Name: Resolución súper correlativo y la microscopia electrónica para resolver la localización de la proteína en la Retina del pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Aprende a localizar proteínas en la retina de Danio rerio mediante microscopía supercorrelativa y electrónica de barrido. Este método preciso permite estudiar el desarrollo retiniano y las vías celulares in vivo.

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Financiación de ION y RGB: suizo ciencia Fundación Ambizione-puntaje nacional concede PZ00P3 142404/1 y PZ00P3 163979.

todos los experimentos fueron realizados con arreglo a la declaración de ARVO para el uso de animales en oftálmica y la investigación de la visión y fueron aprobados por las autoridades locales.
 1. preparación de secciones ultrafinas sobre obleas de silicio fijación de la muestra de <ol><li><ol><li>preparar la solución fijadora que contiene 0.1% de glutaraldehído, formaldehído al 4% en buffer de cacodilato 0.1m. 
		Nota: atención! Tenga cuidado al trabajar con glutaraldehído, el formaldehído y el cacodilato buffer, usar equipo de protección personal y trabajar en una campana de humos.</li>
		<li>Eutanasia 5 días post fertilización (5 PD) larvas de pez cebra con Metanosulfonato (Metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato, 0.4% p/v en PBS (tampón fosfato salino, pH 7)) como se describió anteriormente 15.</li>
		<li>Fijar las larvas por inmersión en solución de fijación previamente enfriado en hielo. Quitar la cabeza e incubar durante una noche a 4 ° C con oscilación suave.</li>
		<li>Diseccionar los ojos por recortar el tejido alrededor del ojo con finas pinzas y un bisturí de microdisección (debajo de un binocular) en solución fijadora enfriada en una placa de agarosa-camas de 1%. Transfiera los ojos a un tubo con fijador previamente refrigerado fresco.</li>
		<li>Lavar dos veces en PBS (tampón fosfato salino, pH 7.4) durante 5 minutos cada lavado a temperatura ambiente (RT).</li>
	</ol></li> <li>Infiltración de gelatina y montaje <ol><li>Warm up 15 mL comida local marca gelatina 12% w/v en PB (tampón fosfato, 0.1 M pH 7,4) a 40 ° C. retirar el PBS y añadir solución de gelatina en los tubos que contienen los ojos. Golpee el tubo suavemente para asegurar el gelatina infiltra la muestra e incubar por 10-30 min a 40 ° C en un termobloque con agitación suave o en baño de agua.</li>
		<li>Llenar 12 mm x 5 mm x 3 mm de silicona o polietileno plana empotrar moldes con gelatina caliente en un baño de agua de 40 ° C. Agregar dos ojos molde usando una pipeta, alinearlos correctamente bajo un binocular utilizando una aguja de disección y dejar que la gelatina enfríe a temperatura ambiente durante 1 min y endurecen a 4 ° C durante 20 min</li>
		<li>Volver a recortar el bloque de gelatina bajo los binoculares para caber un ojo por bloque, utilizando una cuchilla de afeitar.</li>
		<li>Transferir los ojos de gelatina encajado a 2,3 M de sacarosa en PB en el hielo. Incubar a 4 ° C durante la noche.</li>
		<li>Intercambio de nueva solución de sacarosa de 2,3 M y almacenar a 4 ° C o -20 ° C; después de este paso, las muestras están listas para seccionamiento o pueden almacenarse a-20 ° C durante varias semanas a meses.</li>
		<li>Volver a recortar el bloque de gelatina a casi del tamaño del ojo antes de transferir a un crio-pin. Congelación en nitrógeno líquido y la transferencia a un crio-ultramicrotomía.</li>
	</ol></li> <li>Cryosectioning <ol><li>corte 110 nm de espesor-secciones a-120 ° C con un cuchillo de diamante en el cryo-ultramicrotomía.</li>
		<li>Escoge las secciones con un lazo de conexión que contienen una gota de metilcelulosa al 2% (en agua) y solución de sacarosa de 2,3 M (1:1). Transferencia de secciones a una oblea de silicio de 7 x 7 mm. Almacenar las secciones de 4 ° C hasta el procesamiento más.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunolabelling <ol><li>obleas de lavado con PBS a 0 ° C por 20 min en cuatro gotas colocando boca abajo las obleas en las gotas. Lavado en PBS 2 x 2 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar 3 veces en el 0,15% de glicina en PBS, durante 1 minuto. Lavar 3 veces durante 1 min/lavado con PBS. Pre-incubate con PBG (PBS con BSA albúmina de suero bovino de 0.5% y 0.2% gelatina tipo B) por 5 min</li>
	<li>Incubar con conejo anti-Tom20 (véase la Tabla de materiales) en PBG (4 μg/mL) durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave 6 x para 1 min/lavado en el PBG. Pre-incubate con PBG durante 5 minutos a RT. incubar con anti-conejo Alexa 647 F(ab&#39;) 2 (véase la Tabla de materiales) en PBG (7,5 μg/mL) durante 30 minutos</li>
	<li>Lave 6 x para 1 min/lavado en el PBG. Lavado 3 x 2 minutos en PBS. Incubar con DAPI (4 μg/mL) en PBS durante 10 s. lavado 2 x 2 minutos en PBS.</li>
</ol> 3. Microscopia de la estupendo-resolución <ol><li>incubar la oblea brevemente (10 s) colocando en una gota de una solución de 1:1 de glicerol (80%) y proyección de imagen tampón que contiene un oxígeno limpieza sistema (200 mM de tampón fosfato que contiene glucosa 10%, 0, 5 mg/mL glucoseoxidase, 40 la catalasa μg/mL, clorhidrato de beta-mercaptoethylamine de 15 mM (MEA HCL), pH 8.0).</li>
	<li>Transferir las obleas (sección hacia abajo) a un plato de Petri de vidrio inferior (grueso 170 ± 5 μm) en una dulce gota de la mezcla 1:1 de glicerol (80%) y buffer (como en el paso 3.1) la proyección de imagen.</li>
	<li>Eliminar de todos lados, con una pipeta, la mayor parte del líquido por debajo de la oblea. Utilizar bandas de silicona para fijar la oblea en el fondo de la caja Petri. 
	Nota: Rayas de silicona están hechos de silicona-pegamento de dos componentes (3 x 12 mm).</li>
	Secciones de <li>de imagen en un microscopio invertido con una alta apertura numérica (por ejemplo 160 X / NA 1.43; véase la Tabla de materiales) objetivo dedicado de super resolución de inmersión de aceite. Antes de la proyección de imagen, que las muestras alcancen la temperatura de microscopio con el fin de minimizar/reducir la deriva lateral y axial.</li>
	<li>Centro de la zona de interés y adquirir imágenes de referencia de epifluorescencia widefield primera. Cambiar el modo de operación de super resolución. Ajustar el tiempo de exposición de la cámara a 15 ms y fijar el electrón multiplicando la ganancia (EM) a un máximo de 300.</li>
	<li>Muestra se iluminan con la 642 nm láser de onda continua a máxima energía (correspondiente a ~2.8 kW/cm 2) en el modo de epifluorescencia. Tan pronto como la molécula solo parpadea están bien separadas en cada fotograma, por lo que la probabilidad es baja, que las señales individuales se superponen, la potencia del láser a ~0.7 kW/cm 2. Grabar la imagen raw en modo de epifluorescencia mediante la adquisición de un mínimo de 30.000 marcos. 
	Nota: Todos estos parámetros pueden variar dependiendo de diferentes muestras y etiquetado densidad.</li>
	<li>De los datos sin procesar, generar una lista de eventos de reconstrucción (localizaciones de cada molécula solo parpadeo en la imagen raw) con un umbral de detección de 30 fotones (tiene que ser ajustado según la muestra) haciendo clic en &#34; evaluar &#34; en la &#39; serie t Análisis de &#39; en &#39; herramientas de &#39;.</li>
	<li>Visualizar la imagen de super resolución por ajuste gaussiano 16 aplicar un tamaño de píxel de representación de 4 nm haciendo clic en &#34; crear imagen &#34; en el &#39; panel de elaboración de lista de eventos &#39; en &#39; Tools. &#39; 
	Nota: Las herramientas de software integrado del sistema utilizado en este estudio fueron empleadas para generar la imagen super resuelta. Sin embargo, la proyección de imagen de resolución super descrito podría realizarse en cualquier otro sistema de localización basado en la sola molécula, y podrían ser procesados los datos con herramientas de software de código abierto como tormenta 17.</li>
</ol> 4. Sombra de platino <ol><li>quitar rayas de silicio y añada una gota de PBS cerca de los bordes de la oblea a levante de la caja Petri. Lave la oblea min 2 x 2 en PBS, luego post arreglarlo con glutaraldehído 0.1% en PBS por 5 minutos Lave 2 x por 2 min/lavado en PBS.</li>
	<li>Incubar la oblea dos veces durante 5 min/incubación en 1 gota de metilcelulosa al 2% en agua con hielo. Inserte la oblea en un tubo de centrífuga y centrifugar a 14.100 g x 90 s. montaje en un trozo de aluminio de SEM con realización de cemento carbono.</li>
	<li>Añadir una capa de 2 a 10 nm de platino/carbón en la muestra de sombreado rotatorio en 8° con un electrón viga ajustes de dispositivo de evaporación: 1.55 kV, 55 mA, a 0,3 nm/s y un ángulo de 8°, nivel de rotación 4.</li>
</ol> 5. Microscopía electrónica de barrido <ol><li>las secciones de la imagen con un barrido electrón microscope 1,5 kV, 2 mm trabajando a distancia y con un lente detector de electrones secundarios.</li>
</ol> 6. Alineación de la luz y la microscopia electrónica imágenes <ol><li>abrir ambos tipos de imágenes con Fiji 18 haciendo clic en &#34; archivo | Abierto &#34;. Ajustar el tamaño del lienzo haciendo clic en &#34; imagen | Ajustar | Tamaño de la lona &#34; y ambas imágenes una pila haciendo clic en &#34; imagen | Pilas | Imágenes de pila &#34;. Guarde la pila como tipo de archivo tiff.</li>
	<li>En Fiji, abra una nueva interfaz de 19 TrackEM2 haciendo clic en &#34; archivo | nuevo | TrackEM2 (nuevo) &#34;. Importar la pila con dos imágenes haciendo clic derecho sobre la ventana negra y seleccionando &#34; pila de importación &#34;.</li>
	Imagen de microscopía de <li>luz Alinee a microscopia electrónica imagen manualmente con puntos de referencia utilizando un clic derecho del ratón sobre la imagen y seleccionando &#34; Alinee | Alinear capas manualmente con puntos de referencia &#34;.
	Herramienta de <ol><li>pick la selección (la flecha negra) para agregar puntos de interés. Utilice la forma de núcleos como referencia para seleccionar los bordes de la misma en las dos imágenes (figura 1 complementaria). Agregar varios puntos (mínimos tres puntos tienen que ser seleccionados). Aplique alineación con un modelo afín por derecho del ratón hacer clic y seleccionar &#34; aplicar transformación | Modelo afín &#34;.</li>
	</ol></li> <li>Cambiar la transparencia de la capa (ver figura 1 complementaria) para evaluar la calidad de la alineación.</li></ol>

<ol><li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+Super-Resolution+Microscopy%3A+New+Dimensions+and+New+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Fölling, J., Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li>
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<li>Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliopathy+gene+cc2d2a+controls+zebrafish+photoreceptor+outer+segment+development+through+a+role+in+Rab8-dependent+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking.</a> Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).</li>
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<li>Mateos, J. M., Guhl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+contrast+of+ultrathin+cryo-sections+for+correlative+super-resolution+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy.</a> Sci Rep. 6, 34062(2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., Saalfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS one. 7 (6), e38011(2012).</li>
<li>Wurm, C. A., Neumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+distribution+of+mitochondrial+import+receptor+Tom20+is+adjusted+to+cellular+conditions+and+exhibits+an+inner-cellular+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).</li>
<li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17947990">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este método combina localización de proteína Super resuelto con información de contexto para determinar la posición exacta de las proteínas en un organelo. Aquí demostramos la realización del experimento para visualizar la expresión de Tom20 en la membrana externa de las mitocondrias y su relación con otros orgánulos como el núcleo o segmentos externos de los fotorreceptores en la retina de pez cebra larval.
Tokuyasu crio-seccionado requiere cierto entrenamiento para adquirir las secciones bien conservadas. Sin embargo, este es un método utilizado en muchos laboratorios con éxito demostrado21. Transferencia de las secciones a la oblea de silicio es muy simple y no hay consideraciones especiales son necesarias. El uso de glicerol en el buffer de imagen es un paso muy importante para evitar el secado de las secciones. Para la proyección de imagen de súper-resolución los mejores resultados se obtienen cuando la oblea está muy cerca de la parte inferior de cristal de la placa de Petri. Las bandas de silicona ayudan a mantener la oblea en esta posición. Especial cuidado debe tomarse mientras se retira la banda para evitar daños en las secciones.
El espesor de las secciones de cryo, alrededor de 100 nm, más delgado que la resolución óptica en la dimensión Z, además facilita la precisión de este método correlativo como la señal de la microscopía de superresolución proviene sólo de esta capa delgada y la microscopio electrónico de barrido de señal muestra la topografía de la muestra. Este método podría también combinarse con imágenes multicolor. Sin embargo, debe tenerse especial cuidado que la muestra puede ser reflejada en mismas condiciones (por ejemplo proyección de imagen tampón) y charla de la Cruz debe ser prevenido.
Una limitación del método es sus dos dimensiones acercarse, ya que sólo un número limitado de secciones seriadas (de 3 a 7 por oblea) puede ser recogido. Así, proyectos con análisis de volumen no sería ideal. Sin embargo, es un método que puede aplicarse para detectar la expresión de la proteína en cualquier tipo de tejido por simple corte de la muestra. Ofrecemos un método sin el uso de agentes de contraste clásico como el acetato de uranilo, citrato plomo. El contraste por sombreado platino proporciona contraste topográfico muy informativo, pero en algunos casos las membranas son difíciles de resolver. Esto puede plantear problemas para los proyectos que necesitan, por ejemplo, para determinar la expresión de proteínas en pequeñas vesículas.
Nuestro protocolo, basado en Tokuyasu cryo-secciones, utiliza equipo estándar para obtener resultados correlativos de super-resolución y microscopios electrónicos de barrido. La colección de secciones sobre obleas de silicio y el uso de platino para contraste son pasos para proporcionar estabilidad y reproducibilidad para la preparación de la muestra.

Métodos para determinar la localización subcelular de las proteínas y su relación con diferentes compartimentos de la célula son herramientas esenciales para comprender sus funciones y las interacciones posibles. Microscopía de superresolución en combinación con microscopia electrónica proporciona tal información1. Microscopia de agotamiento de estado seguida por el retorno de la molécula individual (GSDIM) es una tecnología de microscopía de superresolución compatible con una amplia gama de fluoróforos orgánicos y genéticamente codificado2 y alcanza una resolución lateral hasta 20 nm 3. la incorporación de métodos con mayor resolución que la microscopía estándar de difracción limitada mejora la precisión de la correlación4,5,6. Se recomiendan para lograr la mejor correlación de la expresión de la proteína con un compartimiento subcelular específico y reducir el volumen de incertidumbre7 el uso de la misma sección ultrafina de luz y microscopia electrónica. Entre los diferentes métodos de seccionamiento, Tokuyasu cryo-sección Protocolo no requiere deshidratación o incrustación de resina y, además, conserva la antigenicidad de muchos epítopos y proporciona buen tejido ultraestructura8. Varios métodos han demostrado la aplicabilidad de estas secciones en correlativa luz y microscopia electrónica (CLEM)4,5,9,10.
La retina de pez cebra es un modelo valioso para el estudio de desarrollo visual y los mecanismos de enfermedades humanas dados su función y estructura altamente conservado a través de vertebrados. En particular, retina fotorreceptores pantalla la misma arquitectura que los fotorreceptores mamíferos, con una sinapsis basal, un núcleo apico-base alargada, agrupamiento de las mitocondrias en el segmento interno más apical y un segmento externo compuesto de membrana discos en la posición más apical11. Localización de la proteína para los diferentes compartimentos celulares es conservado entre pez cebra y humanos, permitiendo la investigación de la función biológica de proteínas relevantes para la enfermedad humana12,13.
Aquí presentamos un protocolo para preparar pez cebra larvas muestras de retina a resolver la localización de la proteína de la membrana externa mitocondrial Tom20 correlativos resolución súper luz y microscopia electrónica. El método se basa en la recogida cryo-secciones sobre obleas de silicio y obtener contraste información topográfica producida después de la aplicación de una fina capa de platino. Estos pasos son técnicas claras mejoras en términos de facilidad de uso, la reproducibilidad y el tiempo para completar los experimentos. Recientemente hemos demostrado la aplicabilidad del método para detectar poros nucleares y proteínas mitocondriales en el tejido de ratón14.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído EM Grado</td><td>EMS, EE. UU.</td><td>#16220</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato</td><td>Merck</td><td>#8.20670</td><td></td></tr><tr><td>Tricaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa, peqGOLD Universal</td><td>VWR International GmbH</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Moldes</td> <td>de incrustación planosBEEM Flat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de marca de alimentos locales</td><td>Dr.Oetker</td><td>Extra Gold</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Merck</td><td>#1.07687</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>Sigma</td><td>#M-6385</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>#G-7126</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina tipo B</td><td>Sigma</td><td>#G-6650</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>#A6588.0050</td><td></td></tr><tr><td>Oblea de silicio</td><td>Si-Mat Tipo de materiales</td><td></td> de silicio<td>: P / Boro; Orientación < 111> EN; Método de crecimiento: CZ; Resistividad: 1-30 ohm/cm; Superficie: pulida; Corte láser a 7 x7 mm</td></tr><tr><td>Cryo-pin Preparación</td><td>Báltico</td><td>#16701950</td><td></td></tr><tr><td>Bucle cableado "Perfect loop"</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rayas de silicona</td><td>Picodent</td><td>Twinsil 22</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G8270</td><td></td></tr><tr><td>glucosaoxidasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G7141</td><td></td></tr><tr><td>catalasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>#C40</tr><tr><td>clorhidrato de beta-Mercaptoetilamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M6500</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tom20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#sc - 11415</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragmento burro anti conejo IgG</td><td>Jackson Immuno-Research</td><td>#711-606-152</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ROCHE, Suiza</td><td>#10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol solución</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#49782</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri con fondo de vidrio</td><td>Ibidi, Alemania</td><td>Placa en U de 35 mm, fondo de vidrio alto, #81158</td><td></td></tr><tr><td>Trozo de aluminio SEM</td><td>Agar Scientific</td><td>#G301F</td><td></td></tr><tr><td>Cemento de carbono conductor Leit-C</td><td>Plano, Alemania</td><td>AG3300</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Knife (Cryo Immuno)</td><td>Diatome</td><td>DCIMM3520</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-ultramicrotomo</td><td>Leica Microsystems Leica EM</td><td>FCS</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Widefield-TIRF GSD Leica SR GSD 3D</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetivo 160x 1.43 TIRF</td><td>Leica Microsystems 11523048</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SEM - Zeiss Supra 50 VP</td><td>Zeiss</td><td>Supra 50 VP</td><td></td></tr><tr><td>FIB-SEM - Zeiss Auriga 40</td><td>Zeiss</td><td>Auriga 40</td><td></td></tr></tbody></table>

resolución súper correlativo y la microscopia electrónica para resolver la localización de la proteína en la retina del pez cebra

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Se presenta un método para investigar la localización subcelular de la proteína en la retina de pez cebra larvas combinando la microscopía de superresolución y microscopía electrónica de barrido. Las capacidades de resolución secundario-difracción límite de microscopios ópticos de super-resolución permiten mejorar la exactitud de los datos correlacionados. Brevemente, 110 nanómetros cryo-secciones de espesor se transfieren a una oblea de silicio y, después de la inmunofluorescencia que manchaba, son imágenes por microscopía de superresolución. Posteriormente, las secciones se conservan en metilcelulosa y platino sombreado antes de la proyección de imagen en un microscopio electrónico de barrido (SEM). Las imágenes de estas dos modalidades de microscopía se fusionan fácilmente usando puntos de referencia de tejido con software de código abierto. Aquí describimos el método adaptado para la retina de pez cebra larval. Sin embargo, este método también es aplicable a otros tipos de tejidos y organismos. Demostramos que la información complementaria obtenida por esta correlación es capaz de resolver la expresión de proteínas mitocondriales en relación con las membranas y cristae de mitocondrias, así como a otros compartimentos de la célula.

La expresión de la proteína Tom20, una subunidad de la membrana externa mitocondrial complejo20de translocasa, determinó, en secciones finas de la retina de pez cebra larvas, por microscopía de superresolución (figura 1) y esta información fue complementada con la señal topográfica obtenida por microscopía electrónica de barrido después de platino el remedo de las mismas secciones. Estos datos correlativos confirman la localización de una proteína en asociación con un compartimiento especial, la membrana mitocondrial externa y, además, proporcionar información sobre la relación de la proteína con otros organelos de la célula.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg"> 
Figura 1: CLEM en la retina del pez cebra. A. imagen de campo amplio Ampliación baja de una 5 dpf pez cebra sección retina, núcleos teñidos con DAPI (cian). B. microscopía electrónica de la misma zona. C. mayor imagen de campo amplio aumento de marco en B. núcleos teñidos con DAPI (cyan) y Tom20 mitocondrial coloración aparece en rojo. D. imagen de campo amplio de misma sección al aumento mayor. El patrón de expresión de Tom20 es en los clusters de las mitocondrias. E. expresión de Tom20 (puntos rojos) detectados por microscopía GSDIM. Núcleos teñidos con DAPI (cian). F. sección mismo como E combinando correlativo súper resolución y microscopía electrónica de barrido. Tom20 manchas (puntos rojos) aparece en el clúster mitocondrial (M) en las membranas externas de mitocondrias. Señal de DAPI de fluorescencia en los núcleos (N) se corresponde con la topografía de la imagen de SEM. G. imagen de alta magnificación de marco f el. La imagen de microscopía electrónica barrido proporciona contexto para la imagen GSDIM (puntos rojos). Cristae mitocondriales es claramente visibles y la tinción de Tom20 está localizada en las membranas externas de mitocondrias. Las membranas del segmento externo de los fotorreceptores (OS) son claramente resueltos. Imagen pixel tamaño 5 nm. Barras de escala: A, B y C: 10 μm; D: 2 μm; E y F: 1 μm y G: 0.2 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Suplementario Figura 1: alineación de las imágenes de luz y microscopia electrónica. A. captura de pantalla de la interfaz TrackEM2 con imagen de SEM e hitos numerados (amarillos) a lo largo de diferentes núcleos. B. captura de pantalla de la interfaz TrackEM2 con imagen de fluorescencia e hitos numerados (amarillo) a lo largo de diferentes DAPI tinción de núcleos. Para cambiar la transparencia de la capa se pueden utilizar los controles deslizantes en la parte superior izquierda del menú. Barra de escala: 1 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo describe los pasos necesarios para obtener resultados de localización subcelular de la proteína en la retina de pez cebra por microscopía de superresolución la correlación y análisis de imágenes de microscopia electrónica.

Resolución súper correlativo y la microscopia electrónica para resolver la localización de la proteína en la Retina del pez cebra

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

El objetivo general de este método de microscopía es localizar con precisión la expresión proteica en relación con diferentes orgánulos subcelulares en la retina de pez cebra larvario mediante la correlación de imágenes de microscopía de superresolución y microscopía electrónica de barrido. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del desarrollo retiniano y de las vías celulares, como el estudio de la mala localización proteica en mutantes. La principal ventaja de esta técnica es que combina la superresolución con la microscopía electrónica de barrido para obtener datos altamente precisos sobre la localización proteica dentro del contexto estructural de la muestra.La recolección de secciones de Tokuyasu sobre obleas de silicona facilita considerablemente el manejo, y el uso del sombreado con platino para contraste proporciona una buena topografía de la muestra. Por lo tanto, este método puede aportar información valiosa para estudios sobre la retina de larvas de pez cebra. Una de sus principales ventajas es que también puede aplicarse a muchos otros sistemas biológicos, como la identificación de la expresión de proteínas en tejido de ratón.Después de diseccionar los ojos de larvas de pez cebra fijadas según el protocolo descrito en el texto, caliente 15 mililitros de gelatina al 12 % de una marca local de alimentos en PBS a 40 grados Celsius. Luego aspire el PBS de los tubos que contienen los ojos y añada la solución de gelatina. Agite suavemente el tubo para asegurar que la gelatina infiltre la muestra, e incube de 10 a 30 minutos a 40 grados Celsius en un bloque térmico con agitación suave o en un baño de agua.En un baño de agua a 40 grados Celsius, llene moldes de inclusión planos de silicona o polietileno de 12 por cinco por tres milímetros con gelatina tibia. Luego, utilizando una pipeta, agregue dos ojos por molde y, bajo un microscopio estereoscópico, use una aguja de disección para alinearlos adecuadamente. Después de permitir que la gelatina se enfríe a temperatura ambiente durante un minuto, colóquela a cuatro grados Celsius durante 20 minutos para que endurezca.Bajo el binocular, use una cuchilla de afeitar para recortar nuevamente el bloque de gelatina de forma que quepa un ojo por bloque. Transfiera los ojos embebidos en gelatina a sacarosa 2,3 molar en PBS sobre hielo. Incube las muestras a cuatro grados Celsius durante la noche.Luego cambie las muestras a una solución fresca de sacarosa 2,3 molar. Y almacene el tejido a cuatro grados Celsius, o a menos 20 grados Celsius para almacenamiento de hasta varios meses. Vuelva a recortar el bloque de gelatina hasta que sea casi del tamaño del ojo antes de transferirlo a un pin criogénico.Luego, congele el bloque en nitrógeno líquido y transfiéralo a un criomicrotomo ultramicrotómico. Usando una cuchilla de diamante en el criomicrotomo, corte secciones de 110 nanómetros de espesor a menos 120 grados Celsius. Recoga las secciones con un lazo metálico que contenga una gota de solución al 2% de metilcelulosa y 2,3 molar de sacarosa.Luego transfiera las secciones a una oblea de silicona de siete por siete milímetros. Para lavar las obleas, pipetee cuatro gotas y coloque las obleas boca abajo sobre las gotas. Incube las obleas sobre las gotas a cero grados Celsius durante 20 minutos.Luego, lave las obleas dos veces en PBS a temperatura ambiente durante dos minutos cada vez. Incube las muestras tres veces en glicina al 0,15% en PBS durante un minuto cada vez. A continuación, use PBS para lavar las muestras tres veces durante un minuto por cada lavado.Preincubar el tejido con PBG durante cinco minutos. A continuación, añadir anticuerpo de conejo anti-Tom20 en PBG a las secciones. E incubar las obleas a temperatura ambiente durante 30 minutos.Con PBG, lave el tejido seis veces durante un minuto por cada lavado. A continuación, preincube las muestras con PBG a temperatura ambiente durante cinco minutos. Reemplace el PBG con fragmentos divalentes de Fab anti-conejo marcados con Alexa 647 en PBG e incube durante 30 minutos.Lave las muestras con PBG seis veces, durante un minuto por lavado. Luego, use PBS para lavar las obleas tres veces, durante dos minutos cada vez. Añada DAPI y PBS a las obleas e incube durante 10 segundos.Luego, use PBS para lavar las muestras dos veces durante dos minutos cada vez. Coloque la oblea sobre una gota de una solución uno a uno de glicerol al 80 % y tampón de imagen que contiene un sistema de eliminación de oxígeno e incube brevemente. Transfiera las obleas, con el lado del tejido hacia abajo, a una gota fresca de la mezcla uno a uno de glicerol al 80 % y tampón de imagen en una placa de Petri con fondo de vidrio.Utilice una pipeta desde todos los lados para eliminar la mayor parte del líquido debajo del oblea. Luego, utilice tiras de silicona para fijar el oblea al fondo de la placa de Petri. Coloque las secciones montadas en un microscopio invertido con un objetivo de inmersión en aceite de alta apertura numérica.Antes de la adquisición de imágenes, deje que la muestra se equilibre a la temperatura del microscopio para minimizar o reducir la deriva lateral y axial. Centre el área de interés y adquiera imágenes de referencia de campo amplio en epifluorescencia. Cambie al modo de operación de superresolución.Ajuste el tiempo de exposición de la cámara a 15 milisegundos y configure la ganancia multiplicadora de electrones al valor máximo de 300. A continuación, ilumine la muestra en modo de epifluorescencia con el láser de 642 nanómetros a potencia máxima del láser. Tan pronto como los parpadeos de la molécula individual estén bien separados en cada cuadro, de modo que la probabilidad de que las señales individuales se superpongan sea baja, reduzca la potencia del láser a casi 1/3.Registre la imagen cruda en epifluorescencia adquiriendo un mínimo de 30.000 cuadros. A partir de los datos crudos, en Herramientas, Análisis de series temporales, utilice un umbral de detección de 30 fotones. Haga clic en Evaluar para generar una lista de eventos de localización.Bajo Herramientas, en el panel Procesamiento de lista de eventos, haga clic en Crear imagen para visualizar la imagen de superresolución mediante ajuste gaussiano, aplicando un tamaño de píxel de renderizado de cuatro nanómetros. Retire las tiras de silicona y agregue una gota de PBS cerca de los bordes del oblea para levantarlo del recipiente de Petri. Después de usar PBS para lavar el oblea dos veces durante dos minutos cada vez, use glutaraldehído al 0,1 % en PBS para fijarlo posteriormente durante cinco minutos.Luego, lave la muestra dos veces, durante dos minutos por lavado, en PBS. Incube la oblea en una gota de metilcelulosa al 2% en agua sobre hielo, dos veces durante cinco minutos por incubación. A continuación, introduzca la oblea en un tubo de centrífuga y centrifugue a 14.100 × g durante 90 segundos.Después de la centrifugación, utilice cemento de carbono conductor para montar la oblea sobre un soporte de aluminio para SEM. Mediante un dispositivo de evaporación por haz de electrones, añada una capa de dos a 10 nanómetros de carbono de platino sobre la muestra mediante sombreado rotatorio con los siguientes parámetros. Observe secciones con un microscopio electrónico de barrido a 1,5 kilovoltios, distancia de trabajo de dos milímetros y con un detector de electrones secundarios en lente.Utilice Fiji para abrir imágenes de microscopía óptica y electrónica haciendo clic en Archivo, Abrir. Ajuste el tamaño del lienzo haciendo clic en Imagen, Ajustar, Tamaño del lienzo. Luego, combine ambas imágenes en una pila haciendo clic en Imagen, Pilas, Imágenes a pila.En Fiji, abra una nueva interfaz de seguimiento EM2 haciendo clic en Archivo, Nueva, Nueva pista EM2. Importe la pila con ambas imágenes haciendo clic derecho en la ventana negra y seleccionando Importar pila. Alinee manualmente la imagen de microscopía óptica con la imagen de microscopía electrónica utilizando puntos de referencia, haciendo clic derecho en la imagen y seleccionando Alinear, Alinear capa manualmente con puntos de referencia.Seleccione la herramienta Selección para agregar puntos de referencia. Utilice la forma de los núcleos como referencia para seleccionar los mismos bordes en ambas imágenes y agregar varios puntos. Aplique la alineación con un modelo afín haciendo clic derecho y seleccione Aplicar transformación, Modelo afín.Finalmente, cambie la transparencia de la capa para evaluar la calidad del alineamiento. Este panel muestra una imagen de campo amplio a baja magnificación de una sección retinal de pez cebra a cinco días post-fertilización. La misma área se muestra aquí mediante microscopía electrónica de barrido.Estas imágenes con mayor aumento muestran la tinción de Tom20 en rojo con agrupaciones en las mitocondrias. La expresión de Tom20 se muestra aquí tal como fue detectada mediante microscopía GSDIM. En esta imagen, la misma sección combina microscopía electrónica de barrido y superresolución correlativa.La tinción de Tom20 aparece dentro del grupo mitocondrial en las membranas externas de las mitocondrias. La señal de fluorescencia de DAPI en los núcleos corresponde con la topografía de la imagen de MEB. Esta imagen de MEB proporciona contexto a la tinción de Tom20 en la imagen GSDIM.Las crestas mitocondriales son claramente visibles, y la tinción de Tom20 se localiza en las membranas externas de las mitocondrias. Las membranas del segmento externo de los fotorreceptores están claramente definidas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar lo mejor posible los parámetros de marcado y de obtención de imágenes.Solo las muestras etiquetadas de forma óptima son adecuadas para la superresolución. Las muestras nunca deben secarse en ningún momento durante el procedimiento de etiquetado. Este procedimiento podría ampliarse a inmunofluorescencia con doble etiquetado, lo que permitiría la localización de dos proteínas diferentes dentro de una estructura específica.En el caso de muestras más complejas, se recomienda el uso de marcadores fiduciales para obtener una alineación precisa de las imágenes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar estudios correlativos para localizar proteínas en relación con las diferentes orgánulos celulares en una muestra de tejido compleja con precisión de superresolución.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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Resolución súper correlativo y la microscopia electrónica para resolver la localización de la proteína en la Retina del pez cebra (Video) | JoVE Journal

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