Uso de un Mosquito recombinante Densovirus como un Vector de la entrega de genes para el análisis funcional de Genes en larvas de mosquitos

El objetivo general de este procedimiento es analizar la función génica de larvas de mosquito, utilizando un densovirus recombinante de mosquito como sistema de entrega génica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en sistemas de entrega basados en virus, como cómo superar las barreras extracelulares e intracelulares asociadas. Las principales ventajas de estas técnicas son la facilidad de manipulación, alta eficiencia de transducción, expresión a largo plazo y robusta, y la capacidad de producir efectos persistentes in vivo.

Este trabajo demostró que pequeños ARN específicos o genes diana pueden sobreexpresarse o silenciarse en larvas de mosquito mediante el sistema de entrega de densovirus desarrollado. Las implicaciones de esta técnica amplían las aplicaciones de la estrategia de expresión descrita para investigar la biología del mosquito, ya que este método permite transducciones sencillas de las larvas. La realización del procedimiento estará a cargo de Pei-Wen Liu, un candidato doctoral de nuestro laboratorio.

Comience por solicitar la síntesis química de las secuencias completas de ADNc para las precursores de miARN, esponjas de miARN y ARNsh, tal como se describe en el protocolo de texto adjunto. Tras recibir el ADN solicitado, centrifugue los tubos que contienen los fragmentos de ADN para asegurar que todo el ADN seco quede en el fondo del tubo. Luego, re suspenda el ADN en agua libre de DNasa para obtener una concentración final de 10 nanogramos por microlitro.

Añada seis microlitros de XbaI para digerir el armazón del plásmido y las secuencias de ADNc, y coloque la reacción a 37 grados Celsius durante una hora. Luego, desfosforile los extremos cinco primos del armazón del plásmido linealizado con fosfatasa alcalina de intestino de ternero, según las instrucciones del fabricante. Para un empaquetamiento eficiente, el tamaño del genoma no puede exceder los 4.400 nucleótidos, lo que representa el 110 % de la longitud del genoma del densovirus de mosquito de tipo silvestre, o la expresión de microARN intrónicos puede consistir en no más de 400 nucleótidos que se pueden introducir en el genoma de Aedes aegypti.

A continuación, inactivar por calor la fosfatasa alcalina a 65 grados Celsius. Luego, separar el ADN en un gel de agarosa al 1% y cortar el andamiaje linealizado. Extraer el ADN del fragmento de gel utilizando un kit de extracción de geles, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Una vez extraído, ligar el fragmento de ADN al vector utilizando ligasa de ADN T4. Luego, emplear choque térmico para transformar los productos de la reacción de ligación en células competentes de E. coli DH5-alpha. Sembrar las bacterias transformadas en una placa de agar LB que contenga 100 microgramos por mililitro de ampicilina.

Al día siguiente, seleccione una colonia individual de la placa y cree un cultivo inicial utilizando tres mililitros de medio enriquecido que contenga 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Finalmente, extraiga el ADN plasmídico del cultivo bacteriano utilizando un kit de miniprep, siguiendo las instrucciones del fabricante. Envíe una muestra del ADN a una empresa de secuenciación de ADN para su verificación.

Ligue el pre-miRNA o el shRNA al sitio HpaI de la región codificante NS1 de AaeDV en el vector plasmídico pUCA, utilizando los métodos descritos para el casete artificial de expresión de ARN pequeño intrónico. En lugar de utilizar células DH5-alpha, transforme el ADN en células competentes de E. coli Stbl3. A continuación, siembre las células transformadas en una placa de agar LB que contenga 100 microgramos por mililitro de ampicilina, y prepare un cultivo inicial a partir de un clon positivo. Posteriormente, extraiga el plásmido rAaeDV de las células bacterianas utilizando un kit de maxipreparación, siguiendo las instrucciones del fabricante.

En el día cero, divida los frascos con confluencia del 90 al 95 % de células C6/36 de uno a dos en 10 frascos de cultivo T-25. Incube los frascos durante 18 a 20 horas a 28 grados Celsius hasta que alcancen nuevamente una confluencia del 90 al 95 %.

El primer día, transfecte las células con los plásmidos rAaeDV generados. Para ello, diluya 10 microgramos de ADN en 600 microlitros de medio RPMI-1640 y mezcle suavemente la solución. Mientras tanto, prepare 600 microlitros de medio RPMI-1640 y 25 microlitros de reactivo de transfección por cada transfección.

Incube las células con el ADN durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue 625 microlitros de la mezcla del reactivo de transfección RPMI-1640 a la mezcla de ADN plasmídico e incube esta mezcla durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, lave las células dos veces con medio RPMI-1640 y luego agregue la mezcla de transfección a cada uno de los frascos de cultivo T-25.

Incube las células en la mezcla de transfección durante seis horas a 28 grados Celsius. Después de seis horas, retire el medio de transfección, lave las células dos veces con cinco mililitros de medio RPMI-1640 y luego agregue medio RPMI-1640 fresco que contenga 10 %FBS. Cinco días después de la transfección, utilice una pipeta de vidrio de cinco mililitros para despegar y suspender las células en las placas, pipeteando hacia arriba y hacia abajo con el medio de cultivo.

Transfiera las suspensiones celulares de cada matraz a sus propios tubos estériles de 50 mililitros. Para cosechar un virus dependiente de umbral alto, es necesario mantener las células durante cinco días después de la transfección. Congele los tubos individuales a menos 80 grados Celsius o en un baño de etanol con hielo seco durante 30 minutos.

Luego, descongele rápidamente a 37 grados Celsius y vortexe la suspensión celular durante un minuto. A continuación, recoja el sobrenadante de la muestra centrifugada y deseche el sedimento. Luego, pase el sobrenadante a través de un filtro desechable de jeringa de 0,22 micrómetros.

Aliquotar y almacenar los stocks finales de viriones purificados a menos 80 grados Celsius. Lavar 100 larvas de primer estadio de A. albopictus tres veces, utilizando agua desionizada. Luego, transferir las larvas a un vaso de precipitados que contenga 95 mililitros de agua desionizada.

Añada cinco mililitros de los cultivos de rAaeDV e incube las larvas durante 24 horas a 28 grados Celsius. Para lograr una infección exitosa de las larvas, es esencial que las larvas estén en contacto con partículas virales infecciosas durante 24 a 36 horas para asegurar altas tasas de infección. Tras la incubación, lave las larvas tres veces utilizando agua desionizada y luego transfiera las larvas nuevamente a las placas. Alimente las larvas regularmente. Monitoree el nivel de expresión del gen diana en las larvas, utilizando PCR cuantitativa o inmunotransferencia western, mediante técnicas estándar.

En este ejemplo, se analizaron 100 larvas de primer estadio para evaluar su expresión endógena de miARN tras la infección con el virus recombinante que contiene el casete de expresión aal-let-7, el cual muestra sobreexpresión.

La eficiencia del constructo anti-let-7 se muestra a la derecha, destacando sus capacidades de silenciamiento. Con el fin de monitorear la eficiencia del silenciamiento del ARNm de la V-ATPasa mediante los vectores rAaeDV, se trataron un total de 100 larvas de primer estadio con cantidades iguales de rAaeDV de distintos tipos, agregando el virus al cuerpo de agua del hábitat larval. Los niveles del ARNm de la V-ATPasa se redujeron sustancialmente mediante un rAaeDV que expresa miARN y mediante un rAaeDV que expresa shARN intrónicos.

Nuestros resultados validan una estrategia de expresión intrónica que ofrece un nuevo paradigma, capaz de superar las limitaciones de los densovirus de mosquitos con genoma defectuoso, para permitir la entrega eficiente de genes foráneos en mosquitos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se puede introducir un casete de expresión de microARN intrónico de no más de 400 nt en el genoma del densovirus de Aedes aegypti. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para la investigación en la producción de densovirus recombinantes de mosquitos no defectuosos que puedan sobreexpresar o downregular microARNs y genes diana para explorar el análisis funcional de genes de mosquitos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el sistema de entrega desarrollado de densovirus de mosquito para analizar las funciones genéticas en larvas de mosquito.