In Situ La tinción de tetrámero de MHC y análisis cuantitativo para determinar la localización, abundancia y fenotipo de células de T CD8 específica de antígeno en los tejidos

El objetivo general de este procedimiento es determinar la ubicación, abundancia y fenotipo de las células T CD8 positivas específicas para un antígeno dentro de tejidos de interés. Este método ayuda a responder rápidamente preguntas sobre las células T CD8 al proporcionar un medio para localizar, cuantificar y caracterizar fenotípicamente prácticamente cualquier célula T CD8 específica para un antígeno en cualquier tejido. La principal ventaja de esta técnica es que permite determinar la distribución espacial de las células T CD8 positivas específicas para un antígeno en relación con otras células y estructuras dentro de los tejidos de interés.

El procedimiento será demostrado por Gwantwa Mwakalundwa junto con Shengbin Li. En el día uno del procedimiento, utilice un escalpelo para cortar el tejido fresco en trozos de aproximadamente 0,5 x 0,5 centímetros. Aquí se muestra tejido de bazo de macaco rhesus.

Encole por separado cada fragmento de tejido en el centro de la parte superior de un émbolo e incruste las muestras en tres a cinco mililitros de agarosa al 4 % de punto de fusión baja tibia en PBS. Etiquete los émbolos con la información correspondiente del tejido. A continuación, coloque las muestras en un soporte enfriado dentro de un recipiente con hielo.

Una vez que el agar haya solidificado, encienda el microtomo y ajuste el espesor a 200 micrómetros. Después de instalar una cuchilla nueva, inserte los émbolos en el baño del microtomo. Llene el baño del microtomo con 100 a 200 mililitros de PBS-H recién preparado y agregue cubos de hielo de PBS-H para mantener la temperatura entre cero y dos grados centígrados.

Después de obtener secciones de 200 micrómetros, utilice un pincel para eliminar el agar que rodea cada sección y transfiera las muestras a cámaras tisulares individuales dentro de pozos separados de una placa de cultivo celular de 24 pozos que contenga un mililitro de PBS-H frío. Cuando se hayan obtenido todas las muestras, incube las secciones de tejido durante la noche en un mililitro de tetrámeros de clase I de MHC cargados con péptidos conjugados con fluorocromo, diluidos en PBS-H suplementado con 2% de suero normal de cabra, a cuatro grados centígrados con agitación. A la mañana siguiente, transfiera cada cámara tisular a pozos individuales de una nueva placa de 24 pozos que contenga un mililitro de PBS-H frío fresco durante 20 minutos.

Después del segundo lavado, fije las secciones en un mililitro de paraformaldehído fresco al 4% durante dos horas a temperatura ambiente. A continuación, realice dos lavados de cinco minutos cada uno en PBS-H frío. Transfiera las secciones a una nueva placa de 24 pocillos que contenga urea 0,01 molar y someta las secciones a microondas tres veces durante aproximadamente 10 segundos cada vez hasta que hierva la urea.

Para permeabilizar y bloquear las muestras, incubar los cortes en solución de bloqueo que contiene PBS-H suplementado con un detergente 0,3 % Triton X-100 y 2 % de suero normal de cabra en un agitador durante una hora, a cuatro grados Celsius. Al final de la incubación, transferir las cámaras de tejido a pozos individuales de una nueva placa de 24 pozos que contenga un mililitro de solución que contiene anticuerpo anti-FITC de conejo, anticuerpo anti-CD humano de ratón y anticuerpo anti-CD3 humano de rata. Incubar las muestras durante la noche a cuatro grados Celsius con agitación.

El tercer día, lave las secciones tres veces con PBS-H fresco a cuatro grados celsius durante al menos 20 minutos por lavado y realice una incubación final con los anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo apropiados durante un máximo de tres días, protegido de la luz. Al final de la incubación con el anticuerpo terciario, enjuague las muestras con tres lavados de 20 minutos en PBS-H fresco y utilice un pincel para transferir las muestras de cada cámara de tejido a una portaobjetos de vidrio. Recubra cada sección con medio de montaje suplementado con un conservador de fluorocromo y cubra las muestras con una cubreobjetos.

Luego, almacene los portaobjetos en un recipiente protegido de la luz, a 20 grados celsius. El día del análisis de imágenes, coloque el primer portaobjetos sobre la platina de un microscopio confocal y seleccione los láseres y filtros adecuados para cada fluoróforo utilizado para marcar la muestra de tejido. Utilizando el objetivo de 20x, obtenga secuencialmente una serie z a intervalos de tres micrones en cada uno de los canales de fluoróforo, en múltiples campos de 800 x 800 píxeles.

Luego, construya un mosaico de los campos recopilados y guarde cada imagen del mosaico con un nombre basado en la muestra de tejido correspondiente. En estas imágenes representativas, se compara una sección teñida con tetrámeros de MHC clase I cargados con un péptido de SIV con una sección del mismo tejido teñida con tetrámeros de MHC clase I cargados con un péptido irrelevante, lo que demuestra la especificidad de la tinción con tetrámeros. En estas imágenes, las células T específicas del virus teñidas con tetrámeros de MHC clase I cargados con el péptido de SIV presentan tinción de co-marcaje para CD8, un marcador de subpoblación de células T, pero no para CD20, una proteína de superficie celular expresada en células B.

Este mosaico se creó a partir de múltiples campos de series z confocales, que se utilizaron para la cuantificación de células teñidas con tetrámero con fenotipos específicos y en diferentes compartimentos anatómicos del ganglio linfático. Esta imagen ampliada resalta un área del mosaico del ganglio linfático que contiene un folículo folicular delineado por la tinción de IgM. Se pueden detectar células teñidas con tetrámero de clase I del MHC, algunas de las cuales coexpresan el marcador de activación y proliferación de linfocitos T, KI67, tanto dentro como fuera del folículo de linfocitos B.

Esta combinación de tinción permite determinar los estados de activación y proliferación de las células T CD8 positivas específicas frente al SIV, así como su localización dentro de los tejidos linfoides secundarios. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en aproximadamente cinco días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el tejido fresco es fundamental para una tinción exitosa.

Procese las muestras dentro de las 24 horas o menos posteriores a la recolección, manteniéndolas frías hasta la fijación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una tinción con tetrámeros e inmunohistoquímica para determinar la ubicación, abundancia y fenotipo de las células T CD8 positivas específicas para antígenos en los tejidos de interés. No olvide que trabajar con agentes infecciosos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones para prevenir la exposición, como usar el equipo de protección personal adecuado y limitar el uso de objetos punzantes, al realizar este procedimiento.