Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema

El objetivo general de este procedimiento es introducir una plataforma de biosensores microfluídicos electroquímicos versátiles basada en la tecnología fotorresistente de película seca de bajo costo, que es capaz de medir varios tipos de analitos dependiendo del ensayo ligado a enzimas inmovilizadas utilizado posteriormente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las pruebas en el punto de atención, como la cuantificación de diferentes fármacos, como los antibióticos, o el diagnóstico de diversas enfermedades como el cáncer. La principal ventaja de esta técnica es que el biosensor que aquí se presenta se basa principalmente en materiales de bajo coste, fáciles de usar y muy versátiles en cuanto a su aplicación.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos relacionados con los fotorresistentes de película seca son difíciles de dominar porque el manejo requiere mucho entrenamiento y práctica. Eva Grether, una estudiante asistente de mi grupo, demostrará la inmovilización y medición del ensayo en el chip. Para comenzar, corte un sustrato de poliimida o PI en obleas redondas de seis pulgadas.

Luego, coloque la oblea PI en un horno a 120 grados centígrados, durante aproximadamente una hora para hornear por deshidratación. Para realizar el primer paso de fotolitografía para el proceso de despegue, programe el codificador de espín a un tiempo de giro de 30 segundos a 3000 rpm con una aceleración de 2000 rpm por segundo. Coloque la oblea PI en el codificador de espín y fíjela aplicando un vacío.

A continuación, inicie el programa del codificador de espín y dispense dos mililitros de resistencia, lo que permite el proceso de despegue. Retire la oblea del codificador giratorio y hornee suavemente la oblea PI en una placa caliente durante dos minutos a 100 grados centígrados. Ajuste la máscara deseada para modelar los electrodos en la oblea PI a simple vista y expóngala a 400 milijulios por centímetro cuadrado de luces UV.

A continuación, coloque la oblea en un recipiente lleno de un revelador resistente a juego en un agitador orbital y déjela agitar ligeramente durante un minuto. Después de quitar la resistencia de acceso, use una ducha para enjuagar la oblea PI con agua desionizada en un banco húmedo, antes de secarla con aire comprimido. A continuación, deposite platino para la formación de los electrodos mediante un proceso de deposición física de vapor estándar para depositar 200 nanómetros de platino en la oblea.

Después de colocar la oblea en un tazón, agregue el removedor correspondiente al tazón y retire la resistencia de despegue, mientras agita ligeramente la oblea en un agitador orbital hasta que se elimine todo el platino de acceso. Después de enjuagar y secar la oblea PI como antes, realice el segundo paso de fotolitografía y limpie los electrodos como se describe en el protocolo de texto. A continuación, pasivar las almohadillas de contacto de platino de la oblea con una cinta adhesiva sensible a los rayos UV.

Para ello, corta el papel de aluminio en tiras de cinco milímetros de ancho y 11 centímetros de largo y pégalas a la oblea, protegiendo las partes para que no se depositen con plata. Para la deposición de plata, coloque un baño sónico en una vitrina de gases e inserte un recipiente de solución de electrolito de plata en el baño. Ajuste el baño sónico a temperatura ambiente y desconecte la potencia al 10%Conecte el contacto masivo de los electrodos de referencia a una fuente de corriente constante.

Luego, conecte el contraelectrodo, un cable de plata que se sumerge en la solución de electrolito de plata, a la fuente de corriente, usando cables de conexión estándar. Ajuste la fuente de corriente a CC y a una densidad de corriente de aproximadamente 4,5 miliamperios por centímetro cuadrado, lo que da como resultado una tasa de deposición de plata de aproximadamente 0,3 micras por minuto. Inicie el baño sónico y deje que la fuente actual funcione durante 10 minutos.

Después de 10 minutos, enjuague la oblea con agua desionizada. Para realizar el tercer paso de fotolitografía, primero corte las capas fotorresistentes de película seca a un tamaño similar al de la oblea. Fije la máscara deseada en la unidad de exposición y alinee la capa DFR en la máscara a simple vista.

Luego, ilumine la resistencia con 250 milijulios por centímetro cuadrado de luz UV. Retire la lámina protectora de la fotorresistencia y revele la resistencia durante aproximadamente dos minutos en una solución de carbonato de sodio al 1%, utilizando un baño sónico estándar, precalentado a 42 grados centígrados y a una potencia sonora del 100%Para detener la reacción inmediatamente, agite la resistencia durante un minuto en un baño de ácido clorhídrico al 1% en un agitador orbital. Enjuague y seque cada capa de DFR como antes.

Para laminar las capas de DFR sobre el sustrato de PI, coloque la oblea de PI sobre una lámina superior de transparencia y fíjela con cinta adhesiva estándar. Ajuste la capa DFR del canal en la oblea PI bajo un microscopio utilizando las estructuras de alineación respectivas. Para la laminación, utilice una laminadora de laminación en caliente estándar y precaliente el rodillo superior a 100 grados centígrados y el rodillo inferior a 60 grados centígrados.

Ajuste la presión a tres bar con una velocidad de avance de 0,3 metros por minuto. Coloque la oblea con la capa DFR fija en el centro de la laminadora y póngala en marcha de modo que el DFR sea empujado a través de la laminadora. Repita el paso después de girar la oblea 180 grados.

A continuación, retire la capa protectora de la parte frontal de la capa del canal DFR colocando cinta adhesiva estándar en un extremo del DFR y tirando de ella hacia arriba. Utilice un dispensador manual con tubos de 0,004 pulgadas para dispensar pequeñas gotas de politetrafluoroetileno disuelto en los pocillos de la capa de aislamiento. Para sellar el chip microfluídico, lamine la capa DFR de la cubierta sobre la capa del canal como antes.

A continuación, hornee el biosensor microfluídico quitando primero todas las láminas protectoras de la cubierta y las capas DFR de la parte trasera. Corta los biosensores en tiras con unas tijeras comunes. Por último, cura las patatas fritas en un horno a 160 grados centígrados durante tres horas.

Para absorber la avidina en el área de inmovilización del canal, dispense dos microlitros de la solución de avidina en la entrada del biosensor. Para asegurarse de que el fluido se detenga en la barrera durante todo el tiempo de incubación, dispense dos microlitros de agua desionizada en la salida del chip. Incubar el chip a 25 grados centígrados durante una hora en un recipiente cerrado.

Elimine el exceso de reactivos a través de la entrada del chip aplicando un vacío. A continuación, lave el canal con 50 microlitros de tampón de lavado dispensados en la salida mientras se aplica la aspiradora. Secar el canal durante 30 segundos con vacío.

Bloquee la superficie del canal para inhibir la unión inespecífica por el encabezado de la tubería: dos microlitros de solución de BSA al 1% en la entrada y dos microlitros de agua desionizada en la salida del canal. Incubar el chip a 25 grados centígrados durante una hora en un recipiente cerrado antes de retirar los reactivos de acceso y secar el canal como antes. A continuación, incubar los oligonucleótidos de ADN marcados con biotina y seis FAM dispensando dos microlitros de una concentración de la solución de ADN en la entrada y dos microlitros de agua desionizada en la salida.

Incubar el chip a 25 grados centígrados durante 15 minutos en un recipiente cerrado antes de retirar los reactivos de acceso y secar el canal. Para inmovilizar la glucosa oxidasa marcada con seis anticuerpos FAM, introduzca dos microlitros de la solución de anticuerpos en la entrada y dos microlitros de agua desionizada en la salida del canal. De nuevo, incube los anticuerpos marcados a 25 grados centígrados durante 15 minutos en un recipiente cerrado antes de retirar el exceso de reactivos.

Aplique el espaciador de PMMA fluido en el biosensor y conecte eléctricamente el biosensor al potenciostato. Realice la conexión fluídica de la bomba de jeringa con el biosensor mediante el uso del adaptador fluídico. Ponga en marcha la bomba de jeringa manualmente con un PPS de 0,1 molar a un caudal de 20 microlitros por minuto.

En el electrodo de trabajo frente al electrodo de referencia en el chip, aplique 30 ciclos de un voltaje alterno de 0,8 y 0,05 voltios durante cinco segundos cada uno. Después de esto, oxide el electrodo de trabajo aplicando un voltaje de 0,8 voltios durante 60 segundos. Para iniciar la lectura de la señal de ensayo, espere hasta que la señal de corriente medida se estabilice.

Detenga la bomba de jeringa y cambie el reactivo de PPS de 0,1 molar a una solución de glucosa de 40 milimolares antes de iniciar el software en el controlador de la bomba de jeringa. Después de detener automáticamente el flujo durante uno, dos o cinco minutos, la bomba de jeringa reiniciará el flujo nuevamente. Observe el pico de las corrientes resultantes.

El biosensor electroquímico contiene un solo canal microfluídico con dos áreas distintas separadas por la barrera de parada hidrofóbica. El área de inmovilización, donde el ensayo se inmoviliza por absorción simple de las biomoléculas y la celda electroquímica donde se realiza la lectura amperométrica del ensayo. Para la lectura amperométrica del biosensor, se utiliza la llamada técnica de stop-flow.

En primer lugar, se aplica un flujo constante del sustrato enzimático glucosa. Una vez que la señal se estabiliza, el flujo se detiene. Durante la fase de parada, la glucosa se convierte en peróxido de hidrógeno y se acumula en el canal.

Al reiniciar el flujo, el peróxido de hidrógeno se elimina a través de la celda electroquímica donde se detecta, lo que resulta en un pico de corriente. Dependiendo de la cantidad de analito unido y, por lo tanto, de la cantidad de glucosa oxidasa unida, la altura de la señal varía, lo que da como resultado una curva de calibración de ejemplo, como se ve aquí. Una vez dominado, la fabricación del biosensor se puede realizar en aproximadamente 10 horas si se realiza correctamente.

Mientras que el tiempo de incubación y lectura del ensayo depende del ensayo empleado, por lo general se puede realizar en tres horas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión sobre la fabricación en la preparación del ensayo de chip y el funcionamiento de los biosensores electroquímicos basados en fotorresistencia de película seca. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que todos los pasos del protocolo se sigan estrictamente y se realicen con mucha precaución.

Dado que el rendimiento del sensor depende en gran medida del proceso de fabricación. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia una medicina personalizada que abarca el diagnóstico in situ de diferentes tipos de enfermedades y fármacos, y así, facilita la terapia individualizada. No olvide que trabajar con soluciones de electrolitos de plata puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de gafas de seguridad y guantes adecuados al realizar este procedimiento.