Estereológicos estimación de número de la neurona dopaminérgica en el Nigra del Substantia de ratón usando el fraccionador óptico y equipo de microscopía estándar
1 de septiembre de 2017
Este trabajo presenta un protocolo paso a paso para la estimación imparcial estereológicos del número de células neuronales dopaminérgicas en la sustancia negra de ratón utilizando equipo de microscopía estándar (es decir, un microscopio de luz, una tabla de objeto motorizado (x, y, z plano) y software de dominio público para el análisis de imagen digital.
El objetivo general de este protocolo es describir la estimación estereológica basada en el diseño del número de células dopaminérgicas en el SN de ratón utilizando un equipo de microscopía estándar. Este método es útil para estimar el número de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra del ratón para la investigación preclínica de la enfermedad de Parkinson utilizando la estereología no sesgada basada en el diseño. La principal ventaja de esta técnica es que se puede lograr con un equipo de microscopía estándar sin necesidad de una configuración de estereología completa disponible en el mercado.
Louisa Friez, una técnica de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Comience colocando un cerebro de ratón fijado en paraformaldehído en una matriz cerebral y haciendo un corte más 0,74 milímetros de bregma. Transfiera la parte caudal del cerebro, incluida la SN, al 4% de PFA en 0,1 molar y fije durante la noche a cuatro grados centígrados.
Al día siguiente, cambie el PFA por sacarosa al 30% en PBS de 0,1 molares e incube durante otros dos días a cuatro grados centígrados para crioproteger la muestra. Después de dos días, cuando el cerebro se haya hundido en la sacarosa, coloque el tejido en un Cryomold lleno de compuesto de temperatura de corte óptima y congele lentamente el tejido en hielo seco líquido enfriado con isopentano. Utilice un criostato para cortar en serie secciones criogénicas de 30 micras en el plano coronal.
Marque el hemisferio derecho perforando un pequeño agujero en la región superior del tronco encefálico. Recoge cuatro series de secciones que comienzan en menos 2,46 milímetros de bregma y terminan en 4,04 milímetros de bregma. Transfiera cada serie de secciones a un tubo lleno de crioprotector y guárdelo a menos 20 grados centígrados.
Capture imágenes digitales de secciones de SN teñidas inmunohistoquímicamente con tirosina hidroxilasa utilizando un software de imágenes acoplado a un microscopio. Comience por determinar el montaje real y el grosor de las secciones en tres sitios de conteo seleccionados al azar por sección. Primero haga clic en ver desplazamiento superior para definir la parte superior de la sección.
A continuación, haga clic en detener la vista superior. A partir de entonces, haga clic en ver desplazamiento inferior y luego haga clic en detener vista inferior. Anota el grosor de la sección.
Calcule la zona de protección restando tres micras del desplazamiento superior y escriba el resultado en el cuadro de desplazamiento superior. A continuación, reste la altura de 13 micras del disector óptico del número de desplazamiento superior y escriba el resultado en el cuadro de desplazamiento inferior. Seleccione los siguientes parámetros, pasos 14, tamaño 1,00.
Seleccione el directorio para guardar el archivo. Haga clic en secuencia para iniciar la adquisición. Una vez adquiridas las imágenes, haga clic en procesamiento y seleccione los siguientes parámetros, todos los planos de secuencia, montaje y las cajas rápidas y de costura con una superposición de imágenes del 10%Comience a unir las imágenes haciendo clic en inicio.
Esto generará imágenes de pila para el análisis. Para comenzar, abra la imagen haciendo clic en archivo y abrir. Defina la escala de la imagen mediante el comando analizar y establecer escala.
A partir de este paso, cambie el tamaño definido de píxeles a micras. Seleccione los complementos, luego la cuadrícula y luego el comando de líneas de tipo de cuadrícula para insertar aleatoriamente una cuadrícula. Marque la casilla de desplazamiento aleatorio.
Defina el tamaño de un cuadrado dentro de la cuadrícula como 130 micras por 130 micras para que sea igual a 16.900 micras cuadradas. Cambie el tipo de imagen de 16 bits a color RGB haciendo clic en la imagen, luego escriba y luego color RGB. Localiza la sustancia negra pars compacta.
Rodea la región con la herramienta Pincel con un ancho de pincel de 11. Deshaga el comando establecer escala haciendo clic en analizar, luego establecer escala y luego haga clic para eliminar la escala y calcular en píxeles en lugar de micras. Tome una captura de pantalla, guarde el archivo de imagen y abra el nuevo archivo con ImageJ.
Seleccione el pincel y un ancho de pincel de 25. Marque cada cuadrado de la cuadrícula que entra en contacto con el SN para la colocación de un disector óptico. Seleccione un cuadrado de cuadrícula que incluya partes del SN. Mida la esquina superior izquierda del cuadrado con el cursor en ImageJ para definir las coordenadas x e y iniciales.
Seleccione la plantilla de hoja de cálculo titulada posición del disector óptico y calcule la posición del disector óptico. A continuación, estime el número de células utilizando la hoja de cálculo del recuento de células como se describe en la parte escrita del protocolo. Esta imagen de baja potencia muestra una sección del cerebro de ratón después de la tinción de TH para las neuronas dopaminérgicas.
Un aumento más alto representa las neuronas dopaminérgicas TH positivas. El recuadro muestra la región en caja con mayor aumento. Esta imagen muestra una serie de secciones de SN teñidas con TH que cubren todo el SN del ratón, desde el rostral hasta el caudal.
Cada sección está separada de la sección consecutiva por 120 micras. El número de neuronas TH positivas en el SN de ratón derecho e izquierdo se estimó utilizando el método que se muestra en este video y utilizando un sistema de estereología disponible comercialmente. Como se ve aquí, ambos métodos dieron como resultado recuentos de células comparables y no hubo diferencias significativas entre los conjuntos de datos.
No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección personal como guantes protectores mientras se realiza este procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una estimación estereológica insesgada del número de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra del ratón utilizando el método de fracción óptica y el equipo de microscopía estándar.
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Resumen
Este artículo describe un protocolo para la estimación estereológica imparcial del conteo de células neuronales dopaminérgicas en la sustancia negra del ratón, utilizando herramientas microscópicas convencionales. El método tiene como objetivo facilitar la investigación preclínica en la enfermedad de Parkinson al proporcionar un enfoque confiable para la cuantificación celular sin necesidad de sistemas estereológicos especializados.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Investigación sobre la Enfermedad de Parkinson
Antecedentes
- Las neuronas dopaminérgicas son fundamentales para el control motor.
- La sustancia negra es una zona clave afectada en la enfermedad de Parkinson.
- La estereología imparcial proporciona un método cuantitativo robusto.
- El uso de equipo microscópico estándar hace que la técnica sea accesible.
Objetivo del estudio
- Establecer un protocolo paso a paso para la cuantificación neuronal.
- Utilizar la estereología imparcial basada en diseño en modelos de ratón vivos.
- Permitir estudios preclínicos que examinen la pérdida de neuronas dopaminérgicas.
Métodos Utilizados
- Microscopía estándar, incluida microscopía óptica y software de análisis de imágenes digitales.
- La sustancia negra de ratón como modelo biológico.
- Fijación, crioprotección y corte detallados del tejido cerebral de ratón.
- Imagen digital y técnicas específicas de inmunohistoquímica.
- Mediciones y cálculos cuidadosos para determinar el número de neuronas.
Resultados principales
- Se demostró una estimación precisa de las neuronas dopaminérgicas en la SN.
- Tanto los métodos estándar como los avanzados produjeron recuentos neuronales comparables.
- Énfasis importante en la fiabilidad del método utilizando herramientas estándar.
Conclusiones
- Este estudio presenta un enfoque factible para cuantificar poblaciones neuronales en la investigación.
- Mejora la comprensión de la pérdida neuronal en la enfermedad de Parkinson.
- Utiliza herramientas fácilmente disponibles, lo que promueve una aplicación más amplia en estudios de neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación precisa de la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra es un punto final crítico en la investigación preclínica de la enfermedad de Parkinson, que informa directamente la validación de objetivos y la reducción del riesgo mecanicista de estrategias neuroprotectoras. Este protocolo permite una estimación estereológica fiable e imparcial utilizando equipos microscópicos estándar, reduciendo la dependencia de sistemas especializados de estereología y aumentando la accesibilidad para flujos de trabajo de biología de descubrimiento. Al proporcionar datos cuantitativos y reproducibles de conteo celular, el método respalda la confianza predictiva en las pruebas de hipótesis de objetivos en etapas iniciales y en las decisiones de priorización de carteras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de hipótesis terapéuticas al proporcionar una cuantificación imparcial de la supervivencia de neuronas dopaminérgicas en modelos preclínicos de la enfermedad de Parkinson.
- Valor operativo: Facilita la reducción del riesgo biológico mediante la estereología basada en diseño, que minimiza el sesgo del observador y la variabilidad técnica en estudios de interacción con el blanco.
- Valor predictivo: Genera datos cuantitativos del recuento neuronal que ayudan a evaluar la eficacia de la modulación del blanco y a tomar decisiones de avance o interrupción en las fases iniciales del descubrimiento.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Produce resultados histológicos cuantitativos estandarizados adecuados para validar impactos en cribados destinados a preservar la integridad de las neuronas dopaminérgicas.
- Reproducibilidad: Ofrece mediciones consistentes del recuento celular entre secciones y animales, lo que favorece la estandarización del ensayo para la evaluación posterior de compuestos.
- Escalabilidad: Compatible con microscopía estándar y software de análisis de imágenes, lo que permite una adopción más amplia en diversas plataformas de descubrimiento sin necesidad de hardware especializado.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela directamente la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra, una característica patológica fundamental de la enfermedad de Parkinson, lo que mejora la validez traslacional.
- Continuidad preclínica: Proporciona un puente cuantitativo desde el cribado de descubrimiento hasta la validación preclínica al ofrecer datos comparables a los sistemas comerciales de estereología.
- Avance ajustado al riesgo: Permite tomar decisiones objetivas basadas en datos sobre la progresión de compuestos, fundamentadas en métricas estadísticamente robustas de supervivencia neuronal.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre un blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación de la eficacia preclínica, ofreciendo una lectura de histología cuantitativa que aporta información para comprender el mecanismo de acción y la confianza en el blanco.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación de poblaciones de neuronas dopaminérgicas como una medida funcional de la modulación de vías en modelos preclínicos.
- Selección: Genera resultados cuantitativos reproducibles basados en imágenes que permiten comparaciones confiables de los efectos de compuestos sobre la supervivencia neuronal.
- Análisis: Proporciona datos numéricos de conteo celular y comparabilidad estadística entre grupos experimentales, facilitando comparaciones de condiciones basadas en datos.
- Investigación Traducional: Se alinea con la patología de la enfermedad de Parkinson al medir la pérdida de neuronas en una región cerebral relevante para la enfermedad, apoyando la validación preclínica alineada con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo estandarizado y accesible de estereología que puede aplicarse en múltiples programas de descubrimiento en neurociencia sin requerir equipos de alto costo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas al reducir la ambigüedad mecanicista mediante una cuantificación estereológica imparcial basada en el diseño.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización entre laboratorios mediante el uso de herramientas ampliamente disponibles de microscopía y análisis de imágenes.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al eliminar la necesidad de sistemas especializados de estereología, manteniendo al mismo tiempo la comparabilidad de los datos con plataformas comerciales.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos preclínicos basada en datos cuantitativos y validados histológicamente sobre la preservación de neuronas dopaminérgicas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en histología, inmunohistoquímica y principios estereológicos para la preparación precisa de tejidos y la identificación de regiones.
- Depende de equipos de microscopía motorizados con control del eje z y software de unión de imágenes para el análisis sistemático de secciones.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de tinción, el grosor de las secciones y las reglas de conteo para garantizar la reproducibilidad entre sitios.
- La adaptación a otras regiones cerebrales o tipos de neuronas puede requerir ajustes en los parámetros de tinción, el tamaño de la cuadrícula y las dimensiones del disector óptico.
- Las limitaciones prácticas incluyen la dependencia de la calidad de las secciones y la necesidad de una formación rigurosa para mantener la precisión del conteo y evitar sesgos en el muestreo.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
- Valor científico: La replicación en múltiples secciones y animales tiene en cuenta la variabilidad biológica y técnica, aumentando la confianza en que los conteos de neuronas observados reflejan verdaderos efectos experimentales y no artefactos de muestreo.
- Valor operativo: Los protocolos de muestreo consistentes reducen la variabilidad entre operadores y favorecen la estandarización entre laboratorios, lo cual es esencial para proyectos de descubrimiento en múltiples sitios.
