Name: El intestino C. elegans como modelo una morfogénesis Lumen intercelular y En Vivo biogénesis de la membrana polarizada a nivel unicelular: etiquetado de anticuerpos, ARNi pérdida-de-función análisis y proyección de imagen de (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Aprende a analizar la biogénesis de membranas polarizadas y la morfogénesis del lumen en el intestino de C. elegans usando técnicas de ARN de interferencia e inmunohistoquímica. Este método permite estudiar procesos celulares in vivo a nivel unicelular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Mario de Bono (MRC laboratorio de Biología Molecular, Cambridge, Reino Unido), Kenneth J. Kemphues (Cornell University, Ithaca, Estados Unidos), Michel Labouesse (Institut de Biologie Paris Seine, Université Pierre et Marie Curie, París, Francia), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, Francia) y el CGC, financiado por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440), para las cepas y los anticuerpos. Este trabajo fue financiado por subvenciones NIH GM078653, MGH es 224570 223809 SAA a V.G.

<ol><li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cells+to+organs%3A+building+polarized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">From cells to organs: building polarized tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 887-901 (2008).</li>
<li>Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/56101/the-c-elegans-excretory-canal-as-model-for-intracellular-lumen">The C. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell.</a> JoVE. , (2017).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+execution+of+the+epithelial+polarity+programme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization and execution of the epithelial polarity programme.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (4), 225-242 (2014).</li>
<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+protein+sorting%2C+targeting+and+distribution+in+polarized+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 833-845 (2008).</li>
<li>Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+core+mechanisms+to+generate+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adaptation of core mechanisms to generate cell polarity.</a> Nature. 422, 766-774 (2003).</li>
<li>Goldstein, B., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PAR+Proteins%3A+Fundamental+Players+in+Animal+Cell+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">The PAR Proteins: Fundamental Players in Animal Cell Polarization.</a> Dev. Cell. 13 (5), 609-622 (2007).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+vesicular+trafficking+in+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of vesicular trafficking in epithelia.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (3), 233-247 (2005).</li>
<li>Zegers, M. M., O'Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends Cell Biol. 13 (4), 169-176 (2003).</li>
<li>Tepass, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+apical+polarity+protein+network+in+Drosophila+epithelial+cells%3A+regulation+of+polarity%2C+junctions%2C+morphogenesis%2C+cell+growth%2C+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The apical polarity protein network in Drosophila epithelial cells: regulation of polarity, junctions, morphogenesis, cell growth, and survival.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 655-685 (2012).</li>
<li>Shivas, J. M., Morrison, H. A., Bilder, D., Skop, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+and+endocytosis%3A+reciprocal+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarity and endocytosis: reciprocal regulation.</a> Trends Cell Biol. 20 (8), 445-452 (2010).</li>
<li>Bryant, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+network+for+de+novo+generation+of+the+apical+surface+and+lumen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A molecular network for de novo generation of the apical surface and lumen.</a> Nat. Cell Biol. 12 (11), 1035-1045 (2010).</li>
<li>Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apicobasal+domain+identities+of+expanding+tubular+membranes+depend+on+glycosphingolipid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Apicobasal domain identities of expanding tubular membranes depend on glycosphingolipid biosynthesis.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1189-1201 (2011).</li>
<li>Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+and+AP-1+regulate+apical+polarity+and+lumen+formation+during+C.+elegans+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Clathrin and AP-1 regulate apical polarity and lumen formation during C. elegans tubulogenesis.</a> Development. 139 (11), 2071-2083 (2012).</li>
<li>Asan, A., Raiders, S. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+C.+elegans+Intestine+Involves+Axon+Guidance+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the C. elegans Intestine Involves Axon Guidance Genes.</a> PLoS Genet. 12 (4), e1005950(2016).</li>
<li>Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10588867">Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine.</a> Dev. Biol. 216 (1), 114-134 (1999).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.wormatlas.org/hermaphrodite/intestine/Intframeset.html">Alimentary system, intestine.</a> WormAtlas. , (2009).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56 (1), 110-156 (1977).</li>
<li>Rasmussen, J. P., English, K., Tenlen, J. R., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+and+morphogenesis+of+single-cell+tubes+in+the+C.+elegans+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch signaling and morphogenesis of single-cell tubes in the C. elegans digestive tract.</a> Dev. Cell. 14 (4), 559-569 (2008).</li>
<li>Maduro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Gut development in C. elegans.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2017).</li>
<li>McGhee, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans intestine.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (3), 347-367 (2013).</li>
<li>Pásti, G., Labouesse, M. Epithelial junctions, cytoskeleton, and polarity. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2014).</li>
<li>Sato, K., et al. C. elegans as a model for membrane traffic. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2014).</li>
<li>Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumen+morphogenesis+in+C.+elegans+requires+the+membrane-cytoskeleton+linker+erm-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1.</a> Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).</li>
<li>Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+the+cell+cortex%3A+the+role+of+ERM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4366476">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li>
<li>Shakes, D. C., Miller, D. M. 3rd, Nonet, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22226520">Immunofluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 107, 35-66 (2012).</li>
<li>JS, D. uerr Immunohistochemistry. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>T, S. tiernagle Maintenance of C. elegans. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+Putative+RNA-Directed+RNA+Polymerase+RRF-3+Makes+C.+elegans+Hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the Putative RNA-Directed RNA Polymerase RRF-3 Makes C. elegans Hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12 (15), 1317-1319 (2002).</li>
<li>Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+siRNA-degrading+RNase+negatively+regulates+RNA+interference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans.</a> Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).</li>
<li>Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2006).</li>
<li>Maddox, A. S., Maddox, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+cellular+processes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).</li>
<li>Netherlands, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F978-1-4020-6754-9_11479">Nomarski Differential Interference Contrast Microscopy</a>. , Springer. Netherlands. (2008).</li>
<li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%3A+a+method+for+superresolution+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 6, 498-520 (2013).</li>
<li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 356-369 (2002).</li>
<li>Lee, Y. U., Son, M., Kim, J., Shim, Y. H., Kawasaki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDC-25.2%2C+a+C.+elegans+ortholog+of+cdc25%2C+is+essential+for+the+progression+of+intestinal+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">CDC-25.2, a C. elegans ortholog of cdc25, is essential for the progression of intestinal divisions.</a> Cell Cycle. 15 (5), 654-666 (2016).</li>
<li>Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+electron+microscopy+methods+for+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Modern electron microscopy methods for C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 93-149 (2012).</li>
<li>Shi, A., Grant, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+recycling+endosomes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of recycling endosomes in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 130, 181-198 (2015).</li>
<li>Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , 
 <a target="_blank" href="http://cbs.umn.edu/cgc/home">http://cbs.umn.edu/cgc/home</a> (2017).</li>
<li>Wormbase. , 
 <a target="_blank" href=" http://www.wormbase.org/"> http://www.wormbase.org/</a> (2017).</li>
<li>McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org.">http://www.wormbook.org.</a> (2007).</li>
<li>Transgeneome website. , 
 <a target="_blank" href="https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html">https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html</a> (2017).</li>
<li>C. elegans expression pattern. , 
 <a target="_blank" href="http://gfpworm.org/">http://gfpworm.org/</a> (2017).</li>
<li>National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , 
 <a target="_blank" href="https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/">https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/</a> (2017).</li>
<li>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB). , 
 <a target="_blank" href="http://dshb.biology.uiowa.edu">http://dshb.biology.uiowa.edu</a> (2017).</li>
<li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li>
<li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Este protocolo describe cómo combinar estándar pérdida de función genética/ARNi y proyección de imagen (Etiquetadoras y microscópicos) enfoques para aprovechar el epitelio intestinal C. elegans como modelo para la disección molecular y visual de en vivo membrana y luz polarizada de la biogénesis.
Etiquetado
Este protocolo se centra en anticuerpos. In situ el etiquetado por los anticuerpos es una alternativa altamente espec...

La generación de las asimetrías celulares y subcelulares, tales como la formación de dominios de membrana polarizada, es esencial para la morfogénesis y la función de las células, tejidos y órganos1. Los estudios en la biogénesis de la membrana polarizada en epitelios siguen siendo un desafío técnico, puesto que los cambios de dirección en la asignación de componentes subcelulares dependen de múltiples consecutivas coincidentes extracelulares e intracelulares señales y que son difíciles de separar en la mayoría de los modelos y depende fuertemente del sistema de modelo. El modelo presentado aquí - la sola capa intestino elegans de Caenorhabditis - es un tejido de exquisita sencillez. Junto con la sola célula C. elegans excretor canal (ver acompañando a papel en la biogénesis de la membrana polarizada en el canal excretor de C. elegans ) de2, ofrece varias ventajas únicas para la identificación y caracterización de moléculas requeridas para la biogénesis de la membrana polarizada. La conservación de señales de polaridad molecular de levaduras al hombre hacer este simple órgano invertebrado un excelente"en vivo cámara de tejido" para responder preguntas sobre la polaridad epitelial que son de interés directo para el sistema humano, que es todavía demasiado complejo para permitir la disección visual de estos eventos en el solo nivel en vivode la célula.
Aunque múltiples señales de polaridad conservado de (1) la matriz extracelluar (2) la membrana plasmática y sus uniones y tráfico vesicular (3) intracelular han identificado3, los principios subyacentes de su integración en el proceso de biogénesis de la membrana y el tejido epitelial polarizada es mal entendido4. Los modelos de unicelular clásica en vivo (e.g.S. cerevisiae y C. elegans zygote) han sido fundamentales en la definición de los principios de división de célula polarizada y polaridad antero-posterior y han identificado importantes polaridad de membrana asociados determinantes (las pequeñas GTPasas/CDC-42, las igualdades de la partición defectuosa)5,6, pero dependen única simetría romper señales (cicatriz del brote, la entrada de esperma) y carecen de seguro de cruce Dominios de membrana apicobasal y, probablemente, el correspondiente apicobasal intracelular maquinaria de clasificación. Nuestros conocimientos actuales sobre la organización del tráfico polarizado de epitelios, sin embargo, principalmente se basa en monocultivos 2D mamíferos7, que carecen de señales extracelulares y de desarrollo fisiológicos que pueden cambiar la posición de la membrana Dominios y direcciones de las trayectorias de la trata de personas (un cambio de 2D a 3D en vitro sistemas de cultivo solo basta para invertir la polaridad de la membrana en las células MDCK (riñón canino Madin-Darby))8. Inicialmente se realizaron in vivo del desarrollo estudios en polaridad epitelial en los organismos modelo de invertebrado en epitelios planos, por ejemplo en la epidermis de Drosophila melanogaster , donde identificó la contribución crítica dinámica de cruce para la migración de la célula polarizada y célula de movimiento de la hoja9y endocíticas trata de polaridad mantenimiento10. El 3D en vitro y en vivo análisis de la morfogénesis de lumen en epitelios tubulares en las células MDCK y en el intestino de C. elegans , respectivamente, han identificado recientemente el requisito del tráfico intracelular de de Novo dominio (apical) y biogénesis de lumen y posicionamiento11,12,13. El grosor del tubular (frente plano) células epiteliales es una ventaja para el análisis 3D de asimetrías subcelulares puesto que permite una distinción visual superior de la membrana apical lumenal, ensambladuras apico lateral, la membrana lateral y el posiciones de los organelos intracelulares. A estas ventajas visuales, el modelo de C. elegans añade el ajuste en vivo , eje del desarrollo, transparencia, simplicidad de plan corporal, linaje de la célula invariable y definida, analítico (genética) y ventajas adicionales que se describen a continuación.
C. elegans sí mismo es un nemátodo de estructura tubular cuya transparencia y arquitectura simple hace sus órganos internos además tubulares directamente accesible al análisis visual de la morfogénesis del tubo y del lumen. Las veinte células de su intestino (células de 21 o 22 en ocasiones)14 se derivan de una célula del progenitor único (E) y desarrollo de un epitelio de dos capas por un paso de intercalación en un tubo bilateral simétrico de nueve anillos INT (cuatro células en la primer anillo; Figura 1 esquema)14,15,16. Análisis de linaje y el tejido del intestino, inicialmente determinado por óptica Nomarski mediante identidades nuclear17y posteriormente por microscopía de fluorescencia a través de membranas marcadas, ha proporcionado penetraciones críticas en su morfogénesis, en particular los requisitos célula autónoma y celular no autónomos para sus divisiones de célula direccionales y movimientos (p. ej., intercalación, asimetrías de derecha a izquierda, rotación del tubo anterior y posterior)14,18 . Especificación de células endodérmicas temprano y la red reguladora genes controlan el desarrollo de este órgano modelo clonal son bien caracterizado19,20. Aquí, sin embargo, se trata en el análisis de membrana polarizada y biogénesis del lumen de las células tubulares y de las asimetrías intracelulares de endomembranas, citoesqueleto estructuras y organelos que acompañan este proceso. El análisis se facilita por la simplicidad de este tubo, donde todas las membranas apicales (en el nivel ultraestructural por microvellosidades) ante la luz y todas las membranas basales frente a la superficie externa del tubo, con membranas laterales toquen, separada de la membrana apical por uniones (esquema de lafigura 1 , ver referencias (16,21) para C. elegans-organización específica de apretado y componentes de ensambladura de los adherens). Biogénesis de la membrana apical es coincidente con la morfogénesis del lumen. Además, el tamaño de las células intestinales adultos - las células más grande de este pequeño animal (con excepción de la célula excretora) - aproximar el tamaño de una célula mamífera, permitiendo el seguimiento visual en vivo de los elementos subcelulares, p. ej. trayectorias de la vesícula, que suele ser intentaron en vitro en una placa de cultivo.
Con el propósito de este análisis celular y subcelular, etiquetado adecuado es fundamental. Dominios de membrana intestinal endo o plasma, ensambladuras, citoesqueletolas estructuras, los núcleos y otros organelos subcelulares pueden ser visualizados por sus componentes moleculares específicos de etiquetado. Muchos componentes se han caracterizado y siguen a descubrirse (tabla 1 da algunos ejemplos y se refiere a los recursos). Por ejemplo, varias moléculas de distinción de los compartimentos del Sistema endomembranoso intestinal, tubulares o vesiculares de la ER al Golgi vía vesículas post-Golgi a la membrana plasmática, han sido identificados22. El específico proteínas (como los lípidos y azúcares) pueden bien etiquetarse directamente, o indirectamente a través de las proteínas. Este protocolo se centra en situ tinción de anticuerpos de muestras fijas, una de dos técnicas de etiquetado estándar (consulte el documento adjunto en canal excretor tubulogenesis para una descripción de los otros técnica2 - en vivo de etiquetado a través de fusiones de la proteína fluorescente - que es directamente aplicable al intestino; Tabla 2 proporciona ejemplos de promotores específicos del intestino que pueden utilizarse para impulsar la expresión de estas proteínas de fusión en el intestino). Doble o múltiples etiquetado con cualquier enfoque o con una combinación de ambos plus adicional química coloración, permite una mayor resolución visual detallada y el examen de los cambios espaciales y temporales en la localización y contratación de la específico las moléculas o de los componentes subcelulares (figura 2). La fijación y tinción de los procedimientos descritos en esta preservación de soporte de protocolo de la proteína fluorescente verde (GFP) etiquetado durante el procedimiento de inmunotinción. Para la proyección de imagen, principales puntos de la detección y caracterización de los fenotipos mediante procedimientos microscópicos (microscopía de fluorescencia confocal y disección) son tubulogenesis describe ()figura 3, 4). Estos pueden ampliarse a enfoques, por ejemplo superresolution transmisión y microscopía microscopía electrónica (no descrita aquí) la proyección de imagen de resolución más alta.
Una fuerza de este sistema es la capacidad de analizar la polaridad de las células individuales en diferentes etapas de desarrollo, de la embriogénesis hasta la edad adulta. Por ejemplo, biogénesis de la membrana apical dominio y luz pueden ser rastreada a lo largo desarrollo en el nivel unicelular mediante etiquetado con ERM-1, un enlazador de membrana muy conservada-actina de Ezrin-Radixin-moesina familia23,24 . ERM-1 visualiza la biogénesis de la membrana apical (1) durante la morfogénesis del tubo embrionario, cuando se produce concomitantemente con división de célula polarizada y migración (movimiento de las células apicalmente alrededor del lumen durante intercalación)15; (2) durante la última extensión del tubo embrionario y larval que procede en ausencia de división celular o la migración; y (3) en el intestino adulto, donde los dominios de membrana polarizada se mantienen (figura 1). En el epitelio larvas poste-mitotic creciente, de nuevo polarizado membrana biogénesis se puede separar así de morfogénesis de tejidos polarizados, que no es posible en modelos de polaridad epitelial más en vivo y en vitro , los unicelulares resolución (por ejemplo el 3D MDCK quiste modelo8) incluidos. Con el etiquetado de los demás componentes, esta configuración proporciona la oportunidad (especialmente en la etapa larval L1 cuando las células tienen una mayor relación citoplasma/núcleo) distinguir los cambios intracelulares que son específicos de polarizado (de la biogénesis de la membrana por ejemplo, la reorientación de las trayectorias de la trata de personas) de los concomitante para la migración y división de célula polarizada.
La versatilidad genética de C. elegans es conocida25y es un sistema potente para el análisis molecular de cualquier cuestión biológica. Un estudio sobre morfogénesis, por ejemplo, puede empezar con una cepa de tipo salvaje, una cepa transgénica donde la estructura de interés (por ejemplo, una membrana) se etiqueta con un marcador fluorescente, o con un mutante de la pérdida o ganancia de función con un defecto en este estructura. Un típico estudio genético inverso puede generar a un mutante en el gen de interés se elimina en el germline (e.g. por una eliminación específica), modificado por mutagénesis (suelen producir mutaciones puntuales con la consiguiente pérdida, reducción o aumento en la función del gen), o que su transcripción es reducido por RNAi. La facilidad de RNAi por alimentación en C. elegans26 también se presta al diseño de pantallas específicos que examinan un grupo de genes de interés. Podría decirse que mayor fortaleza de un organismo modelo genético es la capacidad para llevar a cabo en vivo adelante pantallas (por ejemplo, mutagénesis, sistemáticas o genoma pantallas de RNAi) que permitan una investigación imparcial en la causa molecular de un fenotipo de interés. Por ejemplo, una visual imparcial RNAi C. elegans tubulogenesis pantalla, a partir de un animal transgénico con membranas apicales marcada con 1 ERM, descubrió una interesante conversión reversible polaridad intestinal y fenotipo lumen ectópico, utilizado aquí como un ejemplo de este tipo de análisis. Esta pantalla denominará el agotamiento de los glicoesfingolípidos (GSLs; lípidos de membrana obliga, identificados a través de sus enzimas biosintéticas para el GLS) y componentes de la clatrina de capa de la vesícula y su adaptador AP-1 los defectos moleculares específicos que causan esta polaridad fenotipo de conversión, de tal modo caracterizar estos trata de moléculas en vivo señales de polaridad de la membrana apical y lumen posicionamiento12,13. Cuando a partir de un fenotipo de la mutación genética específica/morfogénesis, esas pantallas (o experimentos de interacción genética/ARNi sola) también pueden examinar las interacciones funcionales entre dos o varios genes de interés (ver acompañando a papel en el excretor canal para obtener un ejemplo de dicho análisis)2. Este protocolo se centra en ARNi que, además de su capacidad para identificar directamente el gen cuya pérdida provoca el fenotipo en las pantallas hacia adelantadas, proporciona ventajas específicas para el análisis de la morfogénesis. Desde productos de gen dirigir morfogénesis a menudo trabajan de manera dependiente de la dosis, ARNi generalmente es exitoso en la generación de un espectro de fenotipos. La capacidad de generar fenotipos de pérdida parcial de función informativos también ayuda a resolver el problema que la mayoría de los genes tubulogenesis importantes es esencial y que sus pérdidas causan esterilidad y mortalidad embrionaria temprana. Este protocolo incluye estrategias de RNAi condicionales para superar esta dificultad y sugiere formas para optimizar la generación de un espectro más amplio de fenotipos, como una serie alélica producida por mutagénesis.

<table><tbody><tr><td><Tinción > anticuerpos</</td>poli-L-lisina ><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>fuerte Sigma</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-213-612</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo</td><td>Sigma</td><td>MT409-1BTL</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpos primarios</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MH27 (ratón)</td><td></td><td></td><td>Concentración: 1:20 Recursos: Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas.</td></tr><tr><td>MH33 (ratón)</td><td></td><td></td><td>Concentración: 1:10 Recursos: Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas.</td></tr><tr><td>anti-ICB4 (conejo)</td><td></td><td></td><td>Concentración: 1:5 Recursos: Un regalo de Mario de Bono (Consejo de Investigación Médica, Inglaterra)</td></tr><tr><td>anti-PAR-3 (conejo)</td><td></td><td></td><td>Concentración: 1:50 Recursos: Un regalo de Kenneth J. Kemphues (Universidad de Cornell)</td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpos secundarios</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Floor 568 (anti-conejo)</td><td>ABCam</td><td>AB175471</td><td>Concentración: 1:200</td></tr><tr><td>Cy5 (anti-ratón)</td><td>Life technologies</td><td>A10524</td><td>Concentración: 1:200</td></tr><tr><td>TRITC (anti-conejo)</td><td>Invitrogen</td><td>T2769</td><td>Concentración: 1:200</td></tr><tr><td>FITC (anti-ratón)</td><td>Sigma</td><td>F9006</td><td>Concentración: 1:100</td></tr><tr><td>Productos químicos</td><td></td><td></td><td></td>marcados</tr><tr><td>Texas Red-Phalloidin</td><td></td><td></td><td>Concentración: 1:100 Recursos: Sondas moleculares-T7471</td></tr><tr><td>Materiales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grasa al vacío Silicona</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>4448</td><td></td></tr><tr><td>(22x22-1)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans relacionados</fuerte></td><td></td><td></td><td>Consulte la referencia29 para conocer los procedimientos estándar de cultivo y mantenimiento de C. elegans.</td></tr><tr><td><fuerte>LB Medio y placas</fuerte></td><td></td><td></td><td>ver referencia29 para protocolos.</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de Levadura</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A0116</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912</td><td></td></tr><tr><td>M9 Medio</fuerte></td><td></td><td></td><td>ver referencia29 para protocolos.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>NGM placas</td><td></td><td></td><td>ver referencia29 para protocolos.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Peptona</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>placas de ARNi</td><td></td><td></td><td>consulte la referencia30 para los protocolos.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Peptona</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biológico</td><td>I8500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2648</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Hipoclorito de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td>Bacterias</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 bacterias</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 bacterias</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bibliotecas de ARNi de todo el genoma Biblioteca de alimentación de ARNi de todo el genoma de Ahringer (ref 30,49,50)</td><td>Fuente: BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans Biblioteca de alimentación ORF-RNAi (ref51)</td><td>Fuente: BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging related</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9221-500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscopio de disección</td><td>Nikon</td><td>SMZ-U</td><td></td></tr><tr><td>microscopio de disección equipado con un accesorio de fluorescencia estereoscópica de alta potencia (Kramer Scientific), cámara CCD con software de captura Q y lámpara fluorescente X-Cite (Photonic Solutions)</td><td>Microscopio</td> confocal de barrido láser Olympus <td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Confocal de barrido</td> láser <td>Leica Microsystem</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>montado en un ECLIPSE Ti-E invertido microscopio</td><td>Nikon</td><td>C2</td><td></td></tr></tbody></table>

el intestino c. elegans como modelo una morfogénesis lumen intercelular y en vivo biogénesis de la membrana polarizada a nivel unicelular: etiquetado de anticuerpos, arni pérdida-de-función análisis y proyección de imagen de

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Tubos pluricelulares, unidades fundamentales de los órganos internos todo, están compuestos de células epiteliales o endoteliales polarizadas, con apicales membranas que recubren el lumen y basolateral membranas en contacto con uno a y la matriz extracelular. Cómo esta asimetría de membrana distintivo es establecida y mantenida durante la morfogénesis de órganos sigue siendo una cuestión sin resolver de la biología celular. Este protocolo describe el intestino de C. elegans como modelo para el análisis de la biogénesis de la membrana polarizada durante la morfogénesis del tubo, con énfasis en la biogénesis de la membrana y lumen apical. El C. elegans veinte células sola capa epitelio intestinal se arregla en un simple tubo bilateralmente simétrico, permitiendo análisis a nivel unicelular. Polarización de la membrana ocurre concomitante con división de célula polarizada y migración durante la embriogénesis temprana, pero de nuevo polarizado biogénesis de la membrana continúa a lo largo de crecimiento larvario, cuando las células no proliferan y moverán. El último ajuste permite separar cambios subcelulares que intervienen simultáneamente estos diferentes procesos polarizantes, difíciles de distinguir en la mayoría de los modelos polaridad. Apical, basolateral membrana-, Unión-, citoesqueleto- y endomembranoso componentes pueden etiquetados y seguimiento en todo el desarrollo de proteínas de la fusión de GFP o evaluados por en situ tinción de anticuerpo. Junto con versatilidad genética del organismo, el intestino de C. elegans proporciona así una única en vivo modelo de lo visual, desarrollo y el análisis genético molecular de la membrana polarizada y biogénesis de tubo. Los métodos específicos (estándares) aquí descritos incluyen cómo: etiquetar intestinales componentes subcelulares mediante tinción de anticuerpo; analizar genes involucrados en la biogénesis de la membrana polarizada por pérdida de función estudios adaptados a los genes tubulogenesis por lo general esenciales; evaluar defectos de polaridad durante las diferentes etapas del desarrollo; interpretar fenotipos por epifluorescencia, contraste de interferencia diferencial (DIC) y microscopía confocal; cuantificar los defectos visuales. Este protocolo puede adaptarse para analizar cualquiera de las moléculas a menudo altamente conservadas implicadas en la polaridad epitelial, biogénesis de la membrana, tubo y lumen morfogénesis.

Este protocolo describe cómo visualizar morfogénesis biogénesis y lumen de la membrana polarizada en el intestino de C. elegans , a nivel subcelular y celular solo y analizar molecularmente. Las veinte celdas sola capa C. elegans intestino está formado por dirigida la división celular y la migración durante la embriogénesis mediados. En esta membrana polarizada, tiempo establecidos dominios todavía de novo biogénesis de la membrana polarizada continúa en la pero...

La transparente C. elegans intestino puede servir como una"en vivo cámara de tejido" para el estudio de apicobasal membrana y lumen biogénesis a nivel unicelular y subcelular durante tubulogenesis multicelulares. Este protocolo describe cómo combinar etiquetas estándar, genética/pérdida de función RNAi y enfoques microscópicos para diseccionar estos procesos a nivel molecular.

El intestino C. elegans como modelo una morfogénesis Lumen intercelular y En Vivo biogénesis de la membrana polarizada a nivel unicelular: etiquetado de anticuerpos, ARNi pérdida-de-función análisis y proyección de imagen de

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

El objetivo general de esta combinación de métodos estándar es demostrar cómo el intestino de C.elegans puede utilizarse para el análisis in vivo de la biogénesis de membranas polarizadas y la morfogénesis del lumen a nivel celular único y subcelular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de polaridad y biogénesis, como cómo se establecen y mantienen los dominios de membrana apical frente a basolateral y otras asimetrías subcelulares durante y después de la morfogénesis. La principal ventaja de este sistema modelo es que esta capa transparente compuesta únicamente por 20 células puede sobrevivir in vivo en una cámara tisular para analizar la biogénesis de membranas polarizadas y del lumen a nivel de célula individual.Las técnicas pueden extenderse al análisis de otros fenotipos de morfogénesis en C. elegans; aquí el enfoque está en el análisis de la biogénesis de membranas, específicamente en la biogénesis de la membrana apical y del lumen. Los procedimientos incluyen técnicas mejoradas de imagen en animales fijados y vivos para distinguir dominios de membrana y componentes subcelulares, así como para identificar fenotipos de morfogénesis del lumen en el intestino de C. elegans. Este video sobre tubulogénesis intestinal va acompañado de un video sobre tubulogénesis del canal excretor, modelos mutuamente informativos para el análisis in vivo de la biogénesis de membranas polarizadas.Con respecto a la etiquetado, se describe en el video adjunto la generación de animales transgénicos con proteínas de fusión marcadas con fluorescencia para imágenes en vivo, sobre el análisis de la tubulogénesis del canal excretor. Dichos animales pueden utilizarse directamente en experimentos de ARNi. La tercera generación es típicamente el primer paso en esta combinación de procedimientos.Este video comienza con el método alternativo de etiquetado mediante tinción con anticuerpos, para el cual los animales deben fijarse. Los diferentes procedimientos de etiquetado pueden combinarse con inmunohistoquímica, que normalmente se utiliza para el análisis final de imágenes. Este protocolo también incluye ejemplos de promotores de marcadores membranales específicos del intestino y otros recursos útiles para ambos procedimientos de etiquetado.Después de demostrar la inmunohistoquímica, este video utiliza una cepa transgénica que marca la membrana apical intestinal con ERM-1 GFP para buscar fenotipos de polaridad y morfogénesis del lumen mediante ARNi. Primero, prepare un portaobjetos para fijar los gusanos. Pese 30 microlitros de poli-L-lisina sobre un portaobjetos, luego coloque un segundo portaobjetos encima del primero y déjelos caer juntos para distribuir uniformemente la solución sobre ambos.Ahora separe las dos laminillas y déjelas secar al aire durante 30 minutos. A continuación, coloque un bloque metálico plano en un recipiente lleno de nitrógeno líquido. Lave las placas con solución M9 y transfiera aproximadamente 10 microlitros de M9 que contengan los gusanos.Alternativamente, tome los gusanos y agregue M9 a la preparación. Una vez transferidos los gusanos, coloque suavemente una cubreobjetos en diagonal sobre ellos, de modo que la cubreobjetos sobresalga por un borde. Luego, presione suavemente la cubreobjetos sin realizar movimientos laterales.Ahora transfiera inmediatamente el portaobjetos al bloque metálico en nitrógeno líquido y déjelo congelar. Después de cinco minutos, retire rápidamente la cubierta utilizando el borde sobresaliente. Hágalo con rapidez para obtener la fisura adecuada de la cutícula.A continuación, sumerja el portaobjetos en un frasco de vidrio Coplin lleno de metanol a menos 20 grados Celsius. Después de cinco minutos, transfiera el portaobjetos a un frasco de vidrio Coplin lleno de acetona durante otros cinco minutos a la misma temperatura. Los portaobjetos pueden teñirse directamente o almacenarse a menos 20 grados Celsius.Retire la laminilla de la acetona y déjela secar al aire a temperatura ambiente. A continuación, marque la ubicación para una pared circular de vaselina en el lado inferior de la laminilla y luego forme la pared de vaselina. No retire la vaselina durante este procedimiento.A continuación, prepare una cámara húmeda en un recipiente con toallas de papel húmedas y coloque el portaobjetos sobre una rejilla en su interior. No debe haber contacto entre las toallas y el portaobjetos ni entre portaobjetos adyacentes. Ahora agregue con pipeta suficiente PBS dentro del círculo de gelatina para cubrir la zona.Coloque suavemente la punta de una pipeta en el borde del círculo y permita que el líquido se distribuya uniformemente sobre los gusanos. Luego cierre la tapa y espere cinco minutos. Pasados los cinco minutos, incline el portaobjetos y aspire lentamente el PBS, teniendo cuidado de no perder los gusanos del portaobjetos.A continuación, llene cuidadosamente el círculo de gelatina con la solución de bloqueo recién preparada. Deje que la preparación incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, sustituya la solución de bloqueo por una solución de bloqueo que contenga el anticuerpo primario.Y incubar la preparación a cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, eliminar el anticuerpo primario y lavar la preparación aplicando y eliminando la solución de bloqueo tres veces. Dejar que cada aplicación de bloqueo incube durante 10 minutos.A continuación, agregue el anticuerpo secundario diluido en la solución de bloqueo e incube el portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente. Luego, lave el portaobjetos dos veces con la solución de bloqueo y después una vez con PBS. A continuación, elimine la mayor cantidad posible de PBS sin permitir que la muestra se seque y retire cuidadosamente el gel que rodea la muestra.Aplique una gota de medio de montaje sobre la muestra seguida por un cubreobjetos y un sellado con esmalte de uñas. Luego, almacene los portaobjetos en la oscuridad a cuatro grados Celsius. Transfiera la placa de la biblioteca de ARNi desde menos 80 grados Celsius al hielo seco.Retire la cinta selladora. Transfiera el clon de interés al agar selectivo. A continuación, estríe el clon y cultive las bacterias durante la noche.Antes de devolver la placa de biblioteca al congelador a menos 80 grados Celsius, coloque una cinta de sellado nueva. Al día siguiente, inocule colonias de la placa en alícuotas de un mililitro de medio líquido que contenga ampicilina. Luego, agite durante aproximadamente 14 horas a 37 grados Celsius.Al día siguiente, siembre 200 microlitros por clon en placas de ARNi separadas. Deje secar las placas e induzca la producción de ARNi mediante una incubación nocturna a temperatura ambiente. Un día después, transfiera cinco gusanos en estadio L4 a cada placa de ARNi etiquetada con el gen específico que se dirige.Luego, transfiera las placas a un incubador generalmente a 20 grados Celsius. Primero, examine los animales control frente a los animales con ARNip bajo luz brillante con aumento bajo y alto. A continuación, examine los animales control frente a los animales con ARNip bajo luz fluorescente con los filtros apropiados.Examine sistemáticamente una placa con animales de ARNi desde la parte superior izquierda hasta la inferior derecha de toda la placa, buscando fenotipos. Busque animales de interés. Para un examen más detallado de los fenotipos de ARNi seleccionados, enfoque el intestino y utilice el zoom para evaluar los fenotipos de tubulogénesis y morfogénesis del lumen.Para examinar los gusanos de interés mediante microscopía confocal, primero móntelos e inmóvilicelos manualmente: haga un círculo delgado de grasa al vacío o vaselina sobre un portaobjetos de vidrio. La capa de grasa debe ser fina, no más gruesa que 0,1 milímetro. A continuación, agregue aproximadamente 3,5 microlitros de azida de sodio 10 milimolar en el centro del círculo.Luego, seleccione rápidamente los gusanos de interés y colóquelos en la solución bajo un microscopio estereoscópico antes de que la solución se seque. A continuación, coloque suavemente una lámina de cubierta e imagine a los animales dentro de los 30 minutos siguientes. Aplique presión suave y verifique bajo el microscopio que los gusanos no estén flotando en la solución.Bajo el microscopio confocal, localice los gusanos con baja potencia y enfoque. Luego, utilice un objetivo de inmersión en aceite de 60 o 100X para observar e imaginar el intestino. A continuación, examine el animal bajo luz fluorescente con el canal adecuado para seleccionar las áreas que muestren el defecto celular de interés.Mueva rápidamente para evitar el desteñido por la luz. Luego cambie al escaneo con láser y limite la imagen al intestino estableciendo los límites de escaneo en sus lados dorsal y ventral. Capture una serie de imágenes y posteriormente combine las imágenes en una sola imagen de proyección.Este protocolo describe cómo analizar molecularmente y diseccionar visualmente la biogénesis de membranas polarizadas en el intestino en desarrollo de C.elegans, donde la morfogénesis de la membrana apical y del lumen coinciden. Los dominios de membrana apical y basolateral, las uniones asociadas a la membrana y el lumen intestinal pudieron resolverse, y su relación entre sí pudo examinarse a lo largo del desarrollo. Estos componentes subcelulares pudieron marcarse mediante anticuerpos marcados con fluorescencia o proteínas de fusión fluorescentes para marcado doble o triple, como se describe en el artículo adjunto.Defectos evidentes en la luz podían escanearse rápidamente utilizando un microscopio de fluorescencia estereoscópico. El marcador ERM-1, que es un enlazador del citoesqueleto en las membranas apicales acoplado a GFP, se expresa de manera robusta y resulta útil para una pantalla de ARNip. Se descubrió una serie de nuevos fenotipos relacionados con la morfogénesis y la polaridad de la luz intestinal, junto con los defectos genéticos subyacentes, al utilizar este marcador.Luego, se utilizaron imágenes de mayor aumento adquiridas mediante un microscopio confocal de barrido láser para examinar con mayor detenimiento los fenotipos y comprender mejor los defectos subyacentes. Algunos fenotipos pudieron cuantificarse. La cuantificación se empleó para comparar dichos defectos y seguir su progresión durante el desarrollo.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar membranas intestinales y compartimentos de membrana endo mediante tinción inmunológica y cómo analizar los fenotipos funcionales de ARNip relacionados con la biogénesis de membranas polarizadas y lumen.

the-c-elegans-intestine-as-model-for-intercellular-lumen

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

En este artículo se describe una técnica para la visualización de los primeros eventos de la embriogénesis en el...

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Este video describe el craqueo por congelación, un método para hacer que los tejidos de C. elegans sean accesibles para la tinción de anticuerpos mediante la interrupción de la cutícula.

Congelación de nematodos: un método para exponer los tejidos interiores de los gusanos para teñirlos

Este protocolo describe cómo reproducir la división de células dentro de un tejido en Caenorhabditis elegans embriones. Mientras que varios protocolos describen cómo la división celular imagen en el embrión temprano, este protocolo se describe cómo la imagen de la división celular dentro de un tejido en desarrollo durante la embriogénesis tardía mediados.

Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogénesis

Aquí se muestra cómo rastrear y cuantificar los procesos de desarrollo en C. elegans. Los métodos presentados se basan en herramientas de código abierto que se pueden implementar fácilmente. Se demuestra cómo reconstruir modelos 3D de forma de células, cómo rastrear manualmente las estructuras subcelulares y cómo analizar el flujo contráctil cortical.

El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en<em&gt; C. elegans</em&gt; Uso de las herramientas de código abierto

El canal excretor de C. elegans es un modelo único de celular solo para el análisis visual en vivo de la biogénesis de la membrana de nuevo polarizado. Este protocolo describe una combinación de genético estándar/ARNi y enfoques, adaptables para la identificación y caracterización de moléculas dirección tubulogenesis unicelulares y biogénesis de la membrana y lumen apical la proyección de imagen.

El Canal de Excretory C. elegans como modelo de morfogénesis Lumen intracelular y En Vivo biogénesis de la membrana polarizada en una sola celda: etiquetado por fusiones de GFP, ARNi interacción pantalla e imagen

Presentamos los protocolos para el aislamiento de estructuras 3D intestinales del tejido en vivo y en vitro matriz sótano integrado organoides y fijación diversos detalles y protocolos optimizados para el inmuno-etiquetado de microtúbulos, la coloración proteínas centrosómicas y Unión, así como la célula de marcadores como la proteína de la célula de vástago Lgr5.

Inmuno-fluorescente etiquetado de microtúbulos y proteínas centrosómicas en tejido Intestinal Ex Vivo y 3D In Vitro Intestinal organitas

Aquí, presentamos un enfoque combinatorio usando microscopía de alta resolución, herramientas computacionales y etiquetado de una sola célula en los embriones vivos de C. elegans para entender la dinámica de una sola célula durante el neurodesarrollo.

Microscopía de lámina de luz isotrópica y análisis de linaje celular automatizado para catalogar Caenorhabditis elegans embriogénesis con resolución subcelular

Este trabajo describe un protocolo de semi-alto rendimiento que permite imágenes simultáneas de lapso de tiempo 3D de embriogénesis en embriones de 80-100 C. elegans en una sola carrera nocturna. Además, se incluyen herramientas de visualización y procesamiento de imágenes para agilizar el análisis de datos. La combinación de estos métodos con cepas de reportero personalizadas permite un seguimiento detallado de la embriogénesis.

Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

Los microbios intestinales, incluidas las bacterias extracelulares y los patógenos intracelulares como el virus de Orsay y los microsporidios (hongos), a menudo se asocian con nematodos Caenorhabditis silvestres. Este artículo presenta un protocolo para detectar y cuantificar microbios que colonizan y/o infectan nematodos de C. elegans , y para medir la carga de patógenos después de infecciones controladas en el laboratorio.

Hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) para visualizar la colonización microbiana y la infección en los intestinos de Caenorhabditis elegans

Este protocolo describe la obtención de imágenes de lapso de tiempo de C. elegans basadas en microfluidos a lo largo de todo el desarrollo postembrionario.

Imágenes de alta resolución de C. elegans en todas las etapas larvales

Aprende a analizar la biogénesis de membranas polarizadas y la morfogénesis del lumen en el intestino de C. elegans usando técnicas de ARN de interferencia e inmunohistoquímica. Este método permite estudiar procesos celulares in vivo a nivel unicelular.

El intestino C. elegans como modelo una morfogénesis Lumen intercelular y En Vivo biogénesis de la membrana polarizada a nivel unicelular: etiquetado de anticuerpos, ARNi pérdida-de-función análisis y proyección de imagen de (Video) | JoVE Journal

El intestino C. elegans como modelo una morfogénesis Lumen intercelular y En Vivo biogénesis de la membrana polarizada a nivel unicelular: etiquetado de anticuerpos, ARNi pérdida-de-función análisis y proyección de imagen de

Explorar más videos