Name: In Situ La tinción de tetrámero de MHC y análisis cuantitativo para determinar la localización, abundancia y fenotipo de células de T CD8 específica de antígeno en los tejidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a realizar tinción de tetrámeros MHC in situ e inmunohistoquímica para analizar células T CD8 específicas de antígeno en tejidos. Este método permite determinar su localización, abundancia y fenotipo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por becas de servicio de salud pública de los institutos nacionales de salud (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

1. día 1: secciones de tejido fresco e incubación primaria <ol><li>uso de un bisturí para cortar tejido fresco en trozos pequeños (aproximadamente 0,5 cm de ancho por 0,5 cm de altura). Por separado cada tejido de un émbolo del pegamento e incrustarlos con 3-5 mL de agarosa de baja fusión de 4% en PBS. El émbolo de la etiqueta con la información de tejido con una pegatina. Poner en un porta frío en un cubo de hielo para solidificar.</li>
	<li>Encienda el micrótomo y el espesor de las secciones a 200 μm. Instale una cuchilla de afeitar en el micrótomo e Inserte el émbolo montado con el tejido en el baño de micrótomo.</li>
	<li>Preparación de solución salina con tampón fosfato con heparina (PBS-H) mediante la adición de 100 μg/mL o 18.7 de U/mL heparina para PBS para preservar el RNA y permitir aplicaciones de ISH potenciales aguas abajo. Llene la bañera de micrótomo, cubriendo el tejido embebido, con 100-120 mL de PBS estéril, refrigerado-H. Añadir cubitos de hielo de PBS-H al baño para mantener la temperatura a 0 - 2 ° C. arranque el microtomo y cortar el tejido en 200 secciones μm. 
	Nota: Es importante mantener los tejidos refrigerados en hielo para minimizar la actividad celular dentro de los tejidos y porque el tejido fresco es más fácil a la sección cuando se enfría. PBS solo puede usarse si no hay planes para ISH abajo.</li>
	<li>, Tejidos que no corte bien con un micrótomo (p. ej., intestino y pulmón), usar un bisturí o navaja para cortar el tejido en tiras finas como cerca posible de 200 μm.</li>
	<li>Etiqueta de la tapa de las placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos con la información de la muestra experimental y las cámaras de tejido en los pocillos correspondientes. Refrigerados de uso un pincel para transferir las secciones a una cámara de tejido situado en el pozo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos que contienen 1 mL de PBS-H. 
	Nota: Cámaras de tejido reutilizable deben hacerse antes de iniciar la coloración. Cámaras de tejido pueden ser hechas usando un tubo de snap-cap 14 mL polipropileno fondo redondo y malla de alambre. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar la parte inferior de un tubo de snap-cap 14 mL polipropileno fondo redondo. Cortar la malla de alambre en un círculo para el agujero en la parte inferior del tubo. El círculo de malla de alambre con un mechero de Bunsen hasta que esté al rojo vivo de calor. Establecido muy rápidamente el círculo de malla de alambre y empuje el tubo dentro de la malla. Compruebe que el acoplamiento de alambre está fijado firmemente a la parte inferior del tubo y luego con cuidado cortar la parte superior del tubo en la marca de 3 mL con una cuchilla de afeitar. Puesto hasta 3 secciones de tejido en cada cámara de tejido, o hasta 1 cm 2 de tejido por pozo. Mantener al menos un pozo vacío entre pozos con combinaciones de anticuerpos diferentes para evitar la contaminación cruzada.</li>
	Tetrámero de <li>proceder a la primaria y el anticuerpo tinción inmediatamente después de terminar a la transferencia de todas las secciones de corte en los compartimientos de los tejidos. Mantener las secciones sumergidas y enfría en 1 mL de PBS-H en todo momento.</li>
	<li>Incubar las secciones de tejido durante la noche con 0,5 μg/mL de conjugado de FITC, cargado de péptido MHC-I tetrámeros diluidos en PBS-H con 2% de suero de cabra normal (NGS). Incluyen mouse u otros no conejo anticuerpos dirigidos a epítopes extracelulares de interés en la incubación (por ejemplo, los anticuerpos anti-CD8 rata diluyeron 1: 500 en PBS-H con el 2% NGS). Ponga 1 mL de anticuerpos diluidos en cada pocillo. 
	Nota: Debe tenerse cuidado al seleccionar anticuerpos CD8, y algunos pueden mejorar algunos pueden inhibir tetrámeros de MHC binding a receptores de células T 4 , 21. El rata anti-CD8 anticuerpo descrito aquí es inestable y a veces resulta algo débil de la tinción. Se utiliza para el etiquetado triple porque es el único no-conejo y CD8 anticuerpos de ratón no probaron eso células de T CD8 de macaco rhesus manchada.</li>
	<li>1 mL de solución por pozo para el anticuerpo primario e incubaciones posteriores y realizar esto y todas las incubaciones posteriores a 4 ° C, con las placas en una plataforma oscilante. 
	Nota: Los tejidos deben flotar libremente en la cámara de.</li>
</ol> 2. Día 2: Fijación e incubación secundario <ol><li>después de la incubación primaria, lavar las secciones dos veces con 1 mL de PBS-H refrigerado por 20 min cada colada. Ello mediante la transferencia de las cámaras de tejido a una placa de cultivo de tejidos de diferentes 24 pocillos que contienen 1 mL de PBS-H refrigerado en los pozos correspondientes. 
	Nota: Tenga cuidado de no gotear el contenido desde una muestra experimental en otro cuando se mueve entre compartimientos de tejido. Para todas las incubaciones posteriores y lavados, igualmente la transferencia de la cámara de tejido a un plato limpio con la solución adecuada. Asegúrese de supervisar las secciones de las cámaras de tejido durante el procedimiento para asegurarse de que las secciones no se atascan a los lados de las cámaras de tejido. Si ellos, empuje hacia dentro la solución.</li>
	<li>Fijar las secciones con 1 mL de fresco con tampón PBS paraformaldehído al 4% durante 2 h a temperatura ambiente (no demasiado fix). Lavado con PBS-H frío dos veces por 5 min 
	PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; usar equipo de protección personal. 
	Nota: Si se necesita recuperación de antígeno y permeabilización para detectar epítopos intracelulares, antígenos pueden recuperar hirviendo las secciones en 0.01 urea mol después de la fijación de paraformaldehido.</li>
	<li>Transferencia de las secciones en placas de 24 pocillos de cultivo que contiene 0,01 mol urea y colocar estas placas en un horno de microondas. Hervir las secciones tres veces para unos 10 s cada uno, para un total de 30 s. 
	Nota: Tenga mucho cuidado, como punto de ebullición la solución puede forzar las secciones de las fuentes. Si esto ocurre, utilice un pincel para rechazar las secciones de los lados de la cámara de tejido o de la tapa de la placa en la parte inferior de la cámara de tejido adecuada.</li>
	<li>Previo a la incubación del anticuerpo secundario, permeabilizar y bloquear las secciones de tejido por incubación en solución de bloqueo que contiene PBS-H, 0,3% detergente (PBS-H-T) y 2% NGS en un eje de balancín por 1 h a 4 ° C. realizar anticuerpos posterior las incubaciones con PBS-H-T/2% NGS.</li>
	<li>Para la incubación secundaria, la transferencia de las secciones en las cámaras de tejido para pozos con conejo anti-FITC anticuerpos diluidos 1: 10,000 en PBS-H-T/2% NGS. Incubar durante una noche.</li>
	Anticuerpo anti-CD20 de <li>realizar counterstaining usando ratón diluido 1: 200 en PBS-H-T/2% NGS. Para esta opción, recuperar los epitopos si es necesario, impregnan las células y bloquear antes de la incubación, como se describe arriba.</li>
</ol> 3. Día 3: Incubación terciario <ol><li>después de la segunda incubación, lavar las secciones tres veces en PBS-H a 4 ° C durante al menos 20 min</li>
	<li>Realizar una incubación final con la correspondiente etiqueta fluorescente anticuerpos (por ejemplo, cabra anti-conejo conjugado amarillo verdoso, conjugados mucho rojo tinte de cabra anti-rata y cabra anti-ratón conjugado colorante verde anticuerpos diluido 1:5, 000, 1:5, 000 y 1:2, 000, respectivamente, en PBS-H-T/2% NGS). Incubar durante una noche. 
	Nota: en este punto, la incubación puede prolongarse hasta tres días si es necesario. Mantener las secciones protegidas de la luz envolviendo las placas en papel de aluminio durante este incupaso de bation y después de eso, como la luz apaga fluoróforos.</li>
</ol> 4. Día 4: Montaje de las secciones <ol><li>lavado las secciones tres veces en PBS-H por al menos 20 min 
	Nota: Si se planifica abajo ISH 19, fije las secciones en paraformaldehído al 4% durante 1 hora para asegurar los tetrámeros y anticuerpos en el lugar y luego lavar las secciones dos veces con PBS-H por 5 min. 
	PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; usar equipo de protección personal.</li>
	<li>Utilizar un pincel para transferir las secciones en un portaobjetos de microscopio. Tenga cuidado de no meter demasiado el tejido. Cubra cada sección con glicerol/gelatina que contenga 4 mg/mL n-propil galato u otro medio de montaje que contiene un conservante fluoróforo. Cubrir con un cubreobjetos.</li>
	<li>Guardar las diapositivas en un recipiente de deslizamiento protegido de la luz-20 º C. lavar las placas de cultivo de tejidos y eliminar las etiquetas de las tapas con alcohol. 
	Nota: Las placas se pueden reutilizar.</li>
</ol> 5. Adquisición de imágenes de Microscopio Confocal <ol><li>captura imágenes de alta resolución con un microscopio confocal, utilizando el láser adecuado y filtros para cada fluoróforo ( figura 1A y B). 
	Nota: En este ejemplo (véase la Tabla de materiales) utilizaron un microscopio confocal. Se obtuvieron imágenes utilizando el láser 561 al 20% de potencia para el verdoso amarillo marcado antígeno específicos de células T, el láser de 488 nm en el 10% de energía para las células B expresan CD20 marcado con verde y el láser de 640 nm en 15% de energía para las células T CD8 ahora marcado con rojo. Se utilizaron 20 X objetivo y una apertura numérica de 0.8.</li>
	<li>Recoger secuencialmente intervalos de la serie z a 3 μm (u otro) en los tres canales en los múltiples campos de 800 x 800 píxeles. Construir un montaje de los campos recogidos ( figura 1 -E). Nombre de cada imagen de montaje basado en la información de la diapositiva correspondiente y guardar para análisis.</li>
	<li>Realizar análisis cuantitativo de imagen utilizando el software de análisis y cuantificación de microscopio confocal respectivos o ImageJ.</li>
</ol> 6. Análisis de imagen cuantitativo Nota: Análisis de imagen cuantitativo pueden lograrse usando software de análisis y cuantificación de microscopio confocal o usando el software ImageJ. Aquí, ImageJ fue utilizado como ejemplo.
Montaje <ol><li>abierto un confocal arrastrándolo a la ventana de ImageJ ( figura 2A). 
	Nota: ImageJ puede abrir directamente montajes recopilados por muchos diferentes microscopios confocales. Si el montaje no puede ser abierto directamente por ImageJ, exportar el z-scan seleccionado como un archivo TIFF para abrir it</li>
	<li>Duplicar el seleccionado z-scan para el análisis (&#34; imagen &#34;-&#62; &#34; duplicados &#34;) ( figura 2B).</li>
	<li>Divide los diferentes canales (&#34; imagen &#34;-&#62; &#34; Color &#34;-&#62; &#34; Split canales &#34;) ( figura 2).</li>
	<li>Dibujar el ROI para el análisis cuantitativo en el canal correspondiente para ser objetivo y añadir al Gerente de ROI pulsando &#34; T &#34; en el teclado. Medir el área de. 
	Nota: El administrador de ROI de ImageJ muestra el área en el μm 2 ( Figura 2D).</li>
	<li>Ajustar el brillo de la fluorescencia y contraste del canal a ser analizados (&#34; imagen &#34;-&#62; &#34; ajuste &#34;-&#62; &#34; brillo/contraste &#34;) ( Figura 2E).</li>
	<li>Aplanar el ROI en la imagen (&#34; manager de ROI &#34;-&#62; &#34; aplane &#34;) ( figura 2F).</li>
	<li>Cuantificar las células positivas en la imagen usando el &#34; multipunto &#34; herramienta ( figura 2).</li>
</ol>

<ol><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+identify+peptide-specific+human+CD4%28%2B%29+T+cells+proliferating+in+response+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen.</a> J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Steinert, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+memory+CD8+T+cells+reveals+regionalization+of+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance.</a> Cell. 161 (4), 737-749 (2015).</li>
<li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li>
<li>Haanen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+virus-+and+tumor-specific+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity.</a> Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18432944">In situ tetramer staining using MHC class I tetramers.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li>
<li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HLA-DR%2A08032%2FE7+and+HLA-DR%2A0818%2FE7+tetramers+in+tracking+of+epitope-specific+CD4%2B+T+cells+in+active+and+convalescent+tuberculosis+patients+compared+with+control+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors.</a> Immunobiology. 216, 947-960 (2011).</li>
<li>Bischof, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+after+primary+and+secondary+challenge+using+MHC+class+II+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers.</a> J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+staining+with+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers+permits+detection+of+antigen-specific%2C+autoreactive+CD4+T+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ.</a> PLoS ONE. 9, e87519(2014).</li>
<li>Massilamany, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+autoreactive+CD4+T+cells+in+brain+and+heart+using+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers.</a> J Vis Exp. (90), e51679(2014).</li>
<li>Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Peptide-MHC-II+Tetramer+Staining+of+Antigen-Specific+CD4%2B+T+Cells+in+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0128862(2015).</li>
<li>Tjernlund, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Gag-specific+CD8%2B+cells+in+the+GI+tract+of+SIV+infected+Rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques.</a> Retrovirology. 7, 7-12 (2010).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTL+fail+to+accumulate+at+sites+of+HIV-1+replication+in+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue.</a> J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).</li>
<li>Hong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0004131">Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium.</a> PLoS ONE. 4 (1), e4131(2009).</li>
<li>Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+and+dynamics+of+the+immunodominant+CD8+T+cell+response+to+SIV%CE%94nef+immunization+and+SIVmac251+vaginal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81623(2013).</li>
<li>Connick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+simian+immunodeficiency+virus+replication+within+secondary+lymphoid+tissues+of+rhesus+macaques+is+linked+to+disease+stage+and+inversely+related+to+localization+of+virus-specific+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL.</a> J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcomes+in+early+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2009).</li>
<li>Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+simultaneously+visualize+virus-specific+CD8%2B+T+cells+and+virus-infected+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ.</a> J Vis Exp. (30), e1561(2009).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simian+immunodeficiency+virus-producing+cells+in+follicles+are+partially+suppressed+by+CD8%2B+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo.</a> J Virol. 90, 11168-11180 (2016).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+distribution+of+iNKT+cells+impacts+their+cytokine+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response.</a> Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).</li>
<li>Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Vibratome+and+Compresstome+sectioning+of+fresh+primate+lymphoid+and+genital+tissues+for+in+situ+MHC-tetramer+and+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining.</a> Biol Proced Online. 17, (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

IST combinado con IHC proporciona una herramienta esencial para detectar, caracterizar y cuantificar las células de T CD8 específica de antígeno en ambientes nativos con el contexto de otras células y estructuras del tejido. Aquí, describimos los procedimientos detallados para IST combinado con IHC, seguido por análisis de imagen cuantitativo, para determinar la localización, abundancia y fenotipo de las células de T CD8 específica de antígeno en nodos de linfa de macaques del macaco de la India. Coloración similar puede...

Las células T son esenciales para muchos procesos inmunológicos, incluyendo la detección y eliminación de células infectadas por virus, previniendo autoinmunidad, ayudando en la producción de células B y células plasmáticas de anticuerpos y detectar y eliminar las células cancerosas. El desarrollo del péptido/MHC clase I tetrámero tinción de antígenos específicos de las células T CD81 y el más reciente desarrollo de MHC clase II la tinción de tetrámero de T CD4 células2 por citometría de flujo revolucionó nuestra capacidad para estudiar y comprender la Inmunobiología de las células. Mientras que extremadamente es útil para determinar la cantidad y el fenotipo de las células T específicas de antígeno, citometría de flujo no permite la detección de la localización espacial de las células antígeno específicas a otras células y estructuras en los tejidos y actual técnicas de desagregación para extraer las células T necesitan para citometría de flujo han limitado eficacia en tejidos no linfoides3.
Nosotros y otros hemos desarrollado métodos cargados de péptido MHC de clase I y clase tetrámero II multimer reactivos o para teñir las células CD8 y CD4 T específica de antígeno en los tejidos4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST estos métodos permiten la determinación de la localización, abundancia y fenotipo de las células CD8 y CD4 T específica de antígeno en los tejidos y proporcionar un medio para la detección de estas células en comparación con otras células y estructuras en los tejidos. Nuestro grupo ha utilizado extensivamente la MHC-I tetrámero tinción para estudio de virus de inmunodeficiencia humana (VIH) - y virus de la inmunodeficiencia símica (VIS) - células T CD8 específicas en tejidos linfoides, genitales y rectales para obtener un entendimiento de la inmunopatogénesis del VIH y SIV e identificar correlatos de vacunación exitoso estrategias14,15,16,17. Además, también desarrollamos una técnica que combina IST con hibridación en situ (ISH) para localizar y cuantificar virus específicos de células T CD8 y células infectadas por virus en los tejidos y para determinar los niveles de efector a destino en vivo 18 , 19.
Aquí, describimos un protocolo usando cargado de péptido MHC-I tetrámeros para teñir las células de T CD8 específica de antígeno en secciones de tejido fresco, hasta tejidos de contratinción con IHC y cuantificar las células con fenotipos específicos en compartimientos de tejido específico. Estos procedimientos son los mismos que fueron utilizados en nuestra reciente publicación por Li et al., en el que se determinaron la localización, abundancia y fenotipo de células T específicas de la SIV en tejido linfoide durante la infección crónica de vis en macacos20.
Para este procedimiento, los tejidos frescos son seccionados y se incubó toda la noche con carga de péptido MHC-I tetrámeros conjugan con moléculas de tiocianato de fluoresceína (FITC). Luego están fijados en paraformaldehido. Después de fijar el tejido, la señal de los tetrámeros de MHC se amplifica usando conejo anti-FITC anticuerpos y se incubaron con fluorescente etiquetados anticuerpos de IgG de Anti-conejos que más amplifican la señal de los tetrámeros encuadernados. IHC se usa junto con IST para caracterizar antígenos específicos de células T y las células circundantes. En la incubación primaria con los tetrámeros se incluyen anticuerpos que reconocen epítopos en la superficie de las células o en el espacio extracelular. Anticuerpos que reconocen epítopos intracelulares requieren permeabilidad de la pared celular antes de la tinción. Las secciones de tejidos teñidos son imágenes con un microscopio confocal y analizan usando el software confocal. Las células marcadas se cuantifican mediante microscopía confocal software o ImageJ. El protocolo descrito se puede utilizar para manchar esencialmente cualquier célula T CD8 específica de antígeno en los tejidos para que MHC-I tetrámeros están disponibles.

<table><tbody><tr><td>Monómero MHC-I</td> Instalación <td></td> central de <td>tetrámeros de NIH</td><td>Materiales para la preparación de metrámeros MHC</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>Materiales para la preparación de tetrámeros MHC</td></tr><tr><td>Suero normal de cabra</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>SLBL6391V</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td>Gelatina de</tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>galato de n-propilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>Anticuerpo inestable, uso de un solo uso alícuota</td></tr> <tr>congelada<td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Vector</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>cabra-a-m-A488 (1:2.000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rb-Cy3 (1:5.000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>cabra-a-rata-Cy5 (1:5.000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Compresstomo: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Quick Set Adhesivo Instantáneo</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 24 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopio</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>Navaja de afeitar&nbsp; hoja Ted</td><td>Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí desechable de plumas</td><td>MAQUINILLA DE AFEITAR DE SEGURIDAD DE PLUMAS CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>Pincel redondo #2</td><td>PRINCETON ART & CEPILLO CO.</td><td>4350R</td><td>Puede recortar según sea necesario con la navaja de afeitar</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ la tinción de tetrámero de mhc y análisis cuantitativo para determinar la localización, abundancia y fenotipo de células de t cd8 específica de antígeno en los tejidos

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Las células T son esenciales para muchos procesos inmunológicos, incluyendo la detección y eliminación de células infectadas por virus, previniendo autoinmunidad, ayudando en la producción de células B y células plasmáticas de anticuerpos y detectar y eliminar las células cancerosas. El desarrollo de la tinción de tetrámero de MHC de las células antígeno específicas analizadas por citometría de flujo ha revolucionado nuestra capacidad para estudiar y comprender la Inmunobiología de las células. Mientras que extremadamente es útil para determinar la cantidad y el fenotipo de las células T específicas de antígeno, citometría de flujo no puede determinar la localización espacial de las células a otras células y estructuras de los tejidos y las técnicas actuales de desagregación específica de antígeno para extraer la T las células necesitan para citometría de flujo han limitado eficacia en tejidos no linfoides. In situ Tinción de MHC-tetrámero (IST) es una técnica para visualizar las células T que son específicas para antígenos de interés en los tejidos. En combinación con inmunohistoquímica (IHQ), IST puede determinar la abundancia, la ubicación y el fenotipo de las células CD8 y CD4 T específica de antígeno en los tejidos. Aquí, describimos un protocolo para manchar y para enumerar las células de T CD8 específica de antígeno, con fenotipos específicos ubicados dentro de compartimientos de tejido específico. Estos procedimientos son los mismos que utilizamos en nuestra reciente publicación por Li et al., titulado "las células productoras de Virus Simian de la inmunodeficiencia en los folículos se suprimen parcialmente por CD8 células+ en Vivo." Los métodos descritos son ampliamente aplicables ya que se pueden utilizar para localizar, fenotipo y cuantificar esencialmente cualquier célula T CD8 específica de antígeno para el cual tetrámeros de MHC están disponibles, en cualquier tejido.

La figura 1 muestra cómo recopilar imágenes confocales utilizando un microscopio confocal. Figura 2 muestra el análisis de imagen cuantitativo con ImageJ. Figuras 3 y 4 muestran a representante imágenes de tejidos del nodo de linfa de un SIV infectaron macaque del macaco de manchados de tetrámeros de MHC, CD8 anticuerpos y anticuerpos CD20 y sirven para demostrar la especificidad de la tinción de...

Aquí, describimos un método que combina en situ MHC tetramer tinción con inmunohistoquímica para determinar localización, fenotipo y cantidad de antígenos específicos de células T en los tejidos. Este protocolo se utiliza para determinar las características espaciales y fenotípicas de las células de T CD8 específica de antígeno con respecto a otro tipo de célula y las estructuras de los tejidos.

In Situ La tinción de tetrámero de MHC y análisis cuantitativo para determinar la localización, abundancia y fenotipo de células de T CD8 específica de antígeno en los tejidos

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar la ubicación, abundancia y fenotipo de las células T CD8 positivas específicas para un antígeno dentro de tejidos de interés. Este método ayuda a responder rápidamente preguntas sobre las células T CD8 al proporcionar un medio para localizar, cuantificar y caracterizar fenotípicamente prácticamente cualquier célula T CD8 específica para un antígeno en cualquier tejido. La principal ventaja de esta técnica es que permite determinar la distribución espacial de las células T CD8 positivas específicas para un antígeno en relación con otras células y estructuras dentro de los tejidos de interés.El procedimiento será demostrado por Gwantwa Mwakalundwa junto con Shengbin Li. En el día uno del procedimiento, utilice un escalpelo para cortar el tejido fresco en trozos de aproximadamente 0,5 x 0,5 centímetros. Aquí se muestra tejido de bazo de macaco rhesus.Encole por separado cada fragmento de tejido en el centro de la parte superior de un émbolo e incruste las muestras en tres a cinco mililitros de agarosa al 4 % de punto de fusión baja tibia en PBS. Etiquete los émbolos con la información correspondiente del tejido. A continuación, c

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este procedimiento muestra la purificación y la expansión in vitro de las células CD4 + antígeno específico de células T de sangre periférica y su visualización utilizando tetrámeros de MHC de clase II. Tetrámeros permitir la visualización directa de las células T con una especificidad de antígeno único y definido restricción MHC de clase II.

Visualización de antígeno específico de células T CD4 + con MHC de clase II tetrámeros

Una técnica que combina en la tinción de tetrámero situ e hibridación in situ (ISTH) permite la visualización, la cartografía y el análisis de la proximidad espacial de virus específicos de células T CD8 + a sus infectados por el virus objetivos y la determinación de las relaciones cuantitativas entre estos efectores inmunes y los objetivos a los resultados de la infección.

Una técnica para visualizar simultáneamente específica para el virus las células CD8 + T y células infectadas por virus In situ</em

Este protocolo describe el uso de péptido: MHC tetrámeros y microperlas magnéticas para aislar poblaciones de baja frecuencia de células T específicos para el epítopo y analizarlas por citometría de flujo. Este método permite el estudio directo de sus propias poblaciones de células T de interés...

Péptido: MHC tetrámero basado en el enriquecimiento de células T específicos para el epítopo

El protocolo para detectar células autorreactivas T CD4 en el cerebro y el corazón mediante tinción directa con complejo mayor de histocompatibilidad de clase II dextramers se ha descrito en el presente informe. Para el análisis integral, un método fiable para enumerar las frecuencias de células T CD4 + específicas de antígeno in situ también se ideó.

La detección in situ de las células T CD4 Autoreactive en Cerebro y Corazón Uso Mayor de Histocompatibilidad clase II Dextramers

Describimos técnicas basadas en imágenes de animales enteros y citometría de flujo para monitorear la expansión de las células T CD8+ específicas de antígeno en respuesta a la inmunización con nanopartículas en un modelo murino de vacunación.

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

A continuación, presentamos un protocolo optimizado para enumerar y caracterizar las células T CD8 + macaco rhesus contra el virus del SIDA. Este artículo es útil no sólo para el campo de la inmunología del VIH, sino que también a otras áreas de la investigación biomédica donde se sabe que las respuestas de células T CD8 + para afectar el resultado de la enfermedad.

Análisis de Inmunodeficiencia CD8 Simian Virus-específica + Células T en macacos rhesus por el péptido-MHC-I de tetrámeros La tinción

Estudio de microambiente tumoral puede identificar biomarcadores pronósticos o predictivos de la respuesta clínica a la inmunoterapia. Presentado aquí, es un método innovador basado en situ de la fluorescencia multiespectral de imágenes para analizar y contar automáticamente varias subpoblaciones de CD8+ T las células. Esta técnica reproducible y confiable es adecuada para análisis de grandes cohortes.

Multiplexado de análisis de la inmunofluorescencia y la cuantificación de Intratumoral PD-1+ + de Tim-3 CD8 células+ T

Aquí, presentamos un protocolo para el ex vivo cualitativamente específica de antígeno CD8+ T las células. Análisis es posible con suspensiones de la célula de órganos o de pequeñas cantidades de sangre. Una amplia gama de estudios requieren el análisis de las respuestas de la célula de T citotóxica (vacunación y estudios de inmunoterapia del cáncer).

Cuantificación simultánea de CD8 anti-vector y Anti-transgénicos-específico+ T células vía MHC Tetramer tinción después de la vacunación con un Vector Viral

Este protocolo describe el uso de la única cadena MHC de clase I complejos para investigar las interacciones moleculares en la activación de células T CD8 + humana: generación de ingeniería antígeno que presenta las células que expresan la cadena sola construye, cultura del clon humano de células T CD8 + y experimentos de activación de la célula de T.

Uso de la única cadena MHC tecnología investigar Co-agonismo humano CD8 + activación de células T

En este artículo, se describe un protocolo para la inmunofluorescencia múltiple (mIF) de amplificación manual de señal de tiramida (TSA) combinada con análisis de imágenes y análisis espacial. Este protocolo se puede utilizar con secciones fijadas en parafina con formalina (FFPE) para la tinción de dos a seis antígenos por portaobjetos, dependiendo del escáner de portaobjetos disponible en el laboratorio.

Inmunofluorescencia múltiple combinada con análisis de imágenes espaciales para la evaluación clínica y biológica del microambiente tumoral

Este protocolo detalla una metodología para la detección de ARNm multiplex con citometría de masas de imágenes de proteínas en secciones de tejido incluidas en parafina fijadas en formalina.

Cartografía molecular de doble modalidad: integración de la detección de ARNm multiplex con citometría de masas de imágenes de proteínas

Aprende a realizar tinción de tetrámeros MHC in situ e inmunohistoquímica para analizar células T CD8 específicas de antígeno en tejidos. Este método permite determinar su localización, abundancia y fenotipo.

In Situ La tinción de tetrámero de MHC y análisis cuantitativo para determinar la localización, abundancia y fenotipo de células de T CD8 específica de antígeno en los tejidos (Video) | JoVE Journal

In Situ La tinción de tetrámero de MHC y análisis cuantitativo para determinar la localización, abundancia y fenotipo de células de T CD8 específica de antígeno en los tejidos

Explorar más videos