plus preenfriado.

Pipetee 1 mL de la suspensión de tejido disociado en el filtro de células y agregue otros 4,5 mL de D-Mem Plus preenfriado para lavar las células a través de él. El séptimo día in vitro después de la disección, colocar las placas de 10 cm con células en D-Mem Plus en un agitador de la incubadora y agitar las placas a 110 RPM durante 6 horas. De 20 a 30 minutos antes del final de las seis horas de agitación, precalentar 1 XPBS, D-Mem Plus, NB+H y 0,25%tripsen EDTA a 37 grados en el baño de agua.

Después de 6 horas de agitación, retire las placas de cultivo de la coctelera y reemplace inmediatamente el medio con 10 mL de 1 XPBS precalentado por placa. A continuación, se retira el PBS y se añaden 3 mL de tripsen EDTA precalentado por plato. A continuación, incubar las muestras durante cuatro minutos a 37 grados centígrados.

Si prepara muestras para la secuenciación de Western Blot o ARN, no añada Tripsen EDTA. En su lugar, reemplace el PBS con 12 mL de NB + H precalentado, después de lo cual los cultivos se pueden volver a colocar en la incubadora. A continuación, agregue 5 ml de D-Mem Plus precalentado a 3 ml de tripsen EDTA en cada plato.

Pipetea las células de la placa y recoge la suspensión celular en un tubo de 50 ml. Después de eso, centrifugar la suspensión celular a 3220 veces G a 20 grados Celsius durante 4 minutos. A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el paladar celular en 1 mL de NB+H precalentado.

Estas imágenes muestran que los astrocitos ausam transducidos por G-camp exhiben eventos espontáneos de iones de calcio a través de las redes de astrocitos, incluso en los procesos delgados. Aquí, una onda de iones de calcio viaja a través de varios astrocitos de izquierda a derecha en las imágenes de distintos puntos de tiempo, donde el color claro representa áreas de altas concentraciones de iones de calcio y las áreas negras representan regiones extracelulares. En este gráfico, la concentración de iones de calcio cambia en las regiones codificadas por colores a lo largo del tiempo, que se muestran como trazas de intensidad fluorescente de campo G, lo que ilustra cómo una onda de señalización de iones de calcio se propaga a través de varios astrocitos.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora y quince minutos si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la obtención de imágenes de células vivas en combinación con experimentos de transfección o transducción viral, para responder a preguntas adicionales, como qué eventos ocurren en las membranas de los astrocitos. Después de ver este vídeo, deberías tener una buena comprensión de cómo preparar in vivo como los cultivos motores de astrocitos de una manera sencilla, rápida y económica.