Criopreservación de espermatogonios de pez cebra por todo los testículos aguja inmerso enfriamiento ultra rápido

La criopreservación ofrece la posibilidad de mantener células y tejidos vivos a bajas temperaturas durante un periodo de tiempo infinito, al menos en términos humanos. La vitrificación es una forma de criopreservación que implica un enfriamiento ultrarrápido a un estado vítreo y amorfo sin la formación de hielo cristalino y sin los daños asociados. En este vídeo, presentamos el protocolo para la vitrificación de testículos enteros de pez cebra, que permite su almacenamiento seguro hasta su posterior uso como fuente de células germinales para su trasplante a receptores adecuados.

El protocolo de vitrificación actual tiene una ventaja significativa sobre los protocolos de congelación de tasa lenta en lo que respecta a la manipulación de células madre germinales. Y es que después de la vitrificación y el calentamiento, los espermatozoides mueren y se ajustan para que no estén presentes en la suspensión celular. Por lo tanto, no es necesario aislar las células germinales después del calentamiento.

Y eso facilita fácilmente las manipulaciones posteriores. Eutanasiar el pescado colocándolo en un plato que contenga 200 miligramos por litro de MS-222 a pH siete. Antes de continuar con la disección, asegúrese de que las branquias han dejado de moverse, y que han pasado al menos 10 minutos desde ese momento para asegurar la muerte por hipoxia.

Seca el pez dándole golpecitos con una toalla de papel y colócalo sobre su lado dorsal sobre una alfombra de disección. En primer lugar, corta las aletas pélvicas y pectorales para facilitar la disección. Corta horizontalmente la piel en el vientre del pez entre las aletas pectorales, y corta la piel y el músculo subyacente a lo largo del vientre hasta la aleta anal.

Abra la cavidad corporal del pez y sujete la pared izquierda y derecha del cuerpo a la alfombra de disección con agujas. Los testículos se encuentran por encima de los órganos gastrointestinales a ambos lados de la vejiga natatoria. Para evitar la contaminación, no extraiga los órganos gastrointestinales, sino que empújelos suavemente hacia un lado y retire los testículos del lado opuesto.

Los testículos están conectados a la pared del cuerpo, así que retírelos con cuidado y corte el peritoneo de conexión con micro tijeras. Además, para evitar la contaminación, primero esterilice los testículos poniéndolos en etanol al 70% durante dos segundos y luego colóquelos en L-15 en una placa de 96 pocillos sobre hielo. Marque las agujas con las etiquetas adecuadas, según el tipo de muestra, y prepare las soluciones de equilibrio y vitrificación.

Transfiera los testículos a una placa o plato de pocillos más grandes y sujete tres testículos o más, según el tamaño de la aguja, en una aguja de acupuntura estéril. En primer lugar, coloque los testículos encima de unas pinzas curvas. Coloque la punta de la aguja en el centro del testículo y tire con cuidado del testículo hacia arriba con las pinzas.

Después de perforar el testículo, tire suavemente hacia arriba hacia la parte superior de la aguja. Asegúrese de que los testículos estén separados entre sí y que no se caigan ni se deslicen hacia abajo. Colocar las agujas con los testículos clavados en un tubo Tubulator Eppendorf lleno de L-15 hasta la vitrificación a 25 grados.

El tiempo de almacenamiento no debe exceder de una hora. Transfiera la aguja con los testículos a la solución de equilibrio e incube durante cinco minutos a 25 grados. Transfiera la aguja a la solución de vitrificación e incube durante 30 segundos a 25 grados.

Retire la aguja de la solución de vitrificación. Absorba rápida y suavemente la solución restante del pañuelo con una toalla de papel estéril. Tenga cuidado para evitar que los testículos se peguen a la toalla de papel o se caigan.

Coloque rápidamente la aguja en nitrógeno líquido en una caja de espuma de poliestireno. Mantenga la aguja en nitrógeno líquido en una caja cerrada de espuma de poliestireno durante cinco a 10 minutos. Pre-enfriar un criotubo abierto de 4,5 mililitros y su tapón en la misma caja.

Después de cinco a 10 minutos, transfiera cada aguja a un tubo criogénico separado debajo de la superficie del nitrógeno líquido y cierre el tubo criogénico. Coloque el tubo criogénico en un bastón de metal y colóquelo en el recipiente del banco criogénico lo más rápido posible. Guarde las muestras en un cajón de almacenamiento hasta su uso posterior.

Calienta cada aguja por separado. Todas las soluciones de calentamiento deben estar a 25 grados. Separe el tubo criogénico de la caña de metal y sumérjalo en nitrógeno líquido almacenado en una caja de espuma de poliestireno.

Abra el tubo criogénico en el vapor de nitrógeno líquido con pinzas y suelte la aguja en el nitrógeno líquido. Transfiera la aguja muy rápidamente a la primera solución de calentamiento e incube durante un minuto. Asegúrese de transferir la aguja rápidamente para evitar que se caliente en el aire durante la transferencia.

Transfiera la aguja a la segunda solución de calentamiento e incube durante tres minutos. Transfiera la aguja a la tercera solución de calentamiento e incube durante cinco minutos. Suelta los testículos de la aguja deslizándolos hacia abajo con unas pinzas curvas.

Coloque cada testículo calentado individualmente en un pozo separado lleno de 250 microlitros de L-15, complementado con 10% de FPS. Asegúrese de que los pocillos estén etiquetados de acuerdo con la muestra. Mantenga la placa de pocillos en hielo hasta que todas las muestras se calienten y hasta que se realicen más trabajos.

Prepare 500 microlitros de la solución de disociación para cada muestra en tubos separados de dos mililitros. Etiquete los tubos de acuerdo con el código de la muestra. Incubar la solución de disociación preparada durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Agregue el pañuelo caliente a la solución de digestión y córtelo en trozos pequeños con al menos 30 movimientos de tijeras pequeñas. Incubar el tejido en una placa agitadora durante 90 minutos a 24 grados. Detenga el proceso de digestión agregando 400 microlitros de L-15 y 100 microlitros de 10%FPS.

Agite brevemente la solución e incube durante un minuto a temperatura ambiente. Filtre la solución obtenida a través de filtros de 50 micras en un tubo de 1,5 mililitros. Etiquete los tubos en consecuencia.

Centrifugar la solución filtrada a 200 G durante 10 minutos a 25 grados. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 20 microlitros de L-15, suplementado con 10% FPS. Agite manualmente el tubo hasta que el pellet se disuelva por completo.

Mantenga la suspensión de la celda en hielo o a cuatro grados hasta que se use más. Mezcle cinco microlitros de suspensión celular y cinco microlitros de solución de azul de tripano al 0,4 % en un tubo de PCR de 0,2 mililitros debidamente etiquetado. Si se utilizan diferentes volúmenes, asegúrese de que se mantenga la proporción de dilución de uno a uno.

Incube esta suspensión durante uno a tres minutos a 25 grados. Comprobar la viabilidad de cada muestra en un hemocitómetro bajo un microscopio. Cuente el número de células vivas no teñidas con azul de tripán en 15 campos.

Calcula el número total de células en 20 microlitros de la suspensión celular. La suspensión ya está lista para cualquier aplicación posterior. En promedio, el número de células germinales en etapa temprana aisladas de un solo testículo de pez cebra fresco varía entre 40.000 y 200.000 células, dependiendo del tamaño del pez.

En todas las líneas de pez cebra utilizadas en este estudio, el protocolo de vitrificación actual arrojó tasas de viabilidad promedio del 50% y superiores. Esto indica una viabilidad y repetibilidad favorables del protocolo presentado. Al digerir testículos frescos de pez cebra en las cinco cepas, además de las células germinales en etapa temprana, también se encontraron numerosos espermatozoides.

Después de la digestión de los testículos criopreservados, había muchos menos espermatozoides, lo que indica que no sobreviven a este protocolo de vitrificación y que lo más probable es que se eliminen durante el proceso de digestión. El protocolo de vitrificación sumergida en aguja presentado en este estudio ofrece varias ventajas en la criopreservación de piezas testiculares. En primer lugar, se pueden clavar varias piezas en una aguja y, por lo tanto, se pueden exponer simultáneamente a los crioprotectores y al nitrógeno líquido.

Además, este método permite que se adhieran cantidades muy bajas de crioprotectores a las piezas de tejido. Y, por lo tanto, las tasas de enfriamiento y calentamiento pueden ser más altas. Una ventaja significativa es que los espermatozoides no sobreviven a este protocolo y, por lo tanto, al final, las suspensiones celulares son espermatogonias enriquecidas, lo que facilitará las aplicaciones posteriores.

Pero una cosa que hay que tener en cuenta es la posibilidad de contaminación cruzada a través del nitrógeno. Por lo tanto, al utilizar este método, no se debe reutilizar el nitrógeno líquido.