In Situ La tinción de tetrámero de MHC y análisis cuantitativo para determinar la localización, abundancia y fenotipo de células de T CD8 específica de antígeno en los tejidos

El objetivo general de este procedimiento es determinar la ubicación, la abundancia y el fenotipo de las células T CD8 positivas para antígenos específicos dentro de los tejidos de interés. Este método ayuda a responder preguntas rápidas sobre las células T CD8 al proporcionar un medio para localizar, cuantificar y fenotipar prácticamente cualquier célula T CD8 específica de antígeno y cualquier tejido. La principal ventaja de esta técnica es que permite determinar la distribución espacial de los linfocitos T CD8 positivos para antígenos específicos en relación con otras células y estructuras dentro de los tejidos de interés.

Demostrando el procedimiento con Shengbin Li estará Gwantwa Mwakalundwa. El primer día del procedimiento, use un bisturí para cortar el tejido fresco en trozos de aproximadamente 0,5 x 0,5 centímetros. Aquí, se muestra el tejido del bazo del macaco rhesus.

Pegue por separado cada fragmento de tejido en el centro de la parte superior de un émbolo e incruste las muestras en tres a cinco mililitros de agarosa tibia al 4% de bajo punto de fusión en PBS. Etiquete los émbolos con la información relevante del tejido. Luego, coloque las muestras en un soporte refrigerado en una cubeta de hielo.

Cuando el agar se haya solidificado, encienda el micrótomo y establezca el ajuste de espesor en 200 micrómetros. Después de instalar una nueva cuchilla de afeitar, inserte los émbolos en el baño del micrótomo. Llene el baño del micrótomo con 100 a 200 mililitros de PBS-H recién preparado y agregue cubitos de hielo de PBS-H para mantener la temperatura entre cero y dos grados centígrados.

Después de obtener secciones de 200 micrómetros, use un pincel para eliminar el agar que rodea cada sección y transfiera las muestras a cámaras de tejido individuales dentro de pocillos individuales de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos que contiene un mililitro de PBS-H refrigerado. Cuando se hayan adquirido todas las muestras, incubar las secciones de tejido durante la noche en un mililitro de tetrámeros MHC de clase uno cargados con péptidos conjugados fit, diluidos en PBS-H suplementado con suero de cabra normal al 2% a cuatro grados centígrados con balanceo. A la mañana siguiente, transfiera cada cámara de tejido a pocillos individuales de una nueva placa de 24 pocillos que contenga un mililitro de PBS-H fresco enfriado durante 20 minutos.

Después del segundo lavado, fije las secciones en un mililitro de paraformaldehído fresco al 4% durante dos horas a temperatura ambiente. Seguido de dos lavados de cinco minutos en PBS-H frío. Transfiera las secciones a una nueva placa de 24 pocillos que contenga urea 0.01 molar y cocine las secciones en el microondas tres veces durante unos 10 segundos cada vez hasta que la urea hierva.

Para permeabilizar y bloquear las muestras, incubar las secciones en una solución de bloqueo que contenga PBS-H suplementada con un detergente al 0,3% de triton x100 y un suero de cabra normal al 2% en un balancín durante una hora, a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, transfiera las cámaras de tejido a pocillos individuales de una nueva placa de 24 pocillos que contenga un mililitro de solución que contenga anticuerpo anti-fitc de conejo, anticuerpo CD antihumano de ratón y anticuerpo CD3 antihumano de rata. Incubar las muestras durante la noche a cuatro grados centígrados con balanceo.

Al tercer día, lavar las secciones tres veces en PBS-H fresco a cuatro grados centígrados durante al menos 20 minutos por lavado y realizar una incubación final con los anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia adecuados durante un máximo de tres días, protegidos de la luz. Al final de la incubación terciaria de anticuerpos, enjuague las muestras con tres lavados de 20 minutos en PBS-H fresco y use un pincel para transferir las muestras de cada cámara de tejido a un portaobjetos de microscopio de vidrio. Cubra cada sección con medio de montaje complementado con un conservante de fluoróforo y cubra las muestras con un cubreobjetos.

Luego, guarde los portaobjetos en un recipiente con portaobjetos protegido de la luz, a 20 grados centígrados. El día de la toma de imágenes, coloque el primer portaobjetos en la platina de un microscopio confocal y seleccione los láseres y filtros adecuados para cada fluoróforo utilizado para etiquetar la muestra de tejido. Utilizando el objetivo 20x, obtenga secuencialmente una serie z a intervalos de tres micras en cada uno de los canales de fluoróforo, en múltiples campos de 800 x 800 píxeles.

A continuación, construya un montaje de los campos recopilados y guarde cada imagen de montaje con un nombre basado en la muestra de tejido correspondiente. En estas imágenes representativas, una sección teñida con tetrámeros MHC de clase uno cargados con un péptido SIV se compara con una sección del mismo tejido, teñida con tetrámeros MHC clase uno cargados con un péptido irrelevante, lo que demuestra la especificidad de la tinción tetrámera. En estas imágenes, las células T específicas del virus teñidas con tetrámero MHC de clase uno cargado con péptido SIV, se unen para CD8, un marcador de subconjunto de células T, pero no para CD20, una proteína de la superficie celular expresada en las células B.

Este montaje fue creado para múltiples campos confocales de la serie z, que se utilizaron para la cuantificación de células teñidas con tetrámeros con fenotipos específicos y diferentes compartimentos anatómicos en el ganglio linfático. Esta imagen ampliada resalta un área del ganglio linfático de montaje que contiene un folículo de células B delineado por tinción IGM. Las células tetrámeras MHC de clase uno, algunas de las cuales coexpresaron el marcador de activación y proliferación de células T, KI67, se pueden detectar dentro y fuera del folículo de células B.

Esta combinación de tinción permite determinar los estados de activación y proliferación de los linfocitos T CD8 positivos específicos para el VIS, así como su localización dentro de los tejidos linfoides secundarios. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en aproximadamente cinco días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el tejido fresco es fundamental para una tinción exitosa.

Procese las muestras dentro de las 24 horas o menos después de la cosecha, manteniéndolas frías hasta la fijación. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar una tinción de tetrámeros e inmunohistoquímica para determinar la ubicación, la abundancia y el fenotipo de las células T CD8 positivas para antígenos específicos en los tejidos de interés. No olvide que trabajar con agentes infecciosos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones para prevenir la exposición, como usar el equipo de protección personal adecuado y limitar el uso de objetos punzocortantes, mientras se realiza este procedimiento.