Name: Criopreservación de espermatogonios de pez cebra por todo los testículos aguja inmerso enfriamiento ultra rápido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Aprende la vitrificación por inmersión de aguja de testículos completos de Danio rerio para criopreservación de espermatogonios. Este método elimina espermatozoides tras el calentamiento, facilitando el aislamiento de células germinales.

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Este estudio fue apoyado por la investigación, desarrollo e innovación oficina de Hungría (grant 116912 a ÁH), la oficina de costos (alimentación y agricultura costo acción FA1205: AQUAGAMETE), el programa de becas beca Hungaricum (ayuda a ZM) y el nuevo Húngaro nacional excelencia Beca Predoctoral (grant EK).

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la ley de Bienestar Animal Húngaro.
1. preparación del reactivo
<ol><li>Soluciones madre<ol>
<li>Preparar 1 M trehalosa agregando 0,378 g de trehalosa dihidrato en 1 mL de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo.</li>
		<li>Preparar 1 M sacarosa añadiendo 0,342 g de sacarosa en 1 mL de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo.</li>
		<li>Preparar 1 M HEPES añadiendo 0,238 g de HEPES y 1 mL de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo.</li>
		<li>Preparar la colagenasa (290 U/mg) de 20 mg/mL mediante la adición de 100 mg en 5 mL de PBS. Mezclar bien hasta que se disuelve. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Tubos de alícuotas de 50 μL en PCR de 0,2 mL y congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparar tripsina 15 mg/mL (~ 10000 U/mg) mediante la adición de 75 mg para 5 mL de PBS. Mezclar bien hasta que se disuelve. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Tubos de alícuotas de 50 μL en PCR de 0,2 mL y congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparar 1 mg/mL DNasa I (~ 3000 U/mg) mediante la adición de 5 mg en 5 mL de PBS. Mezclar bien hasta que se disuelve. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Tubos de alícuotas de 50 μL en PCR de 0,2 mL y congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparar tripano 0.4% azul mediante la adición de 40 mg de azul de tripano a 10 mL de PBS. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Alícuota 1 mL en tubos de 1,5 mL.</li>
		<li>Preparar 200 mg/L MS-222 (sulfonato de metano Metanosulfonato) mediante la adición de 200 mg de MS-222 en 1 L de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo. Además, el MS-222 tampón con bicarbonato de sodio a un pH neutro de 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluciones de vitrificación<ol>
<li>Preparar la solución de equilibrado (ES): preparar 2 mL de CE mezclando 121.5 μl de metanol (MeOH; 1,5 M), 220 μl de glicol de propileno (PG; 1,5 M), 200 μL de FBS (10%), 200 μL de solución stock de trehalosa (0,1 M), 50 μl de la solución madre de HEPES (25 mM) y 1208.5 μl de L-15 en un 2 tubo mL.</li>
		<li>Preparar la solución de vitrificación (VS): preparar 2 mL de VS mezclando 439 μl de PG (3 M), 426 μl de dimetilsulfóxido (Me2. 3 M), 200 μL de FBS (10%), 200 μL de solución stock de trehalosa (0,1 M), 50 μl de HEPES stock solución (25 mM) y 685 μl de L-15 en un tubo de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluciones para el calentamiento<ol>
<li>Preparar la solución calentamiento 1 (WS1): preparar 1,5 mL de WS1 en un tubo de 2 mL mediante la mezcla de 150 μL de FBS (10%), 450 μl de solución de sacarosa (3 M) y 900 μl de L-15.</li>
		<li>Preparar la solución calentamiento 2 (WS2): preparar 1,5 mL de WS2 en un tubo de 2 mL mediante la mezcla de 150 μL de FBS (10%), 150 μL de solución de sacarosa (1 M) y 1200 μl de L-15.</li>
		<li>Preparar solución calentamiento 3 (WS3): preparar mezcla 150 μL FBS (10%) 1.5 mL de WS2 en un tubo de 2 mL y μl de 1350 de L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar la solución de digestión: para cada muestra preparar 500 μl de la solución de digestión mezclando 50 μl de la solución madre de colagenasa (2 mg/mL), 50 μl de la solución madre de tripsina (1,5 mg/mL), 10 μl de DNasa I (20 μg/mL) y 390 μl de L-15 en 2 mL del tubo.</li>
	<li>Obtener herramientas de disección: tijeras, microscissors, pinzas, pinzas curvas y agujas de acupuntura.</li>
</ol>2. testículos colección
<ol><li>Eutanasia a los peces colocando en un recipiente que contiene 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Antes de continuar con la disección, asegúrese de que las branquias han detenido y por lo menos 10 minutos han pasado desde ese momento para asegurar la muerte por hipoxia.</li>
	<li>El pescado seco acariciando sobre una toalla de papel y colóquela sobre su lado dorsal en una estera de la disección.<ol>
<li>En primer lugar cortar las aletas pélvicas y pectorales para la disección más fácil.</li>
		<li>Horizontal, cortar la piel en el vientre de los peces entre las aletas pectorales y cortar la piel y el músculo subyacente a lo largo del vientre hasta la aleta anal.</li>
		<li>Abra la cavidad del cuerpo de los peces y la clavija de la pared izquierda y derecha del cuerpo a la estera de la disección con agujas. Nota: Los testículos se encuentran por encima de los órganos gastrointestinales en ambos lados de la vejiga natatoria (figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para evitar la contaminación, no sacar los órganos gastrointestinales, pero suavemente empuje hacia un lado y quitar el testículo del lado opuesto. Los testículos están conectados con la pared del cuerpo así que quitarlos con cuidado y cortar el peritoneo de conexión por microscissors.</li>
	<li>Además, con el fin de evitar la contaminación, en primer lugar esterilizar los testículos poniendo en etanol al 70% durante 2 s y entonces lugar ellos en L-15 en una placa de 96 pozos en el hielo. Nota: Si es necesario, limpiamos testículos grandes y del tejido adiposo vasos sanguíneos precisamente bajo el estereomicroscopio</li>
</ol>3. ultra rápido enfriamiento del tejido Testicular
<ol><li>Agujas de marca con etiquetas apropiadas dependiendo de la muestra tipo y preparan las soluciones de vitrificación (VS) y equilibrado (ES).</li>
	<li>Transferir los testículos a una placa bien grande o plato y perno de dos a tres los testículos (o más dependiendo del tamaño de la aguja) en una aguja de acupuntura estériles.<ol>
<li>En primer lugar colocar el testículo en la parte superior curva pinzas. Coloque la punta de la aguja en el centro del testículo y tire cuidadosamente el testículo hacia arriba con las pinzas.</li>
		<li>Después de pinchar los testículos, con cuidado tirar hacia arriba hacia la parte superior de la aguja. Asegúrese de que los testículos están separados unos de otros y que no son caerse o deslizarse.</li>
		<li>Lugar las agujas con testículos anclados en un tubo de 2 mL con L-15 hasta vitrificación (a 25 ° c; tiempo de almacenamiento no debe exceder 1 h). Nota: La fijación de los testículos en la aguja debe hacerse rápidamente para impedir que los testículos se sequen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir la aguja con los testículos en la solución de equilibrado e incubar durante 5 min a 25 °.</li>
	<li>La aguja de transferencia en la solución de vitrificación e incube durante 30 s a 25 °.</li>
	<li>Retire la aguja de la solución de vitrificación, suavemente y rápidamente absorben el resto de la solución en el tejido por una toalla de papel estéril. Tenga cuidado para evitar los testículos pegarse a la toalla de papel o caerse.</li>
	<li>Rápidamente Coloque la aguja en nitrógeno líquido colocada en una caja de espuma de poliestireno. Nota: Hacer este paso rápidamente para evitar la exposición del tejido a los vapores de nitrógeno líquido. Utilizar volúmenes bajos de nitrógeno líquido para evitar la contaminación cruzada de las muestras.</li>
	<li>Mantener la aguja en nitrógeno líquido en una caja cerrada de la espuma de poliestireno de 5-10 minutos.</li>
	<li>Preenfriar un criotubo abierto 4,5 mL y su tapa en la misma caja.</li>
	<li>Después de 5-10 min, transferir cada aguja en un criotubo separado debajo de la superficie de nitrógeno líquido y cerrar el criotubo. PRECAUCIÓN: Siempre use ropa protectora (tales como guantes aislados) cuando trabajo con nitrógeno líquido como exposición puede llevar a congelación severa.</li>
	<li>Coloque el criotubo en un bastón de metal y coloque en el recipiente de cryobank tan rápido como sea posible. Almacenar las muestras en un almacenamiento de información de vaso dewar hasta su uso posterior.</li>
</ol>4. procedimiento de calentamiento
<ol><li>Caliente cada aguja por separado. Todas las soluciones de calentamiento deben ser a 25 ° C.</li>
	<li>Separar el criotubo de la caña de metal y sumergirse en nitrógeno líquido, almacenado en una caja de espuma de poliestireno.</li>
	<li>Abrir el criotubo en el vapor del nitrógeno líquido (con pinzas) y suelte la aguja en el nitrógeno líquido.</li>
	<li>Transferir la aguja muy rápido en la primera solución calentamiento e incubar durante 1 min (a 25 ° C). Asegúrese de transferir la aguja rápidamente para evitar su calentamiento en el aire durante la transferencia.</li>
	<li>Transferencia de la aguja en la segunda solución calentamiento e incubar durante 3 minutos (a 25 ° C).</li>
	<li>Transferencia de la aguja en la tercera solución calentamiento e incubar durante 5 minutos (a 25 ° C).</li>
	<li>Liberar los testículos de la aguja deslizándolo hacia abajo con una pinza curva. Lugar cada testículo calentado individualmente en un pozo independiente (placa de 96 pocillos) con 250 μl de L-15 suplementado con 10% FBS. Asegúrese de que los pozos están etiquetados según la muestra. Mantenga la placa bien en el hielo hasta que todas las muestras se calientan y hasta más trabajo.</li>
</ol>5. tejido digestión
<ol><li>Preparar 500 μl de la solución de disociación para cada muestra en tubos separados 2 mL. Etiquetar los tubos de acuerdo con el código de la muestra. Incubar la solución preparada de disociación por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir el tejido calentado en la solución de digestión y cortar en trozos pequeños por lo menos 30 movimientos de tijeras pequeñas.</li>
	<li>Incubar el tejido cortado en una placa de agitación durante 90 minutos a 25 ° c.</li>
	<li>Detener el proceso de digestión mediante la adición de 400 μL de L-15 y 100 μl de FBS (SFB 10% v/v). Brevemente agitar la solución e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Filtrar la solución obtenida a través de 50 filtros del μm en un tubo de 1,5 mL. Etiquetar los tubos por consiguiente.</li>
	<li>Centrifugue la solución filtrada a 200 x g durante 10 min a 25 ° c.</li>
	<li>Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 20 μl de L15 suplementado con 10% FBS. Agitar manualmente el tubo hasta que el precipitado se haya disuelto completamente. Mantener la suspensión de células en hielo o a 4 ° c hasta su uso posterior.</li>
</ol>6. viabilidad evaluación y recuento celular
<ol><li>Mezcla 5 μl de suspensión celular y 5 μl de solución de azul de tripano 0.4% en un tubo PCR de 0.2 mL debidamente etiquetado. Si se utilizan volúmenes diferentes, asegúrese de que la relación de dilución de 1:1 restos.</li>
	<li>Incubar la suspensión de 1 a 3 min a temperatura ambiente (25 ° C).</li>
	<li>Comprobar la viabilidad de cada muestra en un hemocitómetro bajo el microscopio.</li>
	<li>Contar el número de células vivas (sin mancha de azul tripán) en 15 campos. Calcular el número total de células de 20 μm de la suspensión de células. La suspensión está lista para cualquier aplicación posterior. Nota: Cuando optimizar el procedimiento para otras especies con tamaño de cuerpo más grande, utilizar fragmentos de testículos de igual peso. Utilice los testículos de un individuo para todos los grupos experimentales con el fin de evitar la variabilidad individual en los resultados. En el caso del pez cebra, aprovechamos el hecho de que izquierda y testículo derecho debe contener un número igual (o muy similar) de las células germinales13 (véase los resultados de representante). El testículo izquierdo se mantuvo como un control, mientras que el testículo derecho era vitrificados/calentados. Porcentaje de viabilidad se calculó el número de células aisladas del testículo vitrificados/calentados en comparación con el número de células aisladas de los testículos frescos.</li>
</ol>

<ol><li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research%3A+Importance%2C+impact%2C+status%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li>
<li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li>
<li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li>
<li>Morris, J. P. IV, Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N%2CN-dimethylacetamide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li>
<li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogonial+transplantation+in+fish%3A+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+Part+D%3A+Genomics+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li>
<li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li>
<li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress%2C+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li>
<li>Kása, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+%28Eurasian+perch%2C+Perca+fluviatilis%29+and+marine+fish+%28European+eel%2C+Anguilla+anguilla%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li>
<li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li>
<li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+needle+immersed+vitrification%3A+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li>
<li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+%28Coturnix+japonica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124(2013).</li>
<li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology%2C+viability%2C+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+%28Coturnix+japonica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Reprod.+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li>
<li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+%28Brachymystax+lenok%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li>
<li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li>
<li>Lujić, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li>
<li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22CryoLetters%22%5BJournal%5D)">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li>
<li>Marinović, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li>
<li>Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells%2C+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li>
<li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nati.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de enfriamiento ultra rápido desarrollado para especies de aves y mamíferos10,11,12 a la crioconservación de testículo de pez (pez cebra como modelo organismo). La mayoría de los estudios anteriores con respecto a la criopreservación de los recursos genéticos del pez cebra se centraron principalmente en criopreservación de esperma de pez cebra<su...

Nuevas tendencias en la ciencia y la biotecnología han llevado a la creación de miles de nuevas líneas mutantes de Drosophila, pez cebra, ratones y otras especies usadas como organismos modelo en biomedicina y otras ciencias1. Además, como nuevas tecnologías se desarrollan y se convierten en disponibles, los números de líneas mutantes aumentan constantemente2. Esto conduce a la necesidad de un almacenamiento seguro de los recursos genéticos más allá de las prácticas comunes de mantener colonias de cría. Como un método que permite el almacenamiento seguro de los recursos genéticos por un período indefinido de tiempo, criopreservación ofrece muchas ventajas tales como extensión de la temporada reproductiva, evita la necesidad de un mantenimiento continuo de los reproductores, y es más costo - y mano de obra eficiente2.
Protocolos de criopreservación de esperma desarrollado durante los últimos varios años2,3,4 ofrecen la oportunidad para el almacenaje acertado del material genético masculino de pez cebra. Sin embargo, la criopreservación de óvulos o embriones de peces todavía no es posible debido a su compleja estructura y grandes cantidades de material de la yema de huevo. Recientemente, la práctica del trasplante de células de germen primordiales (PGCs) o las células madre espermatogonias (SSCs) ofrece un puente a esta barrera mediante el desarrollo funcional de la esperma y huevos después de trasplante5. Por lo tanto, la criopreservación de SSCs ofrece una nueva frontera en la conservación de los recursos genéticos raros y valiosos.
A pesar de que la criopreservación ofrece muchas ventajas, el proceso de congelación lenta tasa genera varias condiciones que pueden llevar a daño de la célula2. Estos incluyen la formación de hielo intracelular y extracelular, deshidratación y toxicidad del crioprotector. Hielo daña las células, hielo extracelular puede conducir a trituración mecánica de las células, mientras que la difusión de agua desde las células durante la tasa lenta de congelación puede conducir a deshidratación6. Recientemente, se ha aplicado vitrificación como una técnica que evita los efectos negativos de la formación de hielo en la criopreservación de gametos de peces7,8,9. Presenta una técnica de enfriamiento ultra rápida a través del cual los medios de comunicación internos y externos se convierten en un estado amorfo/vidrioso sin crystalizing en hielo7,10. Éxito vitrificación de tejido ovárico y testicular ha sido evidenciado en especies de aves y mamíferos10,11,12, abriendo posibilidades para su aplicación en los peces, así.
En este estudio, presentamos el procedimiento de vitrificación (NIV) aguja sumergido para la criopreservación de los testículos todo pez cebra. Demostrar un método confiable para el aislamiento de las células de germen incipiente pez cebra sin contaminación y un proceso de criopreservación que produce cantidades relativamente altas de células de germen incipiente con una baja presencia de otras células, especialmente de espermatozoides. A lo mejor de nuestro conocimiento, éste es el primer estudio en demostrar un protocolo detallado visualizado para el enfriamiento ultra rápido de tejido gonadal de peces y pez cebra del germline células. Además, la repetibilidad del método se demuestra en cinco cepas diferentes de pez cebra: AB tipo salvaje, casper (roy- / -; nácar- / -), leopardo (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] y línea transgénica de Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].

<table><tbody><tr><td>Medios de Leibovitz (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Suplementado con L-glutamina</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonato de tricaína (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalosa</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Metanol Dihidratado</td></tr><tr><td></td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Propilenglicol</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Comprimidos para la preparación de 200 ml de solución de PBS</td></tr></tbody></table>

criopreservación de espermatogonios de pez cebra por todo los testículos aguja inmerso enfriamiento ultra rápido

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Tendencias actuales en ciencia y biotecnología conducen a la creación de miles de nuevas líneas en organismos modelo lo lleva a la necesidad de nuevos métodos para el almacenamiento seguro de los recursos genéticos más allá de las prácticas comunes de mantener colonias de cría. El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Criopreservación de células de germen incipiente por los testículos todo NIV ofrece posibilidades para el almacenamiento de pez cebra recursos genéticos, especialmente puesto que después maduran a gametos masculinos y femeninos. Los testículos fueron suprimidos, en una aguja de acupuntura, equilibrada en dos medios crioprotectores (solución de equilibrado que contiene 1,5 M metanol y glicol de propileno de 1.5 M; y solución de vitrificación que contiene dimetilsulfóxido de 3 M y 3 M propilenglicol) y sumergida en nitrógeno líquido. Las muestras fueron calentadas en una serie de tres soluciones de calentamiento consiguientes. Las principales ventajas de esta técnica son (1) la falta de espermatozoides después de la digestión de los testículos caliente facilitando manipulaciones posteriores; (2) ultra rápido de enfriamiento que permite la óptima exposición de los tejidos a nitrógeno líquido, por lo tanto maximizar la refrigeración y reducir la necesaria concentración de crioprotectores, reduciendo así su toxicidad; (3) exposición sincrónica de varios testículos crioprotectores y nitrógeno líquido; y repetibilidad (4) demostró mediante la obtención de la viabilidad de sobre el 50% en cinco cepas diferentes de pez cebra.

En promedio, el número de células de germen inicial aislada de un testículo de pez cebra dulce solo varió entre 40.000 y 200.000 células dependiendo del tamaño de los peces. Al digerir los testículos frescos de pez cebra en todas las 5 cepas, células germinales tempranas no eran las células sólo presentes en las suspensiones de la célula (figura 2). Al lado de las células de germen incipiente, numerosos espermatozoides fueron encontrados también. Por otro lad...

El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Además, se evaluó la repetibilidad del método en cinco cepas diferentes de pez cebra.

Criopreservación de espermatogonios de pez cebra por todo los testículos aguja inmerso enfriamiento ultra rápido

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

La criopreservación ofrece la posibilidad de mantener células y tejidos vivos a bajas temperaturas durante un período de tiempo indefinido, al menos en términos humanos. La vitrificación es una forma de criopreservación que implica un enfriamiento ultrarrápido hasta un estado vítreo y amorfo, sin la formación de hielo cristalino ni los daños asociados. En este video, presentamos el protocolo para la vitrificación de testículos completos de pez cebra, lo que permite su almacenamiento seguro hasta su uso posterior como fuente de células germinales para trasplante en receptores adecuados.El protocolo de vitrificación actual tiene una ventaja significativa frente a los protocolos de congelación lenta en lo que respecta a las manipulaciones de células madre germinales. Y es que tras la vitrificación y el calentamiento, los espermatozoides mueren y se eliminan, por lo que no están presentes en la suspensión celular. Por lo tanto, no es necesario aislar las células germinales tras el calentamiento.Y eso facilita fácilmente las manipulaciones posteriores. Eutanasiar el pez colocándolo en una placa que contenga 200 miligramos por litro de MS-222 a pH 7. Antes de continuar con la disección, asegúrese de que las branquias hayan dejado de moverse y de que hayan transcurrido al menos 10 minutos desde ese momento para garantizar la muerte por hipoxia.Seque el pescado presionándolo con una toalla de papel y colóquelo sobre su lado dorsal en una tabla de disección. En primer lugar, corte las aletas pélvicas y pectorales para facilitar la disección. Corte horizontalmente la piel del vientre del pescado entre las aletas pectorales, y luego corte la piel y el músculo subyacente a lo largo del vientre hasta llegar a la aleta anal.Abra la cavidad corporal del pez y sujete las paredes laterales izquierda y derecha a la tabla de disección con agujas. Los testículos se encuentran por encima de los órganos gastrointestinales, a ambos lados de la vejiga natatoria. Para evitar contaminación, no retire los órganos gastrointestinales, sino que desplácelos suavemente hacia un lado y extraiga los testículos desde el lado opuesto.Los testículos están conectados a la pared corporal, así que retírelos con cuidado y corte el peritoneo de conexión con tijeras microquirúrgicas. Además, para evitar contaminación, primero esterilice los testículos colocándolos en etanol al 70 % durante dos segundos, y luego colóquelos en L-15 en una placa de 96 pocillos sobre hielo. Marque las agujas con etiquetas adecuadas, según el tipo de muestra, y prepare las soluciones de equilibrio y vitrificación.Transfiera los testículos a una placa o plato de pocillo más grande y sujete tres testículos o más, dependiendo del tamaño de la aguja, en una aguja estéril de acupuntura. Primero, coloque los testículos encima de pinzas curvas. Coloque la punta de la aguja en el centro del testículo y tire cuidadosamente del testículo hacia arriba con las pinzas.Después de perforar el testículo, tire suavemente hacia arriba en dirección al extremo superior de la aguja. Asegúrese de que los testículos estén separados entre sí y de que no se caigan ni resbalen hacia abajo. Coloque las agujas con los testículos sujetos en un tubo Eppendorf Tubulator lleno con L-15 hasta la vitrificación a 25 grados.El tiempo de almacenamiento no debe exceder una hora. Transfiera la aguja con los testículos a la solución de equilibrio e incube durante cinco minutos a 25 grados. Transfiera la aguja a la solución de vitrificación e incube durante 30 segundos a 25 grados.Retire la aguja de la solución de vitrificación. Absorba rápidamente y con suavidad la solución restante del tejido mediante una toalla de papel estéril. Tenga cuidado para evitar que los testículos se adhieran a la toalla de papel o se caigan.Coloque rápidamente la aguja en nitrógeno líquido dentro de una caja de espuma de poliestireno. Mantenga la aguja en nitrógeno líquido dentro de una caja de espuma de poliestireno cerrada durante cinco a 10 minutos. Enfríe previamente un criotubo abierto de 4,5 mililitros y su tapa en la misma caja.Después de cinco a 10 minutos, transfiera cada aguja a un criotubo separado bajo la superficie del nitrógeno líquido y cierre el criotubo. Coloque el criotubo en una varilla metálica y colóquelo en el contenedor del criobanco lo más rápido posible. Almacene las muestras en un cajón de almacenamiento de contenedores hasta su uso posterior.Caliente cada aguja por separado. Todas las soluciones de calentamiento deben estar a 25 grados. Separe el criotubo del vástago metálico e introdúzcalo en nitrógeno líquido almacenado en una caja de poliestireno.Abra el tubo criogénico en el vapor de nitrógeno líquido usando pinzas y suelte la aguja en el nitrógeno líquido. Transfiera la aguja muy rápidamente a la primera solución de calentamiento e incube durante un minuto. Asegúrese de transferir la aguja con rapidez para evitar que se caliente en el aire durante la transferencia.Transfiera la aguja a la segunda solución de calentamiento e incube durante tres minutos. Transfiera la aguja a la tercera solución de calentamiento e incube durante cinco minutos. Libere los testículos de la aguja deslizándolos hacia abajo con pinzas curvas.Coloque cada testículo calentado individualmente en un pocillo separado lleno con 250 microlitros de L-15, suplementado con 10% FPS. Asegúrese de que los pocillos estén etiquetados según la muestra. Mantenga la placa sobre hielo hasta que todas las muestras estén calentadas y hasta su posterior manipulación.Prepare 500 microlitros de la solución de disociación para cada muestra en tubos separados de dos mililitros. Etiquete los tubos según el código de la muestra. Incube la solución de disociación preparada durante cinco minutos a temperatura ambiente.Agregue el tejido calentado a la solución de digestión y córtelo en trocitos con al menos 30 movimientos de tijeras pequeñas. Incube el tejido en una placa agitadora durante 90 minutos a 24 grados. Detenga el proceso de digestión añadiendo 400 microlitros de L-15 y 100 microlitros de FPS al 10%.Agite brevemente la solución e incube durante un minuto a temperatura ambiente. Filtre la solución obtenida a través de filtros de 50 micrones hacia un tubo de 1,5 mililitros. Etiquete los tubos de acuerdo con ello.Centrifugar la solución filtrada a 200 G durante 10 minutos a 25 grados. Retirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el precipitado en 20 microlitros de L-15, suplementado con 10%FPS. Agitar manualmente el tubo hasta que el precipitado se disuelva completamente.Mantenga la suspensión celular en hielo o a cuatro grados hasta su uso posterior. Mezcle cinco microlitros de suspensión celular y cinco microlitros de solución de azul de tripano al 0,4 % en un tubo de PCR de 0,2 mililitros adecuadamente etiquetado. Si se utilizan volúmenes diferentes, asegúrese de que la proporción de dilución uno a uno se mantenga.Incubar esta suspensión durante uno a tres minutos a 25 grados. Verificar la viabilidad de cada muestra en un hemocitómetro bajo un microscopio. Contar el número de células vivas no teñidas por azul de tripano en 15 campos.Calcule el número total de células en 20 microlitros de la suspensión celular. La suspensión ya está lista para cualquier aplicación posterior. En promedio, el número de células germinales en etapa temprana aisladas de un único testículo de pez cebra fresco varía entre 40.000 y 200.000 células, dependiendo del tamaño del pez.En todas las líneas de pez cebra utilizadas en este estudio, el protocolo de vitrificación actual produjo tasas medias de viabilidad del 50 % o superiores. Esto indica una viabilidad y repetibilidad favorables del protocolo presentado. Al digerir testículos frescos de pez cebra en las cinco cepas, además de las células germinales en estadio temprano, también se encontraron numerosos espermatozoides.Después de la digestión de testículos criopreservados, había mucho menos espermatozoides, lo que indica que no sobreviven a este protocolo de vitrificación y que probablemente se eliminan durante el proceso de digestión. El protocolo de vitrificación con aguja sumergida presentado en este estudio ofrece varias ventajas en la criopreservación de fragmentos testiculares. En primer lugar, varios fragmentos pueden fijarse a una misma aguja, y por lo tanto pueden exponerse simultáneamente a crioprotectores y al nitrógeno líquido.Además, este método permite que cantidades muy bajas de crioprotectores se adhieran a los fragmentos de tejido. Por lo tanto, las tasas de enfriamiento y calentamiento pueden ser más altas. Una ventaja significativa es que los espermatozoides no sobreviven a este protocolo, y por consiguiente, al final, las suspensiones celulares están enriquecidas en espermatogonias, lo que facilitará las aplicaciones posteriores.Pero una cosa que debe tenerse en cuenta es la posibilidad de contaminación cruzada a través del nitrógeno. Por lo tanto, al utilizar este método, no se debe reutilizar el nitrógeno líquido.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este es un protocolo de esperma de alto rendimiento para la criopreservación de pez cebra. Espermatozoides criopreservados utilizando este protocolo tiene un promedio de 25% de la fertilidad en la fertilización in vitro posterior y es estable durante muchos años.

Un método de alto rendimiento para la crioconservación de esperma de pez cebra y In Vitro Fertilización

Este es un método para la generación de embriones de pez cebra gynogenetic diploide (embriones, cuya única contribución genética proviene de la madre) por el bloqueo de la segunda división meiótica inmediatamente después de la fertilización con luz ultravioleta inactiva los espermatozoides. EP embriones no son totalmente homocigotos debido a la recombinación en la primera división meiótica, sin embargo, son homocigotos en todos los lugares que no han sido separados de sus centrómero por...

Hacer pez cebra Gynogenetic diploides por presión inicial

En este video, describimos el procedimiento para la vitrificación de embriones de conejo cosechados en la etapa de desarrollo deseada utilizando etilenglicol y dimetilsulfóxido como crioprotectores y paja criogénica como sistema portador. Los embriones vitrificados tienen una alta tasa de supervivencia y pueden almacenarse durante un período prolongado hasta su uso.

Vitrificación de embriones de conejo con paja criogénica: una técnica de enfriamiento ultrarrápido para preservar embriones de conejo para su almacenamiento a largo plazo

El pez cebra es un poderoso sistema modelo para la biología del desarrollo y la investigación de enfermedades humanas debido a su similitud genética con los vertebrados superiores. Este protocolo describe una metodología para crear embriones haploides de pez cebra que se pueden utilizar para estrategias de detección directa para identificar mutaciones recesivas en genes esenciales para la embriogénesis temprana.

La producción de embriones de pez cebra mediante haploide<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilización

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Recuperación de adultos de pez cebra Corazones para aplicaciones de alto rendimiento

La toma repetida de muestras de sangre es necesaria e importante en la investigación con animales. Desarrollamos un método novedoso, no letal y fiable para la recolección repetida de sangre de pez cebra adulto, y aplicamos este método al estudio de la bioquímica sanguínea, incluido el metabolismo de la glucosa.

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Un protocolo modificado para la manipulación de ploidía utiliza un choque de calor para inducir una parada de un ciclo en la citocinesis en el embrión temprano. Este protocolo se demuestra en el pez cebra, pero puede ser aplicable a otras especies.

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Las tecnologías CRISPR-Cas han revolucionado el campo de la edición del genoma. Sin embargo, encontrar y aislar la edición de la línea germinal deseada sigue siendo un cuello de botella importante. Por lo tanto, este protocolo describe un método robusto para examinar rápidamente el esperma de pez cebra inyectado con CRISPR F0 para ediciones de la línea germinal utilizando técnicas estándar de PCR, digestión de restricción y electroforesis en gel.

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