El intestino C. elegans como modelo una morfogénesis Lumen intercelular y En Vivo biogénesis de la membrana polarizada a nivel unicelular: etiquetado de anticuerpos, ARNi pérdida-de-función análisis y proyección de imagen de

El objetivo general de esta combinación de métodos estándar es demostrar cómo se puede utilizar el intestino de C. elegans para el análisis in vivo de la biogénesis de la membrana polarizada y la morfogénesis del lumen a nivel unicelular y subcelular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de polaridad y biogénesis, como cómo se establecen y mantienen los dominios de membrana apical frente a los basolaterales y otras asimetrías subcelulares durante y después de la morfogénesis. La principal ventaja de este sistema modelo es que esta sola capa transparente de solo 20 células puede sobrevivir in vivo a la cámara de tejido para diseccionar la membrana polarizada de una sola célula y la biogénesis del lumen.

Las técnicas se pueden extender al análisis de otros fenotipos de morfogénesis de C.Elegans, el enfoque aquí está en el análisis de la biogénesis de la membrana, específicamente en la biogénesis de la membrana apical y el lumen. Los procedimientos incluyen técnicas de imagen refinadas en animales fijos y vivos para distinguir los dominios de membrana y los componentes subcelulares y para identificar los fenotipos de morfogénesis de la luz en un intestino de C. elegans. Este vídeo sobre tubulogénesis intestinal se acompaña de un vídeo sobre tubulogénesis del canal excretor modelos mutuamente informativos donde se realiza el análisis in vivo de la biogénesis de membranas polarizadas.

Con respecto al marcaje, la generación de animales transgénicos con proteínas de fusión marcadas con fluorescencia para imágenes en vivo se describe en el video adjunto sobre el análisis de la tubulogénesis del canal excretor. Estos animales pueden utilizarse directamente en experimentos de ARNi. La tercera generación suele ser el primer paso en esta combinación de procedimientos.

Este video comienza con el método de etiquetado alternativo, la tinción de anticuerpos, para la cual los animales deben ser fijados. Los diferentes procedimientos de marcaje pueden combinarse con la inmunohistoquímica que se suele utilizar para el análisis final de las imágenes. Este protocolo también tiene ejemplos de marcadores de membrana específicos del intestino, promotores y otros recursos útiles para ambos procedimientos de etiquetado.

Después de demostrar la inmunohistoquímica, en este vídeo se utiliza una cepa transgénica que marca la membrana apical intestinal con ERM-1 GFP para buscar los fenotipos de polaridad y morfogénesis de la luz mediante ARNi. Primero prepare un portaobjetos para fijar los gusanos. Pipetee 30 microlitros de poli-L-lisina en un portaobjetos y luego coloque un segundo portaobjetos en el otro y colóquelos juntos para esparcir la solución uniformemente sobre ambos.

Ahora despegue los dos portaobjetos y déjelos secar al aire durante 30 minutos. A continuación, coloque un bloque plano de metal en un recipiente lleno de nitrógeno líquido. Lave las placas con solución M9 y transfiera unos 10 microlitros de M9 que contienen los gusanos.

Alternativamente, elija los gusanos y agregue M9 al portaobjetos. Una vez que los gusanos se transfieren, deje caer suavemente un cubreobjetos transversal sobre ellos, de modo que el cubreobjetos cuelgue un borde. A continuación, presione suavemente el cubreobjetos sin realizar ningún movimiento lateral.

Ahora transfiera inmediatamente el portaobjetos al bloque de metal en nitrógeno líquido y deje que se congele. Después de cinco minutos, retire el cubreobjetos con el borde que sobresale. Hazlo rápidamente para conseguir la grieta adecuada de la cutícula.

A continuación, sumerja el portaobjetos en un frasco de vidrio Coplin lleno de metanol a menos 20 grados centígrados. Después de cinco minutos, transfiera el portaobjetos a un frasco de vidrio Coplin lleno de acetona durante otros cinco minutos a la misma temperatura. Los portaobjetos se pueden teñir directamente o almacenar a menos 20 grados centígrados.

Retire el portaobjetos de la acetona y déjelo secar al aire a temperatura ambiente. A continuación, marque la ubicación de una pared circular de vaselina en la parte inferior del portaobjetos y luego construya la pared de gelatina. No frote la gelatina durante este procedimiento.

A continuación, prepare una cámara húmeda en un recipiente con toallas de papel húmedas y coloque la corredera en una rejilla interior. No debe haber contacto entre las toallas y el tobogán o entre los toboganes adyacentes. Ahora pipetee suficiente PBS en el círculo de gelatina para cubrir el área.

Coloque suavemente la punta de una pipeta en el borde del círculo y permita que el líquido se disperse suavemente sobre los gusanos. Luego cierre la tapa y espere cinco minutos. Después de cinco minutos, incline el portaobjetos y aspire lentamente el PBS, teniendo cuidado de no perder gusanos del portaobjetos.

A continuación, rellene con cuidado el círculo de gelatina con una solución de bloqueo recién preparada. Y deje que el portaobjetos se incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, reemplace la solución de bloqueo con una solución de bloqueo que contenga el anticuerpo primario.

E incubar el portaobjetos a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, retire el anticuerpo primario y lave el portaobjetos aplicando y retirando la solución bloqueante tres veces. Deje que cada aplicación en bloque se incube durante 10 minutos.

A continuación, agregue el anticuerpo secundario diluido en solución bloqueante e incube el portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, lave el portaobjetos dos veces con solución de bloqueo y luego una vez con PBS. A continuación, retire la mayor cantidad posible de PBS sin permitir que la muestra se seque y retire con cuidado la gelatina alrededor de la muestra.

Aplique una gota de medio de montaje sobre la muestra, seguida de un cubreobjetos y un sello de esmalte de uñas. A continuación, guarde las diapositivas en la oscuridad a cuatro grados centígrados. Transfiera la placa de la biblioteca de ARNi de menos 80 grados Celsius a hielo seco.

Retire la cinta de sellado. Y transfiera el clon de interés a una barrena selectiva. A continuación, saca el clon y haz crecer las bacterias durante la noche.

Antes de devolver la placa de la biblioteca al congelador a menos 80 grados centígrados, aplique cinta de sellado nueva. Al día siguiente, inocule las colonias de la placa en alícuotas de un mililitro de medio líquido que contenga ampicilina. Luego agítalos durante unas 14 horas a 37 grados centígrados.

Al día siguiente, siembra 200 microlitros por clon en placas de ARNi separadas. Deje que las placas se sequen e induzca la producción de ARNi con una incubación nocturna a temperatura ambiente. Un día después, transfiera cinco gusanos de la etapa L4 a cada placa de ARNi marcada con el gen específico al que se dirige.

Luego, transfiera las placas a una incubadora, generalmente a 20 grados centígrados. En primer lugar, examine los animales de control frente a los de ARNi bajo luz brillante con aumentos bajos y altos. A continuación, examine los animales de control frente a los de ARNi bajo luz fluorescente bajo los filtros adecuados.

Escanee sistemáticamente una placa con animales de ARNi desde la parte superior izquierda hasta la parte inferior derecha de toda la placa en busca de fenotipos. Busca animales de interés. Para un examen más detallado de los fenotipos de ARNi seleccionados, concéntrese en el intestino y utilice el zoom para evaluar los fenotipos de tubulogénesis y morfogénesis de la luz.

Para examinar los gusanos de interés bajo microscopía confocal, primero móntelos e inmovilícelos a mano, haga un círculo delgado de grasa al vacío o vaselina en un portaobjetos de vidrio. La capa de grasa debe ser fina, no más gruesa que 0,1 milímetros. A continuación, añade unos 3,5 microlitros de azida de sodio de 10 milimolares en el centro del círculo.

A continuación, recoja rápidamente los gusanos de interés en la solución bajo un microscopio de disección antes de que la solución se seque. A continuación, aplique suavemente un cubreobjetos y obtenga una imagen de los animales en 30 minutos. Use una presión leve y bajo el microscopio verifique que los gusanos no estén flotando en la solución.

Bajo el microscopio confocal, encuentre los gusanos a baja potencia y enfoque. A continuación, utilice un objetivo de inmersión en aceite de 60 o 100X para ver e obtener imágenes del intestino. A continuación, examine al animal bajo luz fluorescente con el canal apropiado para seleccionar áreas que muestren el defecto celular de interés.

Muévete rápidamente para evitar el blanqueo de las fotos. A continuación, cambie al escaneo láser y restrinja la imagen al intestino estableciendo límites de escaneo en su lado dorsal y ventral. Capture una serie de imágenes y, posteriormente, combine las imágenes en una sola imagen de proyección.

Este protocolo describe cómo analizar molecularmente y diseccionar visualmente la biogénesis de la membrana polarizada en el intestino de C. elegans en desarrollo, donde la membrana apical y la morfogénesis del lumen coinciden. Los dominios de la membrana apical y basolateral, las uniones asociadas a la membrana y la luz intestinal pudieron resolverse y su relación entre sí pudo examinarse a lo largo del desarrollo. Estos componentes subcelulares podrían marcarse mediante anticuerpos marcados con fluorescencia o proteínas de fusión fluorescente para el doble o triple marcaje, como se describe en el artículo adjunto.

Los defectos macroscópicos de la luz se pueden escanear rápidamente mediante el uso de un microscopio de fluorescencia de disección. El enlazador de citoesqueleto de membranas apicales ERM-1 acoplado a GFP es un marcador de expresión robusta útil para un cribado de ARNi. Al utilizar este marcador, se descubrió una serie de nuevos fenotipos de morfogénesis y polaridad de la luz intestinal, junto con sus defectos genéticos subyacentes.

A continuación, se utilizaron imágenes de mayor aumento adquiridas por un escaneo láser confocal para examinar más detenidamente los fenotipos y comprender mejor los defectos subyacentes. Se podrían cuantificar algunos fenotipos. La cuantificación se utilizó para comparar dichos defectos y seguir su progresión a través del desarrollo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar los compartimentos de la membrana intestinal y la endomembrana mediante inmunotinción y cómo analizar la función, los fenotipos de ARNi de la membrana polarizada y la biogénesis del lumen.