Name: Recuento de proteínas en las células con Microarrays de gota direccionable (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Aprende a cuantificar proteínas en células individuales mediante microarrays de gota direccionable. Este método revela la heterogeneidad de expresión de p53 en líneas celulares cancerosas humanas.

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ASR había diseñado experimentos, desarrolló protocolos y análisis de datos. SC y PS realizan experimentos de tamaño celular. ASR y OC escribieron el manuscrito. Los autores desean agradece el apoyo del Prof. David R. Klug para proporcionar acceso al equipo. Los autores desean agradecer la Imperial College avanzado Hackspace para acceso a instalaciones de prototipado y fabricación.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Direccionable de gotita de Microarrays son un método sensible y extensible para determinar cuantitativamente el número de copia absoluta de proteína dentro de una sola célula.
Limitar el nivel de la Unión no específica (NSB) es fundamental en el protocolo para alcanzar hasta un límite de detección posible. Proteínas y otras especies bioquímicas no específicamente pueden obligar a un número de interfaces presentes dentro de las gotas, la superficie del cubreobjetos, el anticuerpo spot y la inte...

El objetivo de este método es determinar la variación en la abundancia de una proteína de la blanco en una población de células con una resolución de única célula. Análisis de célula proporciona una serie de beneficios que no están disponibles con métodos bioquímicos de formación tradicional. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 en primer lugar, trabajar en el nivel unicelular puede capturar la rica heterogeneidad de una población celular que de lo contrario se perdería por el promedio que se produce con técnicas bioquímicas de formación tradicional. La mayoría de los métodos bioquímicos de caballo de trabajo trabaja con la mayor parte, que requieren, como a menudo lo hacen, millones de células para producir un resultado. Por supuesto, las consecuencias de la evaluación de las poblaciones de toda la célula depende de varios factores, por ejemplo, la heterogeneidad en la expresión de la proteína donde pueden perderse algunas características importantes de la distribución de la abundancia de la proteína. Desde una perspectiva práctica, la sensibilidad requiere de técnicas unicelular hacerlos capaces de trabajar con cantidades de material biológico que no es suficiente para incluso las más sensibles a granel técnicas de función. Un ejemplo clave de esto es el estudio de tipos raros de la célula tales como células del tumor (CTC) donde incluso para los pacientes con un pronóstico desalentador pronóstico menos 10 CTC puede estar presente en la sangre solo 7,5 mL sacar de circulación. 6 aquí presentamos la metodología necesaria para realizar las mediciones de proteína unicelular mediante un volumen reducido ensayo basados en anticuerpos empleando gotas aceite tapa impresa en un microarray de anticuerpo.
Plataformas de gota microfluídicos son alto rendimiento, capaz de generar miles de gotas por segundo y capaz de aislar y cultivar incluso, las células en gotas individuales a realizar una amplia gama de Ensayos bioquímicos. Técnicas basadas en la gota son adecuadas para el análisis unicelular,7,8,9 con notables ejemplos recientes incluyendo DropSeq10 y inDrop11, que han sido ayudados grandemente por el poder de técnicas de amplificación. La limitada cantidad de material y no métodos de amplificación para las proteínas hacen única célula proteómica especialmente desafiante.
Gotas pueden ser analizadas por una serie de métodos y microscopía de fluorescencia ha sido ampliamente utilizado. Sola molécula técnicas como microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total permite moléculas fluorescentes para visualizarse con cociente signal-to-noise sin precedentes. 12 debido al decaimiento exponencial del campo evanescente, sólo fluoróforos en gran proximidad a la superficie (orden de 100nm) muy contentos haciendo TIRF una buena estrategia en la detección de pequeñas cantidades de una molécula de la blanco en una mezcla compleja. La fuerza inherente de seccionamiento óptica de TIRF también ayuda a evitar los pasos de lavado y ensayo de límites de tiempo y la complejidad. Sin embargo, TIRF requiere superficies planas y ejemplos de microscopía TIRF aplicado a las gotitas de flujo implican la formación de una superficie plana que a la imagen. 13 para ello, técnicas de proteómica celular solo diseño a menudo chips microfluídicos en agentes de superficie inmovilizado captura en un formato de microarrays. 4 , 14
Las gotitas, ellos mismos, se pueden formar en arreglos de discos en superficies planas, gotita llamada microarrays. 15 , 16 , 17 organizar espacialmente gotitas en arreglos de discos permite que sean convenientemente indexadas, fácilmente monitoreado en el tiempo, individualmente dirigida y, si es necesario, obtenido. Microarrays de gota puede alcanzar una alta densidad de micro reactores con miles de elementos por chip ya sea libre o apoyado por las estructuras de los micropocillos. 18 , 19 , 20 , pueden ser formados por la deposición secuencial por robots de manejo de líquidos, observadores de inyección de tinta, en contacto con microarrayers21,22,23,24,25, 26 o se puede uno montar en superficies tales como superhydrophillic puntos con motivos sobre una superficie superhidrófobos. 27 , 28 , 29
Con estas consideraciones en mente, direccionable gotita Microarrays (ADMs) fueron diseñados para combinar la versatilidad, direccionamiento espacial y volúmenes reducidos de microarrays de gota con la sensibilidad de la microscopía TIRF de sola molécula a cuantitativamente medir la abundancia de la proteína. 5 ADMs permiten análisis de la célula formando un microarray de gotas que contienen las células sobre un microarray de anticuerpo, que luego es cubierto con aceite para evitar la evaporación. Los volúmenes de las gotas son discretos para evitar pérdida de muestra, que de lo contrario se lograría por la en-viruta valvulado en microfluídica de flujo continuo. 30 la cantidad absoluta de proteínas blanco de una sola célula es extremadamente pequeña; sin embargo, el reducido volumen de las gotas permite la relativamente alta concentración local a fin de que se detectan mediante un análisis de anticuerpos del emparedado - anticuerpo es inmovilizado en una región distinta, o de punto, sobre una superficie que capta proteínas que a su vez se une a un anticuerpo de detección fluorescente etiquetado presente en el volumen de la gota. Como un enfoque libre de etiqueta (es decir, proteína de objetivos no es necesario etiquetar directamente), ADMs son generalmente aplicables para el análisis de células a partir de fuentes primarias, tales como sangre procesada, es necesario bien aspirados y biopsias de tumor disociado, así como las células de cultura y los lisados.
Medir la variación en la abundancia de proteínas a través de una población celular es importante en la determinación de la heterogeneidad en la respuesta, por ejemplo, a una droga y ayudará en la provisión de información sobre las funciones celulares y vías, evaluación de subpoblaciones y su comportamiento, así como identificar eventos raros que lo contrario serían ser enmascarados por métodos a granel. Este protocolo describe cómo producir y utilizar gota direccionable microarrays para determinar cuantitativamente la abundancia de la transcripción factor p53 en células cancerosas humanas y puede ser utilizado para investigar el papel de p53 en respuesta a los fármacos quimioterapéuticos. La proteína Diana es determinada por la opción de captura y detección de anticuerpos y puede modificarse para incluir más o diferentes objetivos. Se proporcionan instrucciones para construir un aparato sencillo que incorpora una boquilla concéntrica de consumibles de laboratorio general al array manualmente 10 gotitas de nL con aceite. Se describe el proceso completo experimental por el que cada gota se carga entonces con una sola célula, que luego es lisada y la expresión de proteína determinada con la resolución sola molécula mediante microscopía TIRF.

<table><tbody><tr><td><Cultivo > células fuertes</solución</td> salina tamponada >con <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfato (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM alto contenido de glucosa</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultivo celular</td><td>Corning</td><td>SIAL0639</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcontact Arrayer</td><td>DigiLab, Reino Unido</td><td>OmniGrid Micro</td><td></td></tr><tr><td>Microcontact pin</td><td>ArrayIt, USA</td><td>946MP2</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos (Nexterion)</td><td>Schott, Europa</td><td>1098523</td><td>Tamaño (mm): 65.0 x 25.0; Espesor (mm) 0,17</td></tr><tr><td>p53 captura anticuerpo</td><td>Enzo</td><td>ADI-960-070</td><td></td></tr><tr><td>p53 detección de anticuerpo, Alexa Fluor 488 etiquetado Santa</td><td>Cruz</td><td>sc-126</td><td>concentración de stock 200&mu; g/mL</td></tr><tr><td>Tampón de citrato salino-sódico</td><td>Gibco</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Betaína</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato sódico</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 384 pocillos (bajo volumen)</td><td>Sigma</td><td>CLS4511</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de gas nitrógeno</td><td>BOC</td><td>Grado industrial, libre</td><td></td> de oxígeno</tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte</td><td>>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Droplets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP2</td><td></td></tr><tr><td>Microinyector manual</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram Vario</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>Origio, Dinamarca</td><td>MBB-FP-L-0</td><td></td></tr><tr><td>Bombas de jeringa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-210</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; Jeringa L</td><td>Hamilton</td><td>81020</td><td>Hermética al gas, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>Hamilton</td><td>81327</td><td>A prueba de gas, PTFE Luer</td></tr><tr><td>lock Aislador de silicona</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A-0.5</td><td>6x4 pocillo aislador de silicona con adhesivo</td></tr><tr><td>Cortadora láser</td><td>VersaLASE</td><td>VLS2.30 CO2 Laser 3W</td><td>para el corte láser de aisladores personalizados</td></tr><tr><td>Lámina</td> <td>acrílica de 1 mm de espesorWeatherall-UK</td><td>Clarex Precision Sheet 001</td><td>para el corte láser de aisladores personalizados</td></tr><tr><td>Lámina adhesiva</td><td>3M</td><td></td><td>utilizada para adherir aisladores personalizados a cubreobjetos microarrays</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Loctite</td><td>LOCPFG3T</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu; m ID/360 &mu; m OD tubo de sílice fundida</td><td>IDEX</td><td>FS-115</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/1/16" Diámetro exterior de la tubería PFA</td><td>IDEX</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>0.014" Identificación/0.062" Tubo de PTFE de diámetro exterior</td><td>Kinesis</td><td>008T16-100</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm de diámetro interior/2,0 mm de diámetro exterior Tubo de FEP</td><td>IDEX</td><td>1673</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Agua ultrapura</td><td>Millipore, Alemania</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Microscopía & Microscopio óptico</td>TIRF con platina XY codificada Nikon, Japón Nikon Ti-E EM-CCD Andor Technologies, Irlanda IXON DU-897E Fuente de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>excitación láser</td><td>Vortran, EE. UU.</td><td>Stradus 488-50</td><td></td></tr><tr><td>Fuente láser de lisis óptica</td><td>Continuum, EE. UU</td>. Microscopio <td>Surelite SLI-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> cubo de filtro para TIRF</td><td>Chroma, EE. UU.</td><td>z488bp</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro de microscopio para láser de lisis óptica</td><td>2000, Reino Unido</td><td>LPD01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td><>strong>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Software de</td><td>análisis de imágenes</td>de código <td></td> abierto</tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>versión 7.14 o superior</td><td>Software de análisis de imágenes</td></tr></tbody></table>

recuento de proteínas en las células con microarrays de gota direccionable

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Comportamiento a menudo celular y respuestas celulares se analizan a nivel de población donde se agruparon las respuestas de muchas células como resultado promedio enmascara el comportamiento rico sola célula dentro de una población compleja. Tecnologías de detección y cuantificación de la proteína unicelular han hecho un impacto notable en los últimos años. Aquí describimos una plataforma de análisis práctico y flexible única célula basada en microarrays gotita direccionable. Este estudio describe cómo los números de copia absoluta de proteínas objetivo pueden medirse con una resolución de única célula. El tumor supresor p53 es el gen más comúnmente mutado en el cáncer humano, con más del 50% total de casos de cáncer exhibiendo un patrón de expresión de p53 no saludables. El protocolo describe los pasos para crear 10 gotitas de nL en el que las células cancerosas humanas solo son aisladas y se mide el número de copias de la proteína p53 con la resolución sola molécula para determinar precisamente la variabilidad en la expresión. El método puede aplicarse a cualquier tipo de células incluyendo el material principal para determinar el número de copia absoluta de cualquier proteínas target de interés.

Se determinó el número de copia absoluto basal proteína de p53 con la resolución de la célula en una línea de células de cáncer de colon humano, las células se. Demostramos cómo expresión de p53 puede variar en varios órdenes de magnitud y muestran una correlación positiva débil entre numero de celular proteína y tamaño de copia dentro de la población de la célula sea descansa.
Direccionable de gotita de Microarrays se forman cu...

Aquí presentamos gotita direccionable microarrays (ADMs), un método de arreglo de discos basado en la gota capaces de determinar la abundancia absoluta de proteínas en las células. Demostramos la capacidad de ADMs para caracterizar la heterogeneidad en la expresión de la proteína p53 supresora tumoral en una línea celular de cáncer en humanos.

Recuento de proteínas en las células con Microarrays de gota direccionable

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

El objetivo general de este experimento es determinar el número absoluto de copias de una proteína diana con resolución a nivel de célula individual. Las técnicas de célula individual permitirán una mejor comprensión del comportamiento de una proteína en relación con el dogma central y contribuirán a una cuantificación precisa de la expresión génica regulada. Trabajar a nivel de célula individual puede capturar la rica heterogeneidad de la población celular que, de otro modo, se perdería debido al promedio que ocurre con las técnicas bioquímicas tradicionales.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la sensibilidad de los ensayos de célula individual o a la cantidad limitada de proteína en cada célula. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando deseábamos realizar un ensayo de proteínas de célula individual que pudiera muestrearse fácilmente para análisis posteriores. Comience este procedimiento fabricando chips e imprimiendo microarreglos de anticuerpos según se describe en el protocolo escrito.Para preparar el aparato, introduzca un tramo de 100 milímetros de longitud de tubo de sílice fundida con un diámetro interno de 150 micro

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Gota de plataformas basadas en microfluidos son candidatos prometedores para la experimentación de alto rendimiento, ya que son capaces de generar picolitros, la auto-compartimentado barcos bajo costo en las tasas de kHz. Mediante la integración con rápido, sensible y de alta resolución espectroscópica métodos de fluorescencia, la gran cantidad de información generada dentro de estos sistemas se puede extraer de manera eficiente, aprovechar y utilizar.

Métodos de detección de fluorescencia para las plataformas de las gotas de microfluidos

En este artículo se presenta un chip de microfluidos para el análisis de células individuales. Permite la cuantificación de las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores, y segundos mensajeros por medio de ensayos fluorescentes o inmunoensayos.

Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

Describimos un ensayo digital de punto final para cuantificar ácidos nucleicos con una lectura simplificada (analógica). Medimos la fluorescencia masiva de ensayos digitales basados en gotas utilizando una máquina de qPCR estándar en lugar de instrumentación especializada y confirmamos nuestros resultados mediante microscopía.

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Este protocolo describe la fabricación de una gran escala, multiplexado de ADN o anticuerpo matriz de dos dimensiones, con aplicaciones potenciales en los estudios de la señalización celular y la detección de biomarcadores.

Flow-patrón Fabricación guiada de alta densidad de códigos de barras de anticuerpos microarrays

Se describe un método sensible y preciso para la cuantificación de microRNAs libres de células utilizando una química basada en colorantes y tecnología de PCR digital en gotas.

Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital

Demostramos una tecnología de chip de complemento para realizar inmunoensayos sandwich multiplexados Cruz-reactivity-free simplemente chasquear dos diapositivas. Un aparato de presión se utiliza para transferir confiablemente reactivos de microarray de microarrays. El chip del broche de presión puede utilizarse reacciones bioquímicas que requieren colocalización de diferentes reactivos sin contaminación cruzada.

Rápido Chip para Cruz-reactivity-libre y observador de tiro multiplexado inmunoensayos de Sandwich

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la homogeneidad de etiquetado para cada especie de proteína en una muestra de proteína compleja en el nivel de molécula única.

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

El objetivo general del protocolo es preparar más de un millón de gotas de femtoliter ordenadas, uniformes, estables y biocompatibles sobre un sustrato plano de 1 cm2 que se puede utilizar para la síntesis de proteínas libres de células.

Un arreglo de gotas Femtoliter para la síntesis masiva de proteínas paralelas a partir de moléculas de ADN únicas

Aquí presentamos un protocolo para medir el número absoluto de copias de ADN mitocondrial (mt) y los niveles de heteroplasmia de deleción de ADNmt en células individuales.

Medición del número de copias de ADN mitocondrial unicelular y la heteroplasmia mediante la reacción en cadena de la polimerasa de gotitas digitales

Este método cuantifica la abundancia microbiana utilizando un formato de placa de 96 pocillos para unidades formadoras de colonias de placas (UFC) y se aplica al microbioma de Drosophila en muestras de homogeneización de mosca entera. Las CFU se cuentan con un software automatizado de análisis de imágenes que se proporciona aquí.

Conteo rápido de unidades formadoras de colonias en formato de placa de 96 pocillos aplicado al microbioma de Drosophila

El protocolo describe una plataforma microfluídica avanzada para medir cuantitativamente la dinámica de secreción de citocinas de células mononucleares individuales de sangre periférica humana. La plataforma mide hasta tres citocinas en paralelo (IL-6, TNFα e IL-1β) para cada célula individual estimulada con lipopolisacárido como ejemplo.

Enfoque microfluídico para resolver la secreción simultánea y secuencial de citocinas de células polifuncionales individuales 

Aprende a cuantificar proteínas en células individuales mediante microarrays de gota direccionable. Este método revela la heterogeneidad de expresión de p53 en líneas celulares cancerosas humanas.

Recuento de proteínas en las células con Microarrays de gota direccionable

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