Name: Recuento de proteínas en las células con Microarrays de gota direccionable (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Aprende a cuantificar proteínas en células individuales mediante microarrays de gota direccionable. Este método revela la heterogeneidad de expresión de p53 en líneas celulares cancerosas humanas.

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ASR había diseñado experimentos, desarrolló protocolos y análisis de datos. SC y PS realizan experimentos de tamaño celular. ASR y OC escribieron el manuscrito. Los autores desean agradece el apoyo del Prof. David R. Klug para proporcionar acceso al equipo. Los autores desean agradecer la Imperial College avanzado Hackspace para acceso a instalaciones de prototipado y fabricación.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Direccionable de gotita de Microarrays son un método sensible y extensible para determinar cuantitativamente el número de copia absoluta de proteína dentro de una sola célula.
Limitar el nivel de la Unión no específica (NSB) es fundamental en el protocolo para alcanzar hasta un límite de detección posible. Proteínas y otras especies bioquímicas no específicamente pueden obligar a un número de interfaces presentes dentro de las gotas, la superficie del cubreobjetos, el anticuerpo spot y la inte...

El objetivo de este método es determinar la variación en la abundancia de una proteína de la blanco en una población de células con una resolución de única célula. Análisis de célula proporciona una serie de beneficios que no están disponibles con métodos bioquímicos de formación tradicional. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 en primer lugar, trabajar en el nivel unicelular puede capturar la rica heterogeneidad de una población celular que de lo contrario se perdería por el promedio que se produce con técnicas bioquímicas de formación tradicional. La mayoría de los métodos bioquímicos de caballo de trabajo trabaja con la mayor parte, que requieren, como a menudo lo hacen, millones de células para producir un resultado. Por supuesto, las consecuencias de la evaluación de las poblaciones de toda la célula depende de varios factores, por ejemplo, la heterogeneidad en la expresión de la proteína donde pueden perderse algunas características importantes de la distribución de la abundancia de la proteína. Desde una perspectiva práctica, la sensibilidad requiere de técnicas unicelular hacerlos capaces de trabajar con cantidades de material biológico que no es suficiente para incluso las más sensibles a granel técnicas de función. Un ejemplo clave de esto es el estudio de tipos raros de la célula tales como células del tumor (CTC) donde incluso para los pacientes con un pronóstico desalentador pronóstico menos 10 CTC puede estar presente en la sangre solo 7,5 mL sacar de circulación. 6 aquí presentamos la metodología necesaria para realizar las mediciones de proteína unicelular mediante un volumen reducido ensayo basados en anticuerpos empleando gotas aceite tapa impresa en un microarray de anticuerpo.
Plataformas de gota microfluídicos son alto rendimiento, capaz de generar miles de gotas por segundo y capaz de aislar y cultivar incluso, las células en gotas individuales a realizar una amplia gama de Ensayos bioquímicos. Técnicas basadas en la gota son adecuadas para el análisis unicelular,7,8,9 con notables ejemplos recientes incluyendo DropSeq10 y inDrop11, que han sido ayudados grandemente por el poder de técnicas de amplificación. La limitada cantidad de material y no métodos de amplificación para las proteínas hacen única célula proteómica especialmente desafiante.
Gotas pueden ser analizadas por una serie de métodos y microscopía de fluorescencia ha sido ampliamente utilizado. Sola molécula técnicas como microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total permite moléculas fluorescentes para visualizarse con cociente signal-to-noise sin precedentes. 12 debido al decaimiento exponencial del campo evanescente, sólo fluoróforos en gran proximidad a la superficie (orden de 100nm) muy contentos haciendo TIRF una buena estrategia en la detección de pequeñas cantidades de una molécula de la blanco en una mezcla compleja. La fuerza inherente de seccionamiento óptica de TIRF también ayuda a evitar los pasos de lavado y ensayo de límites de tiempo y la complejidad. Sin embargo, TIRF requiere superficies planas y ejemplos de microscopía TIRF aplicado a las gotitas de flujo implican la formación de una superficie plana que a la imagen. 13 para ello, técnicas de proteómica celular solo diseño a menudo chips microfluídicos en agentes de superficie inmovilizado captura en un formato de microarrays. 4 , 14
Las gotitas, ellos mismos, se pueden formar en arreglos de discos en superficies planas, gotita llamada microarrays. 15 , 16 , 17 organizar espacialmente gotitas en arreglos de discos permite que sean convenientemente indexadas, fácilmente monitoreado en el tiempo, individualmente dirigida y, si es necesario, obtenido. Microarrays de gota puede alcanzar una alta densidad de micro reactores con miles de elementos por chip ya sea libre o apoyado por las estructuras de los micropocillos. 18 , 19 , 20 , pueden ser formados por la deposición secuencial por robots de manejo de líquidos, observadores de inyección de tinta, en contacto con microarrayers21,22,23,24,25, 26 o se puede uno montar en superficies tales como superhydrophillic puntos con motivos sobre una superficie superhidrófobos. 27 , 28 , 29
Con estas consideraciones en mente, direccionable gotita Microarrays (ADMs) fueron diseñados para combinar la versatilidad, direccionamiento espacial y volúmenes reducidos de microarrays de gota con la sensibilidad de la microscopía TIRF de sola molécula a cuantitativamente medir la abundancia de la proteína. 5 ADMs permiten análisis de la célula formando un microarray de gotas que contienen las células sobre un microarray de anticuerpo, que luego es cubierto con aceite para evitar la evaporación. Los volúmenes de las gotas son discretos para evitar pérdida de muestra, que de lo contrario se lograría por la en-viruta valvulado en microfluídica de flujo continuo. 30 la cantidad absoluta de proteínas blanco de una sola célula es extremadamente pequeña; sin embargo, el reducido volumen de las gotas permite la relativamente alta concentración local a fin de que se detectan mediante un análisis de anticuerpos del emparedado - anticuerpo es inmovilizado en una región distinta, o de punto, sobre una superficie que capta proteínas que a su vez se une a un anticuerpo de detección fluorescente etiquetado presente en el volumen de la gota. Como un enfoque libre de etiqueta (es decir, proteína de objetivos no es necesario etiquetar directamente), ADMs son generalmente aplicables para el análisis de células a partir de fuentes primarias, tales como sangre procesada, es necesario bien aspirados y biopsias de tumor disociado, así como las células de cultura y los lisados.
Medir la variación en la abundancia de proteínas a través de una población celular es importante en la determinación de la heterogeneidad en la respuesta, por ejemplo, a una droga y ayudará en la provisión de información sobre las funciones celulares y vías, evaluación de subpoblaciones y su comportamiento, así como identificar eventos raros que lo contrario serían ser enmascarados por métodos a granel. Este protocolo describe cómo producir y utilizar gota direccionable microarrays para determinar cuantitativamente la abundancia de la transcripción factor p53 en células cancerosas humanas y puede ser utilizado para investigar el papel de p53 en respuesta a los fármacos quimioterapéuticos. La proteína Diana es determinada por la opción de captura y detección de anticuerpos y puede modificarse para incluir más o diferentes objetivos. Se proporcionan instrucciones para construir un aparato sencillo que incorpora una boquilla concéntrica de consumibles de laboratorio general al array manualmente 10 gotitas de nL con aceite. Se describe el proceso completo experimental por el que cada gota se carga entonces con una sola célula, que luego es lisada y la expresión de proteína determinada con la resolución sola molécula mediante microscopía TIRF.

<table><tbody><tr><td><Cultivo > células fuertes</solución</td> salina tamponada >con <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfato (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM alto contenido de glucosa</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultivo celular</td><td>Corning</td><td>SIAL0639</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcontact Arrayer</td><td>DigiLab, Reino Unido</td><td>OmniGrid Micro</td><td></td></tr><tr><td>Microcontact pin</td><td>ArrayIt, USA</td><td>946MP2</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos (Nexterion)</td><td>Schott, Europa</td><td>1098523</td><td>Tamaño (mm): 65.0 x 25.0; Espesor (mm) 0,17</td></tr><tr><td>p53 captura anticuerpo</td><td>Enzo</td><td>ADI-960-070</td><td></td></tr><tr><td>p53 detección de anticuerpo, Alexa Fluor 488 etiquetado Santa</td><td>Cruz</td><td>sc-126</td><td>concentración de stock 200&mu; g/mL</td></tr><tr><td>Tampón de citrato salino-sódico</td><td>Gibco</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Betaína</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato sódico</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 384 pocillos (bajo volumen)</td><td>Sigma</td><td>CLS4511</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de gas nitrógeno</td><td>BOC</td><td>Grado industrial, libre</td><td></td> de oxígeno</tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte</td><td>>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Droplets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP2</td><td></td></tr><tr><td>Microinyector manual</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram Vario</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>Origio, Dinamarca</td><td>MBB-FP-L-0</td><td></td></tr><tr><td>Bombas de jeringa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-210</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; Jeringa L</td><td>Hamilton</td><td>81020</td><td>Hermética al gas, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>Hamilton</td><td>81327</td><td>A prueba de gas, PTFE Luer</td></tr><tr><td>lock Aislador de silicona</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A-0.5</td><td>6x4 pocillo aislador de silicona con adhesivo</td></tr><tr><td>Cortadora láser</td><td>VersaLASE</td><td>VLS2.30 CO2 Laser 3W</td><td>para el corte láser de aisladores personalizados</td></tr><tr><td>Lámina</td> <td>acrílica de 1 mm de espesorWeatherall-UK</td><td>Clarex Precision Sheet 001</td><td>para el corte láser de aisladores personalizados</td></tr><tr><td>Lámina adhesiva</td><td>3M</td><td></td><td>utilizada para adherir aisladores personalizados a cubreobjetos microarrays</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Loctite</td><td>LOCPFG3T</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu; m ID/360 &mu; m OD tubo de sílice fundida</td><td>IDEX</td><td>FS-115</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/1/16" Diámetro exterior de la tubería PFA</td><td>IDEX</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>0.014" Identificación/0.062" Tubo de PTFE de diámetro exterior</td><td>Kinesis</td><td>008T16-100</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm de diámetro interior/2,0 mm de diámetro exterior Tubo de FEP</td><td>IDEX</td><td>1673</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Agua ultrapura</td><td>Millipore, Alemania</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Microscopía & Microscopio óptico</td>TIRF con platina XY codificada Nikon, Japón Nikon Ti-E EM-CCD Andor Technologies, Irlanda IXON DU-897E Fuente de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>excitación láser</td><td>Vortran, EE. UU.</td><td>Stradus 488-50</td><td></td></tr><tr><td>Fuente láser de lisis óptica</td><td>Continuum, EE. UU</td>. Microscopio <td>Surelite SLI-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> cubo de filtro para TIRF</td><td>Chroma, EE. UU.</td><td>z488bp</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro de microscopio para láser de lisis óptica</td><td>2000, Reino Unido</td><td>LPD01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td><>strong>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Software de</td><td>análisis de imágenes</td>de código <td></td> abierto</tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>versión 7.14 o superior</td><td>Software de análisis de imágenes</td></tr></tbody></table>

recuento de proteínas en las células con microarrays de gota direccionable

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Comportamiento a menudo celular y respuestas celulares se analizan a nivel de población donde se agruparon las respuestas de muchas células como resultado promedio enmascara el comportamiento rico sola célula dentro de una población compleja. Tecnologías de detección y cuantificación de la proteína unicelular han hecho un impacto notable en los últimos años. Aquí describimos una plataforma de análisis práctico y flexible única célula basada en microarrays gotita direccionable. Este estudio describe cómo los números de copia absoluta de proteínas objetivo pueden medirse con una resolución de única célula. El tumor supresor p53 es el gen más comúnmente mutado en el cáncer humano, con más del 50% total de casos de cáncer exhibiendo un patrón de expresión de p53 no saludables. El protocolo describe los pasos para crear 10 gotitas de nL en el que las células cancerosas humanas solo son aisladas y se mide el número de copias de la proteína p53 con la resolución sola molécula para determinar precisamente la variabilidad en la expresión. El método puede aplicarse a cualquier tipo de células incluyendo el material principal para determinar el número de copia absoluta de cualquier proteínas target de interés.

Se determinó el número de copia absoluto basal proteína de p53 con la resolución de la célula en una línea de células de cáncer de colon humano, las células se. Demostramos cómo expresión de p53 puede variar en varios órdenes de magnitud y muestran una correlación positiva débil entre numero de celular proteína y tamaño de copia dentro de la población de la célula sea descansa.
Direccionable de gotita de Microarrays se forman cu...

Aquí presentamos gotita direccionable microarrays (ADMs), un método de arreglo de discos basado en la gota capaces de determinar la abundancia absoluta de proteínas en las células. Demostramos la capacidad de ADMs para caracterizar la heterogeneidad en la expresión de la proteína p53 supresora tumoral en una línea celular de cáncer en humanos.

Recuento de proteínas en las células con Microarrays de gota direccionable

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

El objetivo general de este experimento es determinar el número absoluto de copias de una proteína diana con resolución a nivel de célula individual. Las técnicas de célula individual permitirán una mejor comprensión del comportamiento de una proteína en relación con el dogma central y contribuirán a una cuantificación precisa de la expresión génica regulada. Trabajar a nivel de célula individual puede capturar la rica heterogeneidad de la población celular que, de otro modo, se perdería debido al promedio que ocurre con las técnicas bioquímicas tradicionales.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la sensibilidad de los ensayos de célula individual o a la cantidad limitada de proteína en cada célula. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando deseábamos realizar un ensayo de proteínas de célula individual que pudiera muestrearse fácilmente para análisis posteriores. Comience este procedimiento fabricando chips e imprimiendo microarreglos de anticuerpos según se describe en el protocolo escrito.Para preparar el aparato, introduzca un tramo de 100 milímetros de longitud de tubo de sílice fundida con un diámetro interno de 150 micrones y un diámetro externo de 360 micrones en un tramo de 40 milímetros de tubo PFA con diámetro interno de 1 milímetro y diámetro externo de 1/16 de pulgada, hasta que sobresalga dos milímetros. Esto formará la boquilla concéntrica. Aplique una capa fina de pegamento de cianoacrilato al extremo de una punta de pipeta de 10 microlitros e insértela en el tramo de 40 milímetros de tubo PFA.Si es necesario, reposicione el tubo de sílice fundida para mantener una protrusión de 2 milímetros en la boquilla antes de que el adhesivo se endurezca. Introduzca el otro extremo del capilar de sílice fundida en el extremo de un tubo de PTFE de 200 milímetros de longitud, con un diámetro interno de 014 pulgadas y un diámetro externo de 062 pulgadas. Conecte esto a una jeringa Hamilton de 100 microlitros llena con albúmina sérica bovina al cuatro por ciento en solución salina tamponada con fosfatos.A continuación, inserte un tramo de 400 milímetros de longitud de tubo FEP con un diámetro interno de 1 milímetro y un diámetro externo de 2 milímetros en una punta de pipeta de 200 microlitros hasta que forme un sello. Aplique una capa fina de pegamento de cianoacrilato a otra punta de pipeta de 200 microlitros, luego introduzca esta en la primera punta para fijar el tubo en su lugar. A continuación, conecte el extremo libre del tubo FEP a una jeringa Hamilton de 1 mililitro llena de aceite mineral.Inserte el ensamblaje de punta de pipeta de 200 microlitros en la punta de pipeta de 10 microlitros de la boquilla concéntrica. A continuación, llene la jeringa de 100 microlitros con solución bloqueante de PBSA al 4 por ciento. Vuelva a conectar y enjuague la tubería acuosa con la solución bloqueante.Repetir dos veces para un total de tres lavados. Luego, llenar la jeringa de 100 microlitros con anticuerpo de detección a 0,125 microgramos por litro en PBSA al 4 % y volver a conectar el tubo. Reemplazar la solución bloqueadora en el tubo dispensando 25 microlitros de la solución de anticuerpo de detección.Llene el tubo de aceite con aceite mineral hasta que todo el tubo y la boquilla se llenen de aceite. Luego, rellene nuevamente la jeringa de 1 mililitro con aceite mineral y vuelva a conectar el tubo. Finalmente, asegure el conjunto del tubo y la boquilla a un manipulador XYZ.Para formar gotas direccionables, fije el chip sobre la platina del microscopio. Registre las coordenadas de la platina del microscopio de cada punto en la matriz utilizando el software de control automatizado del microscopio. A continuación, configure el manipulador XYZ sobre la platina del microscopio.Coloque las jeringas en bombas de jeringa separadas, ya que será necesario operarlas de forma independiente. Coloque la boquilla en un ángulo de 50 a 60 grados. Luego, configure la bomba de jeringa acuosa para dispensar 10 nanolitros a 100 microlitros por minuto, y configure la bomba de jeringa de aceite para dispersar 5 microlitros a 100 microlitros por minuto.Dispense la solución acuosa hasta que una gota de líquido sea visible en la punta del cabezal. Toque suavemente la gota con una toallita libre de polvo para eliminarla. Utilizando el software de control automatizado del microscopio, configure las coordenadas de la platina del microscopio en un punto de anticuerpo de la matriz y enfoque la superficie del cubreobjetos.Al alinear la boquilla, tenga cuidado de no perturbar el punto de anticuerpo. Tenga especial precaución y asegúrese de observar la aproximación de la punta del capilar de vidrio a través de un microscopio. Sin perturbar el punto, utilice el manipulador XYZ para alinear la punta del capilar de vidrio de la boquilla concéntrica al lado del punto de anticuerpo.Una vez alineado, dispense 10 nanolitros de solución acuosa. Sin mover las etapas, agregue cinco microlitros de aceite para cubrir la solución acuosa. Eleve lentamente la boquilla fuera del gota y trasládese al siguiente pocillo.Repita este paso para todos los puntos de anticuerpos en la matriz. Después de 30 minutos, obtenga imágenes de todos los puntos en la matriz utilizando el software de control del microscopio automatizado para determinar el fondo de moléculas individuales unidas a cada punto de anticuerpo antes de cargar las células. Para cargar las gotas direccionables con células, suspendimos las células en una solución de anticuerpo de detección de 0,125 microgramos por mililitro en medio L-15 con 10 por ciento de FDS.Filtre la solución celular a través de un filtro celular de 40 micrones de paso para asegurar una suspensión de células individuales. Cargue las células individuales en las gotas direccionables desde el depósito de células utilizando el micromanipulador y la microcapilar. Observando a través de un objetivo de 10x, use el microinyector para aspirar una sola célula dentro de la microcapilar desde el depósito de células.Trabajando manualmente con un joystick, vierta automáticamente utilizando la función de expulsión de una etapa de manipulador electrónico. Retire la micropipeta trasladándola hacia arriba para superar la altura de 1 milímetro del chip. Establezca las coordenadas de la etapa en las de una gota direccionable utilizando el software de control automatizado del microscopio.Inserte la micropipeta devolviéndola a la posición Z almacenada. Realice este paso manualmente con el joystick o de forma automática si utiliza una etapa de manipulación electrónica. Los procesos mecánicos debidos a la lisis inducida por láser pueden crear una emulsión en el borde de la gota que energías de pulso más altas pueden interrumpir completamente.Asegúrese de que las energías de pulso de lisis sean mantenidas al mínimo y de que las células no se depositen en el borde inmediato de las gotas. Dispense las células en la gota direccionable utilizando el microinyector. Observe las células en las gotas mediante microscopía de campo claro, incluyendo cualquier imagen de fluorescencia.También obtenga imágenes de todos los puntos en la matriz mediante microscopía TIRF de molécula individual. Enfóquese en la célula dentro de una gota direccionable. Logre una lisis óptica completa enfocando un único pulso láser de 6 nanosegundos cerca de la ubicación de la célula.Observe el momento en que cada célula se lisa. Adquiera imágenes de moléculas individuales mediante microscopía de fluorescencia por reflexión interna total (TIRF) de todos los puntos cada diez minutos durante los primeros 30 minutos, luego cada 20 minutos durante 60 minutos adicionales. Si solo le interesa la cantidad de proteína unida en equilibrio, obtenga imágenes de todos los puntos tras incubar el chip durante 90 minutos a temperatura ambiente.Para realizar el conteo de moléculas individuales en cualquier punto de anticuerpo no congestionado, cargue la imagen de fondo adquirida antes de la lisis. En Fiji, seleccione la imagen de fondo. En el menú de imagen, seleccione duplicar para copiar la imagen de fondo.Luego, seleccione la imagen duplicada y, en la pestaña filtros del proceso, elija desenfoque gaussiano y especifique un radio de 50 píxeles. Vaya a proceso y seleccione calculadora de imágenes. Allí especifique la operación dividir, las imágenes requeridas, y luego marque las casillas crear nueva ventana y resultado de 32 bits.Reste uno a cada píxel de la imagen. Luego, seleccione un área de 50 píxeles por 50 píxeles en cualquiera de las cuatro esquinas de la imagen plana de fondo. Mida la desviación estándar de la intensidad de los píxeles seleccionando analizar y medir.En ajuste de imagen, seleccione umbral y establezca el nivel de umbral inferior en tres desviaciones estándar. En la máscara de imagen segmentada SM, establezca los valores de intensidad de píxel en cero para cualquier objeto que no tenga un tamaño entre cuatro y nueve píxeles cuadrados y una circularidad entre 0,5 y 1. Para ello, seleccione analizar seguido de analizar partículas y especifique el tamaño y la circularidad.Para los mismos puntos de anticuerpo, cargue y repita los pasos de análisis de datos para todos los fotogramas de imagen capturados como una serie temporal obtenida tras la lisis. En los resultados representativos de imágenes de molécula individual, la señal en las imágenes de fondo muestra el bajo nivel de unión no específica del anticuerpo de detección marcado con fluorescencia hacia la superficie y el punto de anticuerpo. La imagen ampliada en el recuadro muestra moléculas individuales resaltadas con flechas rojas.También se muestra una imagen típica de un ensayo de inmunoprecipitación de p53 en células de carcinoma colorrectal humano BE. Esta secuencia de imágenes muestra la acumulación de la proteína p53 en el punto del anticuerpo. Se utiliza una curva de calibración obtenida con concentraciones conocidas de la proteína recombinante para convertir los conteos de moléculas individuales en cada punto en el número de proteínas diana en el volumen de análisis, lo que sugiere el número de copias a nivel de célula individual.La línea horizontal de puntos roja indica el nivel de unión no específica. La expresión basal de la proteína p53 en células cancerosas de BE muestra una distribución asimétrica larga tipo gamma, en la que la expresión de la proteína p53 en algunas células es significativamente mayor que el valor modal. Aquí, la expresión de la proteína p53 se representa como una función del volumen celular calculado a partir del diámetro celular medido antes de la lisis.Los resultados indican que se mantiene una concentración mínima de la proteína p53 en estas células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la abundancia de una proteína diana con resolución a nivel de célula individual. Al trabajar con células biológicas, es importante recordar que las proteínas pueden degradarse.Una vez dominada, esta técnica puede completarse en menos de cuatro horas si se realiza adecuadamente, y puede incorporarse en protocolos que analicen muestras primarias de pacientes. Las técnicas de célula individual pueden ayudar a comprender la función y el comportamiento celular, así como a identificar eventos raros que de otro modo pasarían desapercibidos con ambos métodos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biología de las líneas celulares de p53 y de cáncer de mama, también puede aplicarse a otros estudios de enfermedades sin necesidad de marcado, lo cual es beneficioso al estudiar células primarias provenientes de muestras de pacientes.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la PCR con puntos cuánticos para responder preguntas adicionales, como determinar si existe una correlación entre la expresión del ARN y la proteína diana. La medición del número absoluto de copias de una proteína resultará atractiva para biomatemáticos y científicos computacionales al apoyar sus modelos biológicos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Gota de plataformas basadas en microfluidos son candidatos prometedores para la experimentación de alto rendimiento, ya que son capaces de generar picolitros, la auto-compartimentado barcos bajo costo en las tasas de kHz. Mediante la integración con rápido, sensible y de alta resolución espectroscópica métodos de fluorescencia, la gran cantidad de información generada dentro de estos sistemas se puede extraer de manera eficiente, aprovechar y utilizar.

Métodos de detección de fluorescencia para las plataformas de las gotas de microfluidos

En este artículo se presenta un chip de microfluidos para el análisis de células individuales. Permite la cuantificación de las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores, y segundos mensajeros por medio de ensayos fluorescentes o inmunoensayos.

Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

Describimos un ensayo digital de punto final para cuantificar ácidos nucleicos con una lectura simplificada (analógica). Medimos la fluorescencia masiva de ensayos digitales basados en gotas utilizando una máquina de qPCR estándar en lugar de instrumentación especializada y confirmamos nuestros resultados mediante microscopía.

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Este protocolo describe la fabricación de una gran escala, multiplexado de ADN o anticuerpo matriz de dos dimensiones, con aplicaciones potenciales en los estudios de la señalización celular y la detección de biomarcadores.

Flow-patrón Fabricación guiada de alta densidad de códigos de barras de anticuerpos microarrays

Se describe un método sensible y preciso para la cuantificación de microRNAs libres de células utilizando una química basada en colorantes y tecnología de PCR digital en gotas.

Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital

Demostramos una tecnología de chip de complemento para realizar inmunoensayos sandwich multiplexados Cruz-reactivity-free simplemente chasquear dos diapositivas. Un aparato de presión se utiliza para transferir confiablemente reactivos de microarray de microarrays. El chip del broche de presión puede utilizarse reacciones bioquímicas que requieren colocalización de diferentes reactivos sin contaminación cruzada.

Rápido Chip para Cruz-reactivity-libre y observador de tiro multiplexado inmunoensayos de Sandwich

Este protocolo describe el proceso general y control de calidad controles necesarios para la preparación de células sanas de mamíferas adultos solo para preparaciones de RNA-Seq de celulares solo basada en gota, alto rendimiento. Secuenciación parámetros, lea alineación y análisis Bioinformático unicelular aguas abajo también se proporcionan.

Transcriptómica de célula basada en código de barras gotita de tejidos mamíferos adultos

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la homogeneidad de etiquetado para cada especie de proteína en una muestra de proteína compleja en el nivel de molécula única.

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

El objetivo general del protocolo es preparar más de un millón de gotas de femtoliter ordenadas, uniformes, estables y biocompatibles sobre un sustrato plano de 1 cm2 que se puede utilizar para la síntesis de proteínas libres de células.

Un arreglo de gotas Femtoliter para la síntesis masiva de proteínas paralelas a partir de moléculas de ADN únicas

Aquí presentamos un protocolo para medir el número absoluto de copias de ADN mitocondrial (mt) y los niveles de heteroplasmia de deleción de ADNmt en células individuales.

Medición del número de copias de ADN mitocondrial unicelular y la heteroplasmia mediante la reacción en cadena de la polimerasa de gotitas digitales

Este método cuantifica la abundancia microbiana utilizando un formato de placa de 96 pocillos para unidades formadoras de colonias de placas (UFC) y se aplica al microbioma de Drosophila en muestras de homogeneización de mosca entera. Las CFU se cuentan con un software automatizado de análisis de imágenes que se proporciona aquí.

Conteo rápido de unidades formadoras de colonias en formato de placa de 96 pocillos aplicado al microbioma de Drosophila

Aprende a cuantificar proteínas en células individuales mediante microarrays de gota direccionable. Este método revela la heterogeneidad de expresión de p53 en líneas celulares cancerosas humanas.

Recuento de proteínas en las células con Microarrays de gota direccionable

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