Name: Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Aprende a fabricar biosensores microfluídicos electroquímicos con fotoresistencia en película seca de bajo costo. Esta plataforma versátil permite cuantificar analitos mediante ensayos enzimáticos inmovilizados para diagnóstico rápido.

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Los autores desean agradecer a la Fundación de investigación alemán (DFG) para financiar parcialmente esta labor bajo la subvención número UR 70/10-01 y UR 70/12-01.

1. fabricación de la tecnología microfluídica Biosensor utilizando DFR <ol><li>obleas de la preparación de la PI.
	<ol><li>Corte un PI sustrato a 6 - Ronda de obleas. Poner la oblea de PI en un horno a 120 ° C durante aproximadamente 1 hora para un horno de deshidratación.</li>
	</ol></li> <li>Primer paso de la fotolitografía para el proceso de despegue.
	<ol><li>Programa un recubridor de vuelta a un tiempo de 30 s spinning a 3.000 rpm, con una aceleración de 2.000 rpm, s. lugar de la oblea de la PI en el recubridor spin y arreglarlo, aplicando un vacío. Distribuir 2 mL de una resistencia, que permite el proceso de despegue e inicia el programa de centrifugado-barnizadora. Retirar la oblea un recubridor de giro y suave-cueza al horno la oblea de PI en un plato caliente durante 2 minutos a 100 ° C.</li>
		<li>Ajustar la máscara deseada para patrones los electrodos en la oblea de PI con el ojo desnudo y exponerlo a 400 mJ/cm 2 UV luz (365 nm). Lugar la oblea en un recipiente lleno de un desarrollador de resistir-que empareja en un agitador orbital y déjelo agitar ligeramente durante 1 minuto</li>
		<li>Luego de resistir exceso, usar una ducha para enjuagar la oblea de PI con agua desionizada (agua desionizada) en un banco mojado y secarlo luego con aire comprimido.</li>
	</ol></li> <li>Depósito de platino para la formación de los electrodos.
	<ol><li>Usar un proceso de deposición de vapor física estándar al depósito 200 nm del platino en la oblea 19.</li>
		<li>Colocar la oblea en un recipiente. Agregar el eliminador que empareja a la taza y quitar despegue resistir agitando ligeramente la oblea en un agitador orbital hasta que desaparezca todo exceso platino. Enjuague y seque la oblea de PI como se describe en el paso 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Segundo paso de fotolitografía: formación de la capa de aislamiento.
	<ol><li>Poner la oblea de PI en un horno precalentado a 120 ° C durante 5 minutos deshidratar it.</li>
		<li>Programa el primer paso de un recubridor de giro a 5 s de tiempo a 500 rpm de giro. Programa de la segunda etapa de 30 s a 4.000 rpm, con una aceleración de 700 rpm/s.</li>
		<li>Colocar la oblea de la PI en el recubridor spin y arreglarlo, aplicando un vacío. Distribuir 4 mL de una fotoresistencia de epoxy-basado apropiado antes de iniciar el programa spin coater.</li>
		<li>Soft-cueza al horno la oblea cubierta por 3 min a 95 ° C sobre una placa caliente.</li>
		<li>Ajustar la máscara para la capa de aislamiento en la oblea usando las marcas de alineación respectivos y una lente ocular. Expone la oblea a 100 mJ/cm 2 UV luz (365 nm).</li>
		<li>Para un post-exposición cuece al horno, colocar la oblea en una placa precalentada durante 2 min a 95 ° C.</li>
		<li>Colocar la oblea en un recipiente y desarrollar la resistencia con un desarrollador adecuado (por ejemplo, 1-methoxy-2-propil-acetat por 2 min, en el caso de SU-8) en un agitador orbital.</li>
		<li>Enjuague la oblea PI primero con isopropanol y luego enjuague y secar como se describe en el paso 1.2.3.</li>
		<li>Duro-cueza al horno la fotoresistencia en un horno durante 3 horas a 150 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Asistida por plasma limpieza de los electrodos.
	<ol><li>Para quitar los residuos de la fotoresistencia, use plasma de oxígeno con una unidad de plasma estándar. Iniciar el programa de limpieza, con flujo de 100% O 2, una tasa de sccm 250 y un tiempo total de 3 minutos a potencia de 200 W baja frecuencia</li>
		<li>Colocar la oblea de PI en la cámara de plasma, arreglar la oblea de la placa a tierra usando las tapas de cristal, y comenzar el proceso de plasma.</li>
	</ol></li> <li>Plata y cloruro de plata: creando el electrodo de referencia de la en-viruta de.
	Cojines <ol><li>Passivate el contacto de platino de la oblea con un adhesivo sensible a la UV. Cortar la hoja a 5 mm de ancho y 11 cm de largo rayas y sujete a la oblea, protegiendo las piezas no a depositado con la plata.</li>
		<li>Para la deposición de plata, poner un baño de ultrasonidos (35 kHz) en una vitrina y colocar un recipiente con solución de electrolitos de plata (100 g/L Ag, pH 12,5) en el baño. Configurar el baño a temperatura ambiente y la energía de 10%. 
		PRECAUCIÓN: Soluciones de electrolitos de plata son altamente tóxicas y deben manipularse con extremo cuidado. Nunca deben inhalarse los vapores.</li>
		<li>Conecte el contacto de la mayor parte de los electrodos de referencia a una fuente de corriente constante. Conectar el electrodo de contador, un alambre de plata que se encuentra inmerso en la solución de electrolitos de plata, a la fuente de corriente con cables de conexión estándar.</li>
		<li>Establecer la fuente de corriente DC y una densidad de corriente de -4,5 mA/cm 2, resultando en una tasa de deposición de plata de aproximadamente 0,3 μm/min iniciar el baño y deje la fuente de corriente durante 10 minutos enjuague la oblea con agua DI</li>
		<li>Para la cloración del electrodo de referencia, introducir un vaso de solución de cloruro de potasio (KCl) de 0.1 M en el baño. Conectar el terminal a granel de la oblea y un electrodo de platino inmerso en la solución de KCl con la fuente de corriente constante.</li>
		<li>Establecer la fuente de corriente DC y una densidad de corriente de +0.6 mA/cm 2, resultando en una tasa de deposición de aproximadamente 0.075 μm/min iniciar el baño y deje la fuente actual 7,5 min</li>
		<li>Enjuague y seque el PI de la oblea, como se describe en el paso 1.2.3.</li>
		<li>, Retire la cinta sensible a UV después de UV (365 nm) exposición de 300 mJ/cm 2 y enjuague y seque la oblea del PI, otra vez como se describe en paso 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Tercer paso Fotolitografía: DFRs usando para crear los canales microfluídicos.
	<ol><li>Corte las capas necesarias de DFR a un tamaño similar a la de la oblea (20 x 20 cm 2). Fijar la máscara deseada sobre la unidad de exposición y alinear la capa DFR en la máscara usando el ojo desnudo. Iluminar el resistir con 250 mJ/cm 2 UV luz (365 nm).</li>
		<li>Quitar la lámina protectora de la fotoresistencia y resistir durante aproximadamente 2 minutos (dependiendo las estructuras) se convierten en una solución de carbonato de sodio (Na 2 CO 3) 1% utilizando un baño de ultrasonidos estándar (35 kHz) precalentado a 42 ° C y una potencia sonora del 100%. Para detener la reacción inmediatamente, agite resistir durante 1 min en un baño de ácido clorhídrico 1% en un agitador orbital. Enjuague y seque cada capa DFR, tal como se describe en el paso 1.2.3. 
		Nota: En total, cuatro capas DFR que deba procesarse como se menciona en el paso 1.7: un canal capa, capa de la cubierta de una y dos capas de la parte trasera (previniendo el biosensor de flexión en el extremo).</li>
	</ol></li> <li>Capas de laminación de la DFR en el substrato PI.
	<ol><li>Colocar la oblea de PI en una hoja de transparencia arriba y fijarlo con cinta adhesiva estándar. Ajustar la capa DFR de canal en la oblea de PI bajo el microscopio, utilizando las estructuras de alineamiento respectivo.</li>
		<li>Para la laminación, utilizar una laminadora de rodillo caliente estándar y precalentar el rodillo superior a 100 ° C y el rodillo inferior a 60 ° C. Ajuste la presión a 3 bar, con una velocidad de avance de 0,3 m/min lugar la oblea con la capa DFR fija en medio de la plastificadora y Inicio el DFR es empujado a través de la laminadora. Repita el paso después de la oblea de la rotación por 180°.</li>
		<li>Para evitar la flexión del biosensor, laminado las dos capas de la parte trasera desarrollada sobre la oblea siguiendo pasos 1.8.1-1.8.2.</li>
	</ol></li> <li>Empleando una barrera hidrofóbica parada y sellado el chip.
	<ol><li>Quitar la capa protectora de la parte frontal de la canal DFR ponecador estándar cinta adhesiva en un extremo de la DFR y tirando hacia arriba. Utilice un dispensador de mano con tubos de 0.004 para dispensar pequeñas gotitas de politetrafluoroetileno disuelto en los pozos de la capa de aislamiento. Para sellar el chip de microfluidos, laminado de la capa de DFR la cubierta sobre la capa de canal, como se describe en el paso 1.8.</li>
	</ol></li> <li>Duro a hornear el biosensor microfluídicos.
	<ol><li>Eliminar toda protección de láminas en la tapa y la parte trasera capas DFR. Cortar los biosensores en tiras con una tijeras ordinarias. Curar las virutas en el horno a 160 ° C por 3 h.</li>
	</ol></li></ol> 2. Procedimiento de ensayo de inmovilización en el chip <ol><li>adsorción de avidina en la zona de inmovilización del canal.
	<ol><li>Preparar una solución de avidina de 100 μg/mL en 10 mM tampón fosfato solución salina (PBS) a un pH de 7.4.</li>
		<li>Dispensar 2 μl de la solución de avidina en la entrada del biosensor. 
		Nota: El canal está ocupado por las fuerzas capilares hasta que el líquido alcance la barrera hidrofóbica parar.</li>
		<li>Para asegurarse de que el neumático mantiene parada en la barrera durante el tiempo de incubación todo, dispensar 2 μl de agua desionizada en la salida de la viruta. Incubar el chip a 25 ° C por 1 h en un recipiente cerrado.</li>
		<li>Quitar exceso reactivos a través de la entrada del chip mediante la aplicación de un vacío. Lave el canal con 50 μl de tampón de lavado (PBS con 0,05% Tween 20), dispensado en la salida mientras se aplica el vacío. Secar el canal de 30 s, mientras que el vacío se está aplicando.</li>
	</ol></li> <li>Bloqueo de la superficie de la canal para inhibir la Unión inespecífica.
	<ol><li>Preparar una solución de albúmina de suero bovino (BSA) de 1% en 10 mM PBS a pH 7.4.</li>
		<li>Pipeta 2 μl de la solución de BSA 1% en la entrada y 2 μl de agua desionizada en la salida del canal. Incubar el chip a 25 ° C durante 1 hora en un envase cerrado. Quitar exceso reactivos y secar el canal, como se describe en el paso 2.1.4.</li>
	</ol></li> <li>Incubación de DNA oligos marcados con biotina y 6 FAM.
	<ol><li>Preparar a diferentes concentraciones (0.001-5 μm) de la solución de ADN en 10 mM PBS a pH 7.4.</li>
		<li>Dispensar 2 μl de una concentración de la solución de ADN en la entrada y 2 μl de agua desionizada en la salida. Incubar el chip a 25 ° C durante 15 min en un recipiente cerrado.</li>
		<li>Repetir paso 2.3.2 para las otras concentraciones de ADN adicionales biosensor en fichas.</li>
		<li>Quitar exceso reactivos y secar el canal, como se describe en el paso 2.1.4.</li>
	</ol></li> <li>Anticuerpos 6-FAM inmovilización de GOx-etiquetados.
	<ol><li>Formular una concentración de 5 μg/mL de anticuerpos 6-FAM en 10 mM PBS a pH 7.4.</li>
		<li>Introducir 2 μl de la solución de anticuerpo a la entrada y 2 μl de agua desionizada a la salida del canal. Incubar los anticuerpos etiquetados a 25 ° C durante 15 min en un recipiente cerrado. Eliminar los reactivos en exceso, como se describe en el paso 2.1.4.</li>
	</ol></li></ol> 3. Amperométrico señal de detección mediante la técnica de Stop-flow <ol><li>preparación de la solución de sustrato para la detección electroquímica.
	<ol><li>Formular una solución de glucosa de 40 mM en PBS de 0,1 M a un pH de 7.4 en agua ultra-pura.</li>
		<li>Para el tratamiento preliminar, preparar una solución de PBS de 0,1 M a un pH de 7.4 en agua ultra-pura.</li>
	</ol></li> <li>Tratamiento preliminar de los electrodos de trabajo.
	<ol><li>Utilice el soporte de chips a medida para permitir la fácil colocación de la viruta y una conexión fluídica y eléctrica.</li>
		<li>Conecte eléctricamente el biosensor del potenciostato. Asegurar el contacto fluídico del canal microfluídico una bomba de la jeringuilla y el depósito de reactivo usando el adaptador por encargo y tubos. Iniciar el portátil que está conectado el potenciostato e iniciar el controlador de bomba de jeringa, controlar el flujo de neumático por el chip.</li>
		<li>Iniciar manualmente, la bomba de jeringa con PBS de 0,1 M con un caudal de 20 μl/min. En el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia de la en-viruta, se aplica un voltaje alterno de 0.8 y -0,05 V 5 s durante 30 ciclos. Después de esto, se oxida el electrodo de trabajo aplicando una tensión de 0,8 V para 60 s.</li>
	</ol></li> <li>Lectura de ensayo mediante la técnica de stop-flow.
	<ol><li>Para iniciar la lectura de la señal de prueba, esperar hasta que se estabilice la señal de corriente medida. Parar la bomba de jeringa y cambiar el reactivo de PBS de 0,1 M a la solución de glucosa de 40 mM e inicie el software en el controlador de la bomba de jeringa; se detendrá automáticamente el flujo para 1, 2 o 5 minutos y luego se reiniciará el flujo otra vez. Observar el pico corriente resultante. 
		Nota: Para el análisis de los datos, el pico de corriente o la carga del pico se puede considerar, como se describe en el modelo de una lectura de la señal electroquímica ( figura 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo que presentamos para la fabricación de un biosensor electroquímico de microfluidos permite el desarrollo de una plataforma de bajo costo, compacta y fácil de usar para la detección de biomoléculas. Según el ensayo utilizado luego en el biosensor, pueden detectarse varias diferentes biomarcadores. Esto hace que la plataforma muy versátil y proporciona un amplio acceso a los varios campos de aplicaciones, de pruebas estándar de diagnóstico (por ejemplo, determinar la presencia de enfermedades específi...

En las últimas dos décadas, usos de diagnóstico se han convertido en primarias para estudios en profundidad sobre el desarrollo de la salud pública mundial. Tradicionalmente, se utilizan herramientas de diagnóstico de laboratorio para la detección de enfermedades. A pesar de que todavía juegan un papel clave en el diagnóstico de enfermedades, point-of-care testing (POCT) realizada cerca del paciente o el paciente mismo se ha convertido en más y más común en los últimos años. Especialmente en estos casos que requieren tratamiento inmediato, tales como infarto agudo de miocardio o un control de la diabetes, la confirmación rápida de un resultado clínico es esencial. Por lo tanto, hay una necesidad creciente de dispositivos POCT que puede funcionar por no expertos y que son al mismo tiempo capaces de realizar precisas en vitro las pruebas de diagnóstico en un corto plazo1,2,3,4 .
Ya se han logrado mejoras notables en el campo de POCT. Sin embargo, todavía hay muchos retos que superar5,6,7,8. Para que una plataforma POCT para ser lanzado con éxito al mercado y ser competitivos con los diagnósticos de laboratorio, el dispositivo debe cumplir estrictamente los siguientes requisitos: () proporcionar resultados precisos y cuantitativos que son consistentes con el laboratorio resultados; (ii) tener corto muestra al resultado de las épocas, lo que permite el tratamiento inmediato del paciente; (iii) cuentan con manejo sencillo y fácil, incluso cuando operado por personas no capacitadas y requieren intervención del usuario al mínimo; y (iv) forman parte de una unidad de sensor de bajo costo diseñada para aplicaciones de un solo uso. Además, libre de equipos de diagnóstico es favorable, principalmente en entornos de escasos recursos3,4,6.
Debido a estos requisitos severos, sólo dos sistemas POCT basados en detección electroquímica (por ejemplo, tiras de prueba de sangre glucosa) y en inmunoensayos de flujo lateral (p. ej., pruebas de embarazo caseras) han sido lanzados con éxito al mercado tan hasta ahora. Sin embargo, ambos sistemas sufren desventajas tales como bajo rendimiento (es decir, sangre glucosa control tiene resultados inexactos y análisis de flujo lateral sólo proporcionan resultados cualitativos (positivo o negativo) medición)4, 6. Estos inconvenientes de los sistemas convencionales de POCT han conducido a una demanda creciente en la exploración de nuevas tecnologías que ofrecen detección cuantitativa, rápida y bajo costo en el punto de atención4,5.
Para cumplir con estos retos de dispositivos POCT, tecnología DFR ha sido recientemente empleada para la fabricación de biosensores descartables y de bajo costo9,10,11,12, 13 , 14. con respecto a materiales litográficos suaves y líquidos, como el PDMS o SU-8, DFRs presenta muchos beneficios: (i) están disponibles en una variedad de composiciones y grosores (desde algunas micras a varios milímetros); (ii) tienen una superficie muy áspera, que facilita la adherencia a diversos materiales; (iii) uniformidad de espesor excelente función; (iv) ofrecer fabricación barato, fácil y alto rendimiento para la producción en masa; (v) son fácil de cortar con varias herramientas de bajo costo, como un simple par de tijeras; y (vi) permiten la creación de estructuras tridimensionales, como canales de microfluidos, apilando múltiples capas DFR uno encima del otro.
Por otro lado, DFRs en general tiene una resolución relativamente pobre en comparación con materiales fotoresistentes líquido, que es causada principalmente por el espesor de la película y por el aumento de la distancia entre la máscara y el DFR debido a la lámina protectora, que además permite que la luz dispersión. Todavía, para la fabricación de biosensores microfluídico integrado, DFRs son altamente convenientes para la producción masiva de bajo costo.
Por lo tanto, presentamos en este trabajo la fabricación y aplicación de un biosensor de microfluidos electroquímicos basados en DFR. El protocolo detallado describe cada paso de la producción de la plataforma de biosensores, la inmovilización de la en-viruta de un análisis del modelo basado en el ADN y su lectura electroquímica mediante la técnica de stop-flow. Esta plataforma universal permite la detección de numerosas clases de biomoléculas, utilizando tecnologías de análisis diferentes (por ejemplo, genómica, Celómica y proteómica) o formatos de análisis (p. ej., competitivo, sandwich o directa). Basado en una plataforma de DFR, nuestro grupo con éxito demostrado previamente la cuantificación rápida y sensible de diversos analitos, incluyendo antibióticos13,15,16 (tetraciclina, pristinamicina y antibióticos ß-lactámicos), troponina I17y18de la sustancia P.

<table><tbody><tr><td><Fuerte>Material</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont AP8525R</td><td></td><td>Utilizado como sustrato de poliimida</td></tr><tr><td>MA-N 1420</td><td>Tecnología Micro Resist</td><td>MA-N1420</td><td>Lift-off resit para definir la deposición de platino</td></tr><tr><td>Ma-D 533s</td><td>Tecnología Micro Resist</td><td>MaD533S</td><td>Revelador para MA-N1420</td></tr><tr><td>Platino</td><td>-</td><td>-</td><td>Material del electrodo y de la almohadilla</td></tr><tr><td>de contacto Ma-R 404s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaR404S</td><td>Removedor para MA-N1420</td></tr><tr><td>SU-8 3005</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8-3005</td><td>Fotorresistencia para definir el área del electrodo y como aislamiento</td></tr><tr><td>Acetato de 1-metoxi-2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108-65-6</td><td>Revelador para SU-8 3005</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>8.18766.2500</td><td>Extracción del revelador SU-8</td></tr><tr><td>1020R</td><td>Ultron Systems Inc.</td><td>1020R</td><td>Cinta adhesiva sensible a los rayos UV para la protección de las almohadillas de contacto</td></tr><tr><td>Arguna S</td><td>Degussa</td><td>1935</td><td>Para la deposición de plata en el electrodo de referencia</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Methrom</td><td>62308.020</td><td>Para la cloruro del electrodo de referencia de plata</td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>PC1025</td><td>Película seca fotorresistente</td></tr><tr><td>Carbonato de sodio</td><td>Fluka</td><td>71352</td><td>Revelador para Pyralux PC1025</td></tr><tr><td>Cloruro de hidrógeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30720</td><td>Para rematar el desarrollo del DFR</td></tr><tr><td>Teflon AF 1600</td><td>DuPont</td><td>AF1600</td><td>Para emplear la barrera de detención</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PA104</td><td>Mega Electronics-Tanque</td> <td>de</td> <td>grabado de burbujas</td></tr><tr><td>FED 53</td><td>Binder</td><td>9010-0018</td><td>Horno</td></tr><tr><td>SPIN150</td> <td>recubridora</td><td>APT-Spin</td><td></td></tr> <tr><td>Pr&auml; zitherm</td><td>Harry Gestigkeit GmbH</td><td>PZ 28-2</td><td>Placa calefactora</td></tr><tr><td>Hellas</td><td>Bungard Elektronik</td><td>40000</td><td>Unidad</td></tr><tr><td>de exposición Tetra30-LF-PC</td> Unidad de <td>Diener-Plasma</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Univex 500</td><td>Leybold-Unidad</td> <td>física</td> <td>de deposición de vapor</td></tr><tr><td>Shaker S4</td><td>ELMI-Agitador</td><td></td> <td>orbital</td></tr><tr><td>Sonorex Super 10 P</td><td>Bandelin</td><td>783</td><td>Baño sónico</td></tr><tr><td>6221 CC y CA</td><td>Keithley-Fuente</td> <td>de</td> <td>corriente</td></tr><tr><td>HRL 350</td><td>Ozatec-Unidad</td><td></td> <td>de laminación</td></tr><tr><td>Pluma de vacío Pluma de vacío</td><td>EFD-Pluma</td><td></td> de <td>vacío</td></tr></tbody></table>

seca de la película basada en la fotoresistencia el biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

En los últimos años, diagnóstico de biomarcadores se convirtió en una herramienta indispensable para el diagnóstico de las enfermedades humanas, especialmente para el diagnóstico de punto de atención. Una plataforma de sensor de fácil uso y bajo costo se desea altamente para medir varios tipos de analitos (por ejemplo, biomarcadores, hormonas y fármacos) cuantitativa y específicamente. Por esta razón, película seca fotoresistencia tecnología - barato, fabricación fácil y alto rendimiento - se utiliza para fabricar el biosensor de microfluidos presentado aquí. Dependiendo del bioensayo utilizado luego, la plataforma versátil es capaz de detectar varios tipos de biomoléculas. Para la fabricación del aparato, electrodos de platino se estructuran en una lámina flexible polyimide (PI) en el paso de proceso sólo limpiar la habitación. El papel de PI sirve como sustrato para los electrodos, que están aisladas con una fotoresistencia de epoxy-basado. El canal microfluídico posteriormente es generado por el desarrollo y la laminación de láminas de Fotoprotección (DFR) de película seca en la oblea del PI. Mediante el uso de una barrera hidrofóbica parada en el canal, el canal se separa en dos áreas específicas: una sección de inmovilización para el análisis enzima-ligado y una célula de medición electroquímico para la lectura de la señal amperométrica.
La inmovilización de la prueba biológica de la en-viruta se realiza mediante la adsorción de las biomoléculas a la superficie de la canal. La enzima oxidasa de glucosa se utiliza como un transductor para la generación de señal electroquímica. En presencia del sustrato, la glucosa, se produce peróxido de hidrógeno, que se detecta en el platino electrodo de trabajo. Se aplica la técnica de stop-flow para obtener amplificación de la señal junto con detección rápida. Diferentes biomoléculas se pueden medir cuantitativamente mediante el sistema de microfluidos introducidas, dando una indicación de los diferentes tipos de enfermedades, o, con respecto a drogas terapéuticas vigilancia, facilitando una terapia personalizada.

Diseño y fabricación de la plataforma de biosensores de microfluidos:
La fabricación de los chips de microfluídica biosensor se realiza en el nivel de la oblea por técnicas photolithographic estándar que emplea múltiples capas DFR. Esta estrategia de fabricación se basa en la laminación de capas desarrolladas de DFRs sobre un sustrato de PI con motivos platino, formando los canales microfluídicos. Un breve resumen con los pasos de ...

Una plataforma de biosensores de microfluídica fue diseñada y fabricado utilizando la tecnología de fotoresistencia de película seca de bajo costo para la cuantificación rápida y sensible de diversos analitos. Este sistema de uso único permite la lectura electroquímica de sobre-chip-inmovilizado análisis enzima-ligado mediante la técnica de stop-flow.

Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

El objetivo general de este procedimiento es presentar una plataforma versátil de biosensor electroquímico microfluídico basada en una tecnología de resistencia fotolitográfica en película seca de bajo costo, capaz de medir diversos tipos de analitos dependiendo del ensayo con enzima inmovilizada utilizado posteriormente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las pruebas de diagnóstico inmediato, como la cuantificación de diferentes fármacos, por ejemplo antibióticos, o el diagnóstico de diversas enfermedades como el cáncer. La principal ventaja de esta técnica es que el biosensor aquí presentado se basa principalmente en materiales de bajo costo, es fácil de usar y altamente versátil en cuanto a sus aplicaciones. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos relacionados con las resistencias fotográficas en película seca son difíciles de dominar porque su manipulación requiere mucha formación y práctica. La encargada de demostrar la inmovilización y medición del ensayo en el chip será Eva Grether, una ayudante estudiante de mi grupo. Para comenzar, corte un sustrato de poliimida, o sustrato PI, en obleas redondas de seis pulgadas.Luego, coloque la oblea de PI en un horno a 120 grados Celsius durante aproximadamente una hora para una cocción de deshidratación. Para realizar el primer paso de fotolitografía para el proceso de levantado, programe el codificador de centrifugado para un tiempo de giro de 30 segundos a 3000 rpm con una aceleración de 2000 rpm por segundo. Coloque la oblea de PI sobre el codificador de centrifugado y fíjela aplicando vacío.Luego, inicie el programa del spinner y dispense dos mililitros de una resina, habilitando así el proceso de levantado. Retire la oblea del spinner y realice un horneado suave de la oblea de PI en una placa calefactora durante dos minutos a 100 grados Celsius. Ajuste la máscara deseada para el patrón de los electrodos sobre la oblea de PI a simple vista y expóngala a 400 milijulios por centímetro cuadrado de luz ultravioleta.Luego, coloque la oblea en un recipiente lleno con un revelador compatible con el resist sobre un agitador orbital y déjelo agitarse ligeramente durante un minuto. Después de eliminar el resist excesivo, use una ducha para enjuagar la oblea de PI con agua desionizada en una mesa húmeda, antes de secarla con aire comprimido. A continuación, deposite platino para la formación de los electrodos utilizando un proceso estándar de deposición física de vapor para depositar 200 nanómetros de platino sobre la oblea.Después de colocar la oblea en un recipiente, añada el removedor correspondiente al recipiente y elimine la resistencia de levantamiento, agitando ligeramente la oblea en un agitador orbital hasta que se haya eliminado todo el platino excesivo. Tras enjuagar y secar la oblea de PI como antes, realice el segundo paso de fotolitografía y limpie los electrodos según se describe en el protocolo escrito. A continuación, pase los contactos de platino de la oblea con una cinta adhesiva sensible a UV.Para ello, corte la lámina en tiras de cinco milímetros de ancho y 11 centímetros de largo y fíjelas sobre la oblea, protegiendo las partes que no deben recubrirse con plata. Para la deposición de plata, coloque un baño ultrasónico en una campana extractora e introduzca un recipiente con solución electrolítica de plata en el baño. Ajuste el baño ultrasónico a temperatura ambiente y reduzca la potencia al 10 %. Conecte el contacto de masa de los electrodos de referencia a una fuente de corriente constante.A continuación, conecte el electrodo contador, un alambre de plata que está sumergido en la solución electrolítica de plata, a la fuente de corriente, utilizando cables de conexión estándar. Configure la fuente de corriente en corriente continua (CC) y una densidad de corriente de aproximadamente 4,5 miliamperios por centímetro cuadrado, lo que resulta en una velocidad de deposición de plata de aproximadamente 0,3 micrómetros por minuto. Encienda el baño ultrasónico y deje que la fuente de corriente funcione durante 10 minutos.Después de 10 minutos, enjuague la oblea con agua desionizada. Para realizar el tercer paso de fotolitografía, primero corte las capas de resistencia fotolitográfica en película seca a un tamaño similar al de la oblea. Fije la máscara deseada en la unidad de exposición y alinee la capa de DFR sobre la máscara usando el ojo desnudo.A continuación, ilumine la resistencia con 250 milijulios por centímetro cuadrado de luz UV. Retire la lámina protectora de la resistencia fotosensible y revele la resistencia durante aproximadamente dos minutos en una solución de carbonato de sodio al 1%, utilizando un baño ultrasónico estándar, precalentado a 42 grados Celsius y con potencia ultrasónica al 100%. Para detener inmediatamente la reacción, agite la resistencia durante un minuto en un baño de ácido clorhídrico al 1% en un agitador orbital. Enjuague y seque cada capa de DFR como antes.Para laminar las capas de DFR sobre el sustrato de PI, coloque la oblea de PI sobre una transparencia para retroproyector y fíjela utilizando cinta adhesiva estándar. Ajuste la capa de DFR del canal sobre la oblea de PI bajo un microscopio utilizando las estructuras de alineación respectivas. Para la laminación, utilice un laminador térmico de rodillos estándar y precaliente el rodillo superior a 100 grados Celsius y el rodillo inferior a 60 grados Celsius.Establezca la presión en tres bares con una velocidad de avance de 0,3 metros por minuto. Coloque la oblea con la capa de DFR fija en el centro del laminador e inícielo para que el DFR sea empujado a través del laminador. Repita el paso después de rotar la oblea 180 grados.A continuación, retire la capa protectora del lado frontal de la capa del canal DFR colocando cinta adhesiva estándar en un extremo del DFR y tirando hacia arriba. Utilice un dispensador manual con tubos de 0,004 pulgadas para dispensar pequeñas gotas de politetrafluoroetileno disuelto en los pozos de la capa aislante. Para sellar el chip microfluídico, lamine la capa DFR de cobertura sobre la capa del canal como antes.Luego, realice un horneado fuerte del biosensor microfluídico eliminando primero todas las láminas protectoras de las capas DFR de la cubierta y la parte posterior. Corte los biosensores en tiras utilizando un par común de tijeras. Finalmente, cure los chips en un horno a 160 grados Celsius durante tres horas.Para absorber avidina en el área de inmovilización del canal, dispense dos microlitros de la solución de avidina en la entrada del biosensor. Para asegurar que el flujo se detenga en la barrera durante todo el tiempo de incubación, dispense dos microlitros de agua desionizada en la salida del chip. Incube el chip a 25 grados Celsius durante una hora en un recipiente cerrado.Elimine los reactivos en exceso a través de la entrada del chip aplicando vacío. Luego, lave el canal con 50 microlitros de tampón de lavado dispensado en la salida mientras se aplica el vacío. Seque el canal durante 30 segundos con vacío.Bloquee la superficie del canal para inhibir la unión inespecífica introduciendo dos microlitros de una solución de BSA al 1% en la entrada y dos microlitros de agua desionizada en la salida del canal. Incube el chip a 25 grados Celsius durante una hora en un recipiente cerrado antes de eliminar los reactivos de acceso y secar el canal como antes. A continuación, incube los oligonucleótidos de ADN marcados con biotina y seis FAM dispensando dos microlitros de una concentración de la solución de ADN en la entrada y dos microlitros de agua desionizada en la salida.Incube el chip a 25 grados Celsius durante 15 minutos en un recipiente cerrado antes de retirar los reactivos de acceso y secar el canal. Para inmovilizar los anticuerpos de seis FAM marcados con glucosa oxidasa, introduzca dos microlitros de la solución de anticuerpos en la entrada y dos microlitros de agua desionizada en la salida del canal. Nuevamente, incube los anticuerpos marcados a 25 grados Celsius durante 15 minutos en un recipiente cerrado antes de eliminar los reactivos en exceso.Aplique el espaciador de PMMA fluidico sobre el biosensor y conecte eléctricamente el biosensor al potenciostato. Realice la conexión fluidica de la bomba de jeringa con el biosensor utilizando el adaptador fluidico. Inicie manualmente la bomba de jeringa con un PPS 0,1 molar a un flujo de 20 microlitros por minuto.En el electrodo de trabajo frente al electrodo de referencia integrado en el chip, aplique 30 ciclos de un voltaje alterno de 0,8 y 0,05 voltios durante cinco segundos cada uno. A continuación, oxide el electrodo de trabajo aplicando un voltaje de 0,8 voltios durante 60 segundos. Para iniciar la lectura de la señal del ensayo, espere hasta que la señal de corriente medida se estabilice.Detenga la bomba de jeringa y cambie el reactivo de PPS 0,1 molar a una solución de glucosa 40 milimolar antes de iniciar el software en el controlador de la bomba de jeringa. Después de detener automáticamente el flujo durante uno, dos o cinco minutos, la bomba de jeringa reiniciará nuevamente el flujo. Observe el pico de las corrientes resultantes.El biosensor electroquímico contiene un único canal microfluídico con dos áreas distintas separadas por la barrera hidrofóbica de parada. El área de inmovilización, donde el ensayo se inmoviliza mediante absorción simple de las biomoléculas, y la celda electroquímica donde se realiza la lectura amperométrica del ensayo. Para la lectura amperométrica del biosensor, se utiliza la denominada técnica de parada-de-flujo.Primero, se aplica un flujo constante del sustrato enzimático glucosa. Después de que la señal se estabiliza, el flujo se detiene. Durante la fase de detención, la glucosa se convierte en peróxido de hidrógeno y se acumula en el canal.Al reiniciar el flujo, el peróxido de hidrógeno se hace pasar a través de la celda electroquímica donde es detectado, lo que genera un pico de corriente. Dependiendo de la cantidad de analito unido, y por lo tanto de la cantidad de glucosa oxidasa unida, la altura de la señal varía, lo que da lugar a una curva de calibración de ejemplo, como se observa aquí. Una vez dominada, la fabricación del biosensor puede realizarse en aproximadamente 10 horas si se realiza correctamente.Aunque el tiempo de incubación y lectura del ensayo depende del ensayo empleado, por lo general puede realizarse en menos de tres horas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre la fabricación, preparación del ensayo en chip y operación de los biosensores electroquímicos basados en resistencia fotolitográfica en película seca. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que todos los pasos del protocolo se sigan estrictamente y se realicen con mucha precaución.Dado que el rendimiento del sensor depende en gran medida del proceso de fabricación, las implicaciones de esta técnica se extienden hacia una medicina personalizada que abarca el diagnóstico in situ de diferentes tipos de enfermedades y fármacos, facilitando así una terapia individualizada. No olvide que trabajar con soluciones electrolíticas de plata puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de gafas de seguridad y guantes adecuados, al realizar este procedimiento.

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Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema (Video) | JoVE Journal

Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema

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