En Vivo Detección y análisis de la sumoilación de la proteína Rb en células humanas

El objetivo general de este experimento es detectar la sumoilación de las proteínas del retinoblastoma en condiciones endógenas y exógenas en células humanas. Las proteínas de la familia de los pequeños modificadores relacionados con la ubiquitina, o SUMO, se conjugan con los residuos de lisina de las proteínas diana para regular diversos procesos celulares. Por lo general, es más difícil iniciar una SUMOilación de proteínas en las células debido a la complejidad de la SUMOilación in vivo.

Este experimento detecta la SUMOilación de proteínas Rb endógenas y exógenas. Aunque este método puede proporcionar información sobre la SUMOilación de las proteínas Rb, también es apropiado para la detección de muchas otras proteínas diana de SUMO en las células. Para comenzar, agregue 25 mililitros de DMEM que contengan un uno por ciento de estreptomicina de penicilina e incube las células HEK293 a 37 grados Celsius durante 72 horas.

Lave las células de la placa con tres mililitros de PBS helado. Luego transfiera las células a un nuevo tubo de cinco mililitros. Para obtener células de fase G1 al final del proceso de sincronización G0, retire el DMEM y vuelva a añadir un medio de crecimiento fresco, permitiendo así que las células HEK293 vuelvan a entrar en el ciclo celular.

A continuación, recoja las células en diferentes fases G1 para el análisis del ciclo celular y el posterior ensayo SUMO. Para sincronizar las células HEK293 en la fase S, utilice el método de bloqueo de timidina doble. Primero, haga crecer las células HEK293 hasta una confluencia del 50%Luego lave las células con PBS precalentado.

Añadir medio de crecimiento suplementado con timidina 2,5 milimolares durante 18 horas como primer bloque. Retire el medio que contiene timidina y lave las células dos veces con PBS precalentado. Agregue medio de crecimiento fresco durante 14 horas para liberar las células del bloque.

Después de liberar las células del primer bloque, deseche el medio con una pipeta. A continuación, añadir medio de crecimiento suplementado con timidina 2,5 milimolares durante otras 18 horas como segundo bloque antes de realizar un análisis del ciclo celular y de la SUMOilación de Rb. Para la sincronización de la fase G2 o M, coloque aproximadamente 15 millones de células HEK293 en una placa de 15 centímetros con 25 mililitros de medio de crecimiento y crezca durante 24 horas.

A continuación, añade nicotisol al medio hasta obtener una concentración final de 400 nanogramos por mililitro. Finalmente, incubar las células durante 16 horas antes de realizar el análisis del ciclo celular por citometría de flujo como se describe en el protocolo de texto. Lisar las células HEK293 sincronizadas resuspendiéndolas suavemente en un mililitro de tampón de lisis con tampón de radioinmunoprecipitación helada, o RIPA, que contiene un inhibidor de isopeptidasa recién añadido para bloquear las proteasas SUMO y estabilizar los conjugados SUMO.

Homogeneice aún más las células en hielo pasándolas a través de una aguja de calibre 21 conectada a una jeringa de dos mililitros 10 veces. A continuación, incubar las células en hielo durante cinco minutos. A continuación, centrifugar los lisados celulares a 18000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.

Después de la centrifugación, transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. A los sobrenadantes, añadir un microgramo de inmunoglobulina G de ratón inespecífica de la misma especie e isotipo que el anticuerpo monoclonal Rb. Además, agregue 20 microlitros de lechada de 50 por ciento de proteína AG, luego incube la mezcla durante una hora a cuatro grados centígrados con una rotación suave.

Centrifugar las muestras a tres mil veces g durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Recoja cuidadosamente los sobrenadantes sin alterar las perlas y transfiéralos a nuevos tubos de microcentrífuga de un punto cinco mililitros. A cada una de las muestras, agregue cinco microlitros de anticuerpo primario rb y 40 microlitros de 50 por ciento de proteína ag seriforme, luego incube las muestras durante la noche a cuatro grados centígrados con una rotación suave.

Después de centrifugar, lavar las perlas con un mililitro de tampón rifa. Mezclar bien los tubos rotando a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, recoja las perlas por centrifugación a baja velocidad como antes y deseche los sobrenadantes.

Después de realizar el lavado cuatro veces, vuelva a suspender las perlas en 30 microlitros de un x tampón de carga de electroforesis en gel de poliaquilaminida de dodecalsulfato de sodio y mezcle bien. Incubar los tubos a 100 grados centígrados en un bloque de calor durante 10 minutos. Centrifugar las muestras a 12 mil veces g durante un minuto para pellet las perlas.

Finalmente, recoja cuidadosamente los sobrenadantes sin alterar las perlas y transfiéralos a tubos de microcentrífuga de cinco mililitros. Realice la transfección de cultivos celulares y la lisis celular de las células HEK293 como se describe en el protocolo de texto. A continuación, lave 25 microlitros de perlas de ágoros de ácido nicrolotriacético de níquel al 50 por ciento con tampón ripa en un tubo de microcentrífuga de cinco mililitros de un punto para cada muestra.

Recoja las perlas por centrifugación a tres mil veces g durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Agregue un molar de emitozol a cada muestra para obtener una concentración final de 10 milimolares. A continuación, añada cada muestra al tubo que contiene las cuentas de ágoros preparadas.

Incubar las perlas y los lisados durante dos horas a cuatro grados centígrados con una rotación suave. A continuación, gire las cuentas a tres mil veces g durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, retire con cuidado los sobrenadantes mediante pipeta.

Para evitar la pérdida de cordones, no aspire los cordones en seco. A continuación, lave las perlas con un mililitro de tampón de lavado que contenga 20 milimolares de emitozol. Mezcle bien los tubos rotando a cuatro grados centígrados durante 15 minutos antes de recoger las cuentas girando.

Después del lavado final, agregue 30 microlitros del tampón eleusiano que contiene 250 milimolares de emitozol a cada muestra y mezcle para mezclar. A continuación, incubar las muestras durante 20 minutos a cuatro grados centígrados para eluir las proteínas. Mezcle cada muestra con seis búferes de carga de páginas SDS.

Luego incube los tubos a 100 grados centígrados en un bloque de calor durante 10 minutos. Después de la centrifugación, cargue las muestras de inmunoprecipitación o extracción en geles de página SDS con un gradiente del cuatro al 20 por ciento. Realice la electroforesis a 120 voltios durante 90 minutos para separar las proteínas.

Después de la sincronización del ciclo celular y la inmunoprecipitación de las especies endógenas rb, la presencia de la señal SUMO fue detectada específicamente por un anticuerpo anti SUMO one en la fase G1 temprana. Los resultados representativos muestran la SUMOilación forzada de la proteína rb mediante la fusión directa de la enzima SUMO E2 UBC9 a su terminal C. Obsérvese la proteína rb SUMOilada que migra más lentamente.

Mediante el uso del mutante deficiente en SUMO de rb, K720R, se confirma aún más la presencia de SUMOilación de rb en las células. Por lo tanto, en este procedimiento, muchas otras proteínas diana de SUMO se pueden analizar en células cultivadas. En la mayoría de los casos, solo una porción muy pequeña de un sustrato está SUMOilada, por lo tanto, al intentar este procedimiento, es importante optimizar la eficiencia de la inmunoprecipitación.