Name: Uso de un Mosquito recombinante Densovirus como un Vector de la entrega de genes para el análisis funcional de Genes en larvas de mosquitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Aprende a analizar la función génica en larvas de mosquito utilizando un sistema de entrega basado en densovirus recombinante AaeDV. Este método permite la sobreexpresión o el silenciamiento de genes específicos con alta eficiencia de transducción.

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Los autores reconocen el apoyo financiero de la investigación clave y programa de desarrollo de China (2016YFC1200500 a Xiao Guang Chen), la nacional Ciencias naturales Fundación de China (81672054 y 81371846), el programa equipo de investigación de lo Natural Fundación de Ciencias de Guangdong (2014A030312016) y el programa científico y tecnológico de Guangzhou (201508020263). Agradecemos a profesor Jonathan Carlson (Colorado State University) amablemente la plásmidos pUCA y p7NS1-GFP y de lectura crítica de este manuscrito.

todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad de médica sur.
 1. diseño de un intrón Artificial Nota: el intrón artificial utilizado en este trabajo es 65 bp de longitud y la secuencia es de 5 &#39; - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 &#39;.
<ol><li>Lugar el Hpa restricción sitio en ambos extremos del intrón artificial así que Hpa digestión puede liberar del intrón de plásmidos (véase la figura 1 A).</li>
	<li>Lugar los dos Xba I sitios de restricción en el intrón así que Xba I digestión puede utilizarse para insertar secuencias de expresión de RNA de pequeño.</li>
	<li>Ordenar la síntesis química de secuencias de ADN integrales del intrón artificial de un fabricante de ADN. El sintético creado el ADN es de la clonación en un plasmidio pUC19 estándar. 
	Nota: Los componentes esenciales del intrón artificial incluyen varios elementos de nucleótido de consenso, incluyendo un 5 &#39; sitio del empalme del donante (DS) con la secuencia GUAAGAGU, una secuencia conservada-punto de bifurcación (BPS) con la secuencia UACUAAC, un poli-pirimidina tracto (PPT) con la secuencia UCUUC(U) 10 y 3 &#39;-sitio del empalme del aceptador (AS) con la secuencia GAUAUCCUGCAG ( figura 1 A). Dos Xba I sitios de restricción fueron introducidos entre el DS y el BPS que puede utilizarse para insertar secuencias de expresión de RNA de pequeño. La capacidad de empalme con eficacia este intrón artificial de las células de mamíferos y mosquitos ha sido previamente confirmada 14.</li>
</ol> 2. Diseño de un Artificial pequeño Intronic ARN expresión casete Nota: para la sobreexpresión o caída de los miRNA endógeno, secuencias de codificación de miRNA precursor o una esponja de miRNA fueron insertadas entre el DS y el BPS. Para servir como un ejemplo, un precursor endógeno miRNA de Ae. albopictus aal-let-7 fue seleccionado para construir vectores virales recombinantes para la sobreexpresión de miRNA y caída. Una esponja anti-realquilar-7 fue diseñada según los métodos descritos previamente 15. Para derribar genes diana en larvas, diseñamos miRNA artificial específico (amiRNA) o secuencias de ARN (shRNA) horquilla corto utilizando software en línea 16 , 17; para servir como un ejemplo, subunidad de la V-ATPasa un mRNA (no la adhesión. AY864912) fue seleccionado como un gene de la blanco en este estudio. El amiRNA se hará referencia a como amiVTP de ahora en adelante. Todos los detalles de secuencias del pre-miRNA, esponja, amiRNA y shRNA se describen en la tabla adicional 1.
<ol><li>Ordenar la síntesis química de secuencias de cDNA de longitud completa del precursor miRNAs, miRNA esponjas y shRNA con Xba I sitios de restricción en ambos extremos de un fabricante DNA.</li>
	<li>Después de recibir el ADN ordenado, hacer girar los tubos que contienen bloques de ADN a 10.000-14.000 x g durante 1 min para asegurarse de que todos secado ADN es en la parte inferior del tubo de.</li>
	<li>Resuspender el ADN seco en agua libre de DNAsas para lograr una concentración final de 10 ng/μl.</li>
	<li>Digerir la columna vertebral del plásmido y DNA secuencias con Xba I a 37 ° C durante 1 hora y luego dephosphorylate el 5 &#39; extremos de la columna vertebral del plásmido linearizado con fosfatasa alcalina intestinal becerro (CIAP) según el fabricante &#39; protocolo de s .</li>
	<li>CIAP inactivar por calentamiento durante 60 min a 65 ° C.</li>
	<li>Correr un gel de agarosa al 1.0% y la columna vertebral lineal de corte. Luego extraer el ADN de la rebanada de gel usando un kit de extracción de gel siguiendo el fabricante &#39; instrucciones s.</li>
	<li>Ligan el fragmento de ADN en el backboneby T4 ADN ligasa (5 U/μL) a 22 ° C por 1 h.</li>
	<li>Transformar los productos de la reacción de la ligadura de las células de paso 2.7 en competentes de Escherichia coli (e. coli) y la placa en una placa de agar caldo de lisogenia (LB) que contiene ampicilina (a una concentración de 100 μg/mL).
	<ol><li>Realizar la transformación a través de un choque de calor método 18 y uso el apropiado e. coli cepa. Por ejemplo, utilizar la cepa de e. coli DH5α para transformación de choque de calor.</li>
	</ol></li> <li>Recoger una sola Colonia de paso 2.8 e incubar en una cultura de 3 mL enriquecido medio que contiene ampicilina (a una concentración de 100 μg/mL).</li>
	<li>Extraer el ADN del plásmido de la cultura bacteriana usando un kit de preparación para el mini tras el fabricante &#39; instrucciones. Enviar la muestra a una empresa de secuenciación de DNA. 
	Nota: Para la sobreexpresión o caída de los miRNA endógeno, las secuencias de codificación de miRNA precursor o una esponja de miRNA fueron insertadas entre los dos sitios de Xba. Todas construcciones de expresión o una esponja de miRNA deben ser menos de 400 bp (10% de la longitud del genoma viral) debido al límite de empaquetado del virus 19.</li>
</ol> 3. Generando un rAeaDV construir por clonación un miRNA o shRNA cassettes de expresión en la columna vertebral de un plásmido Nota: pUCA, un clon infeccioso que consiste en un plásmido de pUCA que contiene el genoma de AaeDV (3.981 nt) 19, fue amablemente proporcionada por el Prof. Jonathan Carlson y se ha descrito previamente en detalle 11. p7NS1-DsRed expresa una proteína no estructural 1 (NS1)-proteína de fusión de la proteína fluorescente roja (DsRed) de la promotora de p7 y ha sido descrito en detalle en otra parte 14. Un precursor de miR-941-1 específicos humanos 20 y su esponja, un shRNA revuelto (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), también fueron subcloned en AaeDV como control negativo.
<ol><li>Ligar el pre-miRNA, esponja, shRNA o un casete de expresión amiVTP en el Hpa sitio de la región AaeDV NS1-codificación en el espinazo de plásmido de pUCA como se describe en el paso de protocolo 2.4 a 2.7.</li>
	<li>Transformar el ADN de Stbl3 competentes de e. coli las células y selecciona un clon positivo tal como se describe en paso 2.8 a 2.10.</li>
	<li>Después de esto, extraiga el plásmido rAaeDV de las células bacterianas mediante un maxi kit preparación siguiendo el fabricante &#39; instrucciones s. 
	Nota: Las células Stbl3 o Stbl4 e. coli deben utilizarse para que la transformación de ADN rAaeDV minimizar la recombinación ITR no deseado. Una preparación para el maxi debe ser utilizado para extraer el plásmido rAaeDV para obtener una gran cantidad de ADN (&#62; 100 μg). Antes de generar el virus, la integridad de la secuencia del plásmido rAaeDV siempre debe ser analizada por secuenciación de ADN 21.</li>
</ol> 4. Transfectar células C6/36 con rAaeDV plásmidos <ol><li>cultura C6/36 células en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio de 1640 con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina en un incubador de 28 ° C.</li>
	<li>En el día 0, las células en diez frascos de cultivo 25 cm 2 de placa 18-20 h antes de la transfección por división células confluentes de 90-95% en una dilución 1:2. 
	Nota: Día 1, las células deben llegar a confluencia de 90-95%.</li>
	<li>El día 1, transfectar las células con la serie de plásmidos de rAaeDV 22.
	<ol><li>10 μg ADN en 600 μl de Medio RPMI-1640 en un tubo de microcentrífuga de diluir y mezclar suavemente. Mientras tanto, preparar 600 μl de Medio RPMI-1640 y 25 μl de reactivo de transfección por transfección.</li>
		<li>Incubar durante 5-10 min a temperatura ambiente (RT). Luego, añadir 625 μl de la mezcla de reactivo de transfección de 1640 a la mezcla de ADN de plásmido de 1640.</li>
		<li>Incubar la mezcla por 20-30 min a TA. Antes de la transfección, se lavan las células dos veces con 2 mL de Medio RPMI-1640.</li>
		<li>Incubación después de la RT (paso 4.3.3), mezcla de plásmido de DNA de reactivo de the1640-transfección de añadir al matraz de cultivo 25 cm 2 e incubar por 6 h a 28 ° C.</li>
		<li>En aproximadamente 6 h después de la transfección, quitar la transfección, lavan las células dos veces con 5 mL de Medio RPMI-1640 y luego añadir el Medio RPMI-1640 con 10% FBS. 
		Nota: rAaeDV muestra altas tasas de infección (95%) en larvas de Ae. albopictus; sin embargo, en nuestra experiencia, en casi el 50% de larvas infectadas, la infección estaba restringida a los sitios de infección primaria (p. ej., las papilas anales y cerda células) sin difusión 23. Por lo tanto, si es necesario para infectar larvas en tejidos múltiples, un defectuoso virus recombinante que expresan la proteína fluorescente debe ser coinfectado para permitir la visualización de los sitios de infección. Por ejemplo, para producir el virus recombinante defectuoso expresan DsRed, p7NS1-DsRed debe co transfected con un plásmido helper en células C6/36 según el procedimiento descrito anteriormente (la tasa de concentración de cotransfection debe ser 2:1).</li>
	</ol></li></ol> 5. Cosecha rAaeDV viriones de Transfected las células C6/36 <ol><li>cosechar las células 5 días después de la transfección. Desplazar y suspender las células en los platos por un gotero de vidrio de 5 mL, pipeteo arriba y abajo con el medio de cultivo. Todo suspensiones celulares de transferencia a tubos estériles de 15 mL.</li>
	<li>Congelar a-80 ° C o en un baño de hielo seco y etanol durante 30 min y luego descongelar a 37 ° C. Vortex durante 1 minuto Repita el procedimiento de congelación y descongelación 3 veces.</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 4.800 x g por 20 min a 4 °C.Collect el sobrenadante y desechar el precipitado. A continuación, pasar el sobrenadante a través de un filtro de jeringa desechable 0.22 μm. Alícuota y tienda el virión purificado final existencias a -80 ° C. 
	Nota: Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación.</li>
</ol> 6. Cuantificación de rAaeDV <ol><li>preparar la DNA normas. Alinear todos los plásmidos de rAaeDV con Hpa y purificar los productos digeridos con un gel de extracción kit 24.</li>
	<li>Construir la curva estándar cuantitativa absoluto y medir la concentración de virus según el método anteriormente descrito 25.</li>
</ol> 7. Transducción de mosquito <ol><li>larvas de Ae. albopictus lavado 100 1 st estadio tres veces usando desionizada del agua y a continuación, transferir las larvas en un vaso de precipitados conteniendo 95 mL de agua desionizada. Añadir 5 mL de las cepas rAaeDV (concentración final de 1.00 x 10 10 copias/mL).</li>
	<li>Incubar 24 h a 28 ° C, lavarse las larvas tres veces con agua desionizada y luego transferir las larvas a las placas y alimentar regularmente.</li>
	<li>Controlar el nivel de expresión del gen Diana en las larvas con qPCR o Western blot (representante de resultados se muestran en las figuras 3 y 4). 
	Nota: El método de detección de señal de fluorescencia se puede utilizar para aislar las larvas infectadas más precisamente. Por ejemplo, para detectar señales fluorescentes de larvas infectadas con el virus recombinante que expresan DsRed, las larvas pueden coloca en un portaobjetos de concavidad y observadas bajo un microscopio de fluorescencia invertido cada 8 h hasta 2 días post-infección. Una vez que se detectan larvas fluorescentes, deben estar separados en las tazas de la prueba individual de plástico para permitir la posterior observación continua. Larvas con múltiples tejidos infectados pueden ser identificadas usando este método.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Es importante superar dos de las principales barreras que limitan la construcción de rAaeDV. La primera es la producción de virus recombinante defectuoso. Se ha reportado que MDV se puede utilizar como un vector para expresar apropiadamente genes extranjeros, como el escorpión insectos específicos neurotoxins20 y la proteína GFP; sin embargo, independientemente de la estrategia de construcción, una vez ORFs de MDV se inserta o se reemplazan con genes exógenos, los viriones no pueden formar independientemente a menos que ...

Enfermedades transmitidas por mosquitos como la malaria, dengue, fiebre zika y fiebre amarilla, son problemas de salud pública internacional importante que siguen representan una fracción significativa de la carga global enfermedades infecciosas1,2. Los insecticidas convencionales, que han sido utilizados en respuesta a vectores, son un componente importante de la estrategia de control de mosquito integrado sostenible para la prevención de enfermedades transmitidas por mosquitos. Sin embargo, tales estrategias han probado para ser relativamente ineficaz o indeseables debido a los impactos ambientales negativos asociados, así como la evolución de la resistencia en las poblaciones de mosquitos3,4. Por estas razones, hay una necesidad urgente de métodos alternativos de mosquito control y el uso de métodos transgénicos para producir mosquitos machos estériles y la liberación de mosquitos resistentes al patógeno han surgido como prometedoras nuevas estrategias de control. Para desarrollar nuevo control efectivo métodos, tales como seguros y efectivos enfoques en vivo entrega de gen, el análisis integral de funciones de los genes mosquito es necesario.
Microinyección directa de plásmido ADN, doble había trenzado RNA (dsRNA) o ARN interferente pequeño (siRNA) es el más comúnmente utilizado en vivo gene entrega en mosquitos. De hecho, la producción de variedades transgénicas de mosquitos todavía dependen de un proceso de embrión microinyección5,6,7. Sin embargo, microinyección tiene varias limitaciones. En primer lugar, esta técnica es técnicamente exigente y consiste en complicados procedimientos. En segundo lugar, la inyección causa una ofensa física a los embriones, larvas, pupas y adulto, que afecta directamente a la viabilidad del organismo diana. En tercer lugar, es difícil de inmovilizar las larvas de mosquito para microinyección porque la mayoría vive en un hábitat acuático y posee una característica moverse movimiento. En cuarto lugar, el tamaño de 1st-2 larvas desegundo estadio es 10 a 20 veces más pequeño que el de 4th instar y larvas más viejas y las cutículas de los primeros son más delicadas. Estas características hacen difícil manipular 1st-2 larvas desegundo estadio en comparación con aquellos en etapas mayores. Combinados, estos factores contribuyen a una tasa de supervivencia después de la inyección reducida para larvas (aproximadamente 5%) en comparación con adultos8. Sistemas de entrega basados en viral se han desarrollado para superar las barreras asociadas extracelulares e intracelulares. Estos sistemas tienen las ventajas de fácil manipulación, eficiencia de transducción alto, robustos y a largo plazo niveles de expresión y la capacidad para producir efectos persistentes en vivo. Por lo tanto, gene sistemas utilizando adenovirus, retrovirus y lentivirus han sido ampliamente utiliza líneas celulares de inmammalian y especies modelo. El sistema de expresión virales Sindbis se había utilizado anteriormente para analizar la función del gene en el mosquito adulto; Además de las preocupaciones de seguridad de la biotecnología, sin embargo, la inyección es todavía un proceso necesario para la infección viral9. Aunque la administración oral sumergiendo las larvas en la solución de dsRNA se ha divulgado previamente como un método factible, es adecuado para pequeños RNA función análisis10. Por lo tanto, métodos de distribución viral eficaz todavía deben desarrollar para los mosquitos.
Mosquito densoviruses (MDVs) forman parte de la subfamilia Densovirinae de Parvoviridaey todo pero una caída dentro del género Brevidensovirus11. MDV viriones son no-envueltos y constan de un genoma de ADN (ssDNA) monocatenario y una cápside icosaédrica (20 nm de diámetro). El genoma viral es de aproximadamente 4 kb de tamaño y se replica dentro de los núcleos de las células del huésped. MDVs son relativamente estables en el medio ambiente y muestran una gama estrecha con alta especificidad para los mosquitos. Estos virus tienen el potencial de propagarse y naturalmente persisten en las poblaciones de mosquitos y pueden invadir casi todos los órganos y tejidos de estos insectos, incluyendo el midgut, túbulos de Malpighi, grasa corporal, musculatura, neuronas y glándulas salivales12.
Genomas MDV intactos pueden subcloned en vectores plásmidos para producir clones infecciosos basados en el plásmido; Cuando estos clones se entregan en células de mosquito, el genoma viral se extrae el vector plásmido, y se producen partículas virales infecciosas. Porque MDV tiene un genoma pequeño de ssDNA, clones infecciosos se construyen fácilmente y el genoma viral puede ser fácilmente manipulado11,13. Estas características hacen de MDV un agente valioso para examinar la biología del mosquito. Sin embargo, porque casi la totalidad de la secuencia del genoma viral es esencial para la proliferación viral, la creación de virus recombinantes a través de la sustitución o inserción de genes foráneos provoca una pérdida en la capacidad de envases o replicación viral, que crea un barrera para el desarrollo de MDVs como vectores entrega del gene. Adjunto, divulgamos usando una estrategia de expresión de ARN pequeño intronic artificial para desarrollar un rAaeDV de no-defectuosa en vivo RNA sistema de entrega que tiene las ventajas de la construcción del plásmido fácil y el mantenimiento de un virus funcional que puede producir expresión estable y a largo plazo en las células del huésped sin necesidad de virus de tipo salvaje. Además, este método permite la transducción fácil de larvas.
En este estudio se describen los protocolos para los siguientes pasos: 1) diseño de rAaeDVs un casete de expresión de ARN pequeño intronic, 2) producción de partículas de virus recombinantes usando la célula de embalaje C6/36 de la codificación de línea, 3) análisis cuantitativo de la libre rAaeDV genoma copiar números y 4) infección de larvas de Ae. albopictus por introducción directa del virus en el cuerpo de agua del hábitat larval. En general, este trabajo demostró que específico RNAs pequeños genes diana pueden ser overexpressed o derribados en larvas de mosquitos mediante el sistema de entrega MDV desarrollado.

<table><tbody><tr><td>Máquina centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Kit de extracción de gel</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Kit Midi de plásmido</td><td>Omega Biotech</td><td>D6904</td><td></td></tr><tr><td>Agar purificado</td><td>OXOID</td><td>LP0028A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasa alcalina termosensible FastAP (1 U/&micro; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest HpaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD1034</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest XbaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0684</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase (5 U/&micro; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TransStbl3 Célula químicamente competente</td><td>Beijing Transgen Biotech</td><td>CD521-01</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina &nbsp;</td><td>Beijing Tiangen Biotech</td><td>RT501</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Promega</td><td>MC5008</td><td></td></tr><tr><td>SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)</td><td>Beijing Tiangen Biotech</td><td>FP205</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de un mosquito recombinante densovirus como un vector de la entrega de genes para el análisis funcional de genes en larvas de mosquitos

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

Microinyección en vivo es la técnica de transferencia de genes más comúnmente utilizado para el análisis de las funciones del gene en los mosquitos. Sin embargo, este método requiere más técnicamente exigente operación y consiste en complicados procedimientos, especialmente cuando se utiliza en las larvas debido a su pequeño tamaño, relativamente delgada y frágil de la cutícula y alta mortalidad, que limitan su aplicación. Por el contrario, vectores virales para la entrega del gene se han desarrollado para superar las barreras extracelulares e intracelulares. Estos sistemas tienen las ventajas de fácil manipulación, eficiencia de transducción genética alta, mantenimiento a largo plazo de la expresión génica y la capacidad para producir efectos persistentes en vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) son específicos de mosquito, pequeños virus de ADN de monocatenario que efectivamente pueden entregar extranjeros los ácidos nucleicos en células de mosquito; sin embargo, la sustitución o inserción de genes foráneos a crear virus recombinantes que típicamente causa una pérdida de capacidades de envases o replicación, que es un obstáculo para el desarrollo de estos virus como vectores de la entrega.
Adjunto, divulgamos usando una estrategia de expresión de ARN pequeño intronic artificial para desarrollar un recombinante defectuoso no Aedes aegypti densovirus (AaeDV) en vivo el sistema de entrega. Se describen los procedimientos detallados para la construcción, envases y análisis cuantitativo de los vectores rAaeDV y para la infección de larvas.
Este estudio demuestra, por primera vez, la viabilidad del desarrollo de un no-defectuosa recombinante MDV micro RNA (miRNA) sistema de la expresión, proporcionando una potente herramienta para el análisis funcional de genes en mosquito y establecer una base para la aplicación de paratransgenesis viral para el control de enfermedades transmitidas por mosquitos. Hemos demostrado que larvas de Aedes albopictus 1st estadio podrían ser fácilmente y efectivamente infectadas mediante la introducción de virus en el cuerpo de agua del sitio de cría de larvas y que el rAaeDVs desarrollado podría utilizarse para sobreexpresar o derribar el expresión de un gen Diana en larvas, proporcionando una herramienta para el análisis funcional del mosquito de genes.

Estrategias para la construcción de rAaeDV Un vector de rAaeDV defectuosa se generó para expresar el gen DsRed en larvas de mosquitos. El plásmido resultante contenía un cassette de la proteína NS1-DsRed fusión con la proteína VP eliminada (figura 1A). rAaeDV de plásmidos que contienen construcciones de expresión de miRNA, amiRNA, shRNA y miRNA esponja fueron diseñados (se muestra en la figura 1</stron...

Nos informe utilizando una artificial pequeño intronic RNA expresión estrategia para desarrollar un recombinante defectuoso no Aedes aegypti densovirus (AaeDV) en vivo el sistema de entrega. Se describe un procedimiento detallado para la construcción, envases y análisis cuantitativo de los vectores rAaeDV, así como por infección larval.

Uso de un Mosquito recombinante Densovirus como un Vector de la entrega de genes para el análisis funcional de Genes en larvas de mosquitos

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar la función génica de larvas de mosquito, utilizando un densovirus recombinante de mosquito como sistema de entrega génica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en sistemas de entrega basados en virus, como cómo superar las barreras extracelulares e intracelulares asociadas. Las principales ventajas de estas técnicas son la facilidad de manipulación, alta eficiencia de transducción, expresión a largo plazo y robusta, y la capacidad de producir efectos persistentes in vivo.Este trabajo demostró que pequeños ARN específicos o genes diana pueden sobreexpresarse o silenciarse en larvas de mosquito mediante el sistema de entrega de densovirus desarrollado. Las implicaciones de esta técnica amplían las aplicaciones de la estrategia de expresión descrita para investigar la biología del mosquito, ya que este método permite transducciones sencillas de las larvas. La realización del procedimiento estará a cargo de Pei-Wen Liu, un candidato doctoral de nuestro laboratorio.Comience por solicitar la síntesis química de las secuencias completas de ADNc para las precursores de miARN, esponjas de miARN y ARNsh, tal como se descri

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Invertir enfoques genéticos han demostrado ser extremadamente útil para determinar qué genes de resistencia a patógenos vector subyacente en los mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra un método usado por el laboratorio de James para inyectar dsRNA en hembras de A. aegypti, que albergan el virus del dengue. La técnica para la calibración de agujas de inyección, la manipulación de la configuración de la inyección, y la inyección de dsRNA en el tórax se ilustra.

La inyección de dsRNA en Mujer A. aegypti mosquitos

Invertir enfoques genéticos han demostrado ser extremadamente útil para determinar qué genes de resistencia a patógenos vector subyacente en los mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra un método usado por el laboratorio Dimopoulos para inyectar dsRNA en los mosquitos Anopheles gambiae, que albergan el parásito de la malaria. La técnica de la manipulación de la configuración de la inyección y la inyección de dsRNA en el tórax se ilustra.

Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

Oligonucleótidos se puede utilizar para sustituir a un sitio concreto de un solo nucleótido de los genes diana transfectadas en...

Transfección y mutagénesis de los genes diana en células de mosquito por nucleico cerrado modificado ácido oligonucleótidos

En este protocolo se combinan RNAi mediada por silenciamiento de los genes con...

RNAi mediada por Gene y Derribo<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo de diuresis en Mujeres Adultas<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Los mosquitos

Source: Liu, P., et al. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the process of isolating recombinant Aedes aegypti densovirus (rAaeDV) from infected mosquito-derived epithelial cells. The infected cells are collected and exposed to repeated freeze-thaw cycles for lysis. Lysate is centrifuged, and the supernatant containing viral particles is filtered, aliquoted, and...

Harvesting Recombinant Aedes aegypti Densovirus from Infected Cells

Fuente: Liu, P., et al. Uso de un densovirus recombinante de mosquito como vector de entrega de genes para el análisis funcional de genes en larvas de mosquito. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra el uso de densovirus de mosquito recombinantes que codifican microARN para silenciar genes específicos en larvas de mosquito. Las larvas de primer estadio infectadas producen microARN funcionales que suprimen la expresión del gen diana para estudios posteriores.

Silenciamiento génico mediado por densovirus recombinante en larvas de mosquito

En este video, demostramos la entrega de una construcción de impulsor genético en el embrión del mosquito Anopheles gambiae a través de la técnica de microinyección de embriones. Este procedimiento permite la integración de la construcción de ADN entregada, a través de la recombinación homóloga, en las células de la línea germinal para generar una población de mosquitos transformada.

Microinyección de embriones de mosquitos: una técnica para introducir ADN exógeno en la yema del embrión de Anopheles gambiae para generar mutaciones de la línea germinal

Aquí se describe un procedimiento para inhibir la función génica en los mosquitos vectores de enfermedades mediante el uso de quitosano / interferir nanopartículas de ARN que son ingeridas por las larvas.

El quitosano / ARN de interferencia mediada por nanopartículas silenciamiento génico en la enfermedad vectorial larvas de mosquitos

La interferencia de ARN (ARNi) es una herramienta extremadamente valiosa para descubrir la función de los genes. Sin embargo, la capacidad de dirigirse a genes utilizando ARNi durante las etapas preadultas es limitada en el principal vector de la malaria humana, Anopheles gambiae. Describimos un protocolo de ARNi para reducir la función génica mediante inyección directa durante el desarrollo de la pupa.

RNAi gatillo en la entrega<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Las pupas

Este protocolo describe una metodología de microinyección que hemos estandarizado y utilizado durante varios años a entregar cantidades específicas de ácidos nucleicos directamente a la hemolinfa de los mosquitos y las moscas de casa. Este protocolo da lugar a mortalidad mínima inyección y permite dosis correlacionadas medidas de fecundidad.

DsRNA reproducible microinyección y bioensayo de oviposición de mosquitos y moscas de la casa

El sistema bipartito GAL4-UAS es una herramienta versátil para la modificación de la expresión génica de forma espaciotemporal controlada que permite el análisis genético funcional en Anopheles gambiae. Los procedimientos descritos para el uso de este sistema son una estrategia de clonación semi-estandarizada, sexado y cribado de pupas para marcadores de proteínas fluorescentes y fijación embrionaria.

Uso del sistema GAL4-UAS para genética funcional en Anopheles gambiae

Aprende a analizar la función génica en larvas de mosquito utilizando un sistema de entrega basado en densovirus recombinante AaeDV. Este método permite la sobreexpresión o el silenciamiento de genes específicos con alta eficiencia de transducción.

Uso de un Mosquito recombinante Densovirus como un Vector de la entrega de genes para el análisis funcional de Genes en larvas de mosquitos (Video) | JoVE Journal

Uso de un Mosquito recombinante Densovirus como un Vector de la entrega de genes para el análisis funcional de Genes en larvas de mosquitos

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