Protocolo de laboratorio para análisis genéticos de contenido intestinal de macroinvertebrados acuáticos con grupo-específica rDNA cartillas

El objetivo general de este protocolo es mejorar las investigaciones de la ecología trófica, especialmente a partir de muestras de campo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ecología de la red alimentaria, como el impacto de las especies invasoras en las interacciones tróficas. La principal ventaja es la aplicación adicional a más tiempo integrando análisis tróficos para exactamente los mismos especímenes y que puede ser aplicado por prácticamente todos los ecólogos.

Aunque establecimos este enfoque para proporcionar información sobre el consumo de presas de los consumidores acuáticos, también se puede aplicar para otros fines, por ejemplo, para determinar la composición de especies dentro de muestras de macroinvertebrados bentónicos. La demostración del procedimiento correrá a cargo de Christian Sodemann, técnico de nuestro laboratorio. Para comenzar este experimento, transfiera el tracto gastrointestinal del depredador previamente diseccionado a un tubo de reacción de bloqueo seguro de dos mililitros que contenga 440 microlitros de tampón de extracción de sal.

Congele inmediatamente las muestras a menos 20 grados centígrados hasta la extracción del ADN. Después de sacar las muestras del congelador, comience la extracción de ADN usando fórceps para agregar una cuenta de acero inoxidable de cinco mililitros a cada tubo de muestra y luego deje las muestras en el banco a temperatura ambiente para que se descongelen. Con un molino de bolas, homogeneice las muestras durante un minuto a 15 hercios.

Después de centrifugar las muestras brevemente, agregue 90 microlitros de 10% SDS y cinco microlitros de 10 miligramos por mililitro de proteinasa K a las muestras. A continuación, vórtice completamente las muestras e incubarlas a 60 grados centígrados con agitación constante a 400 rpm en un ThermoMixer durante una hora. Para promover aún más la lisis, agite las muestras en vórtice cada 10 minutos durante esta incubación.

Después de un breve centrifugado, pipetee 350 microlitros de cloruro de sodio cinco molares en las muestras. Agite el vórtice durante 30 segundos a un minuto para mezclar completamente las muestras. Luego, centrifugar a 16, 200 veces g a cinco grados centígrados durante 40 minutos.

Por lo tanto, una de las cosas más críticas al sacar las muestras de la centrífuga es evitar que las perlas se muevan y perturben el pellet que contiene todas las partículas que deben eliminarse mediante el paso. A continuación, transfiera con cuidado aproximadamente 600 microlitros de sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros, asegurándose de no alterar el pellet. Agregue 600 microlitros de isopropanol helado e invierta con cuidado el tubo unas cuantas veces.

Almacene a menos 20 grados centígrados durante la noche. Después de sacar las muestras del congelador, centrifugarlas a 16, 200 veces g a temperatura ambiente durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante asegurándose de no perder la bolita, y use un pañuelo de papel para secar cuidadosamente el tubo.

Lave estos gránulos que contienen ADN agregando 200 microlitros de etanol helado al 70% y luego centrifugando a 16, 200 veces g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante con precaución y use papel de seda sin pelusa para secar cuidadosamente el tubo. Finalmente, utilizando una pipeta de 10 microlitros ajustada a ocho microlitros, retire con cuidado el sobrenadante restante, asegurándose de no alterar el pellet.

Seque el pellet hasta que se evapore todo el etanol. Luego agregue de 50 a 100 microlitros de agua sin nucleasa, vórtice brevemente y déjelo a cuatro grados centígrados durante la noche para que disuelva el pellet. Para verificar la eficiencia funcional de las muestras de ADN extraídas aquí, pruebe cada una de ellas mediante PCR, utilizando juegos de cebadores universales adecuados para la fuente de alimento respectiva.

Comience agregando cebadores, mezcla de dNTP, tampón de reacción, ADN polimerasa Taq y agua purificada en un tubo de reacción de 1,5 o 2,5 mililitros y vórtice la mezcla de reacción estándar. Ahora, para cada muestra de ADN, transfiera un microlitro del extracto de ADN correspondiente a nueve microlitros de la mezcla de reacción estándar dentro de una placa de PCR. Cierre la placa, colóquela en el termociclador e inicie el programa de PCR.

Una vez finalizada la reacción de PCR, utilice una opción de tirada corta de una mini centrífuga para centrifugar los productos de PCR. A continuación, mezcle tres microlitros de cada producto PCR con un microlitro de seis veces el colorante de carga. Cargue estas muestras en ranuras de gel de un gel de agarosa previamente preparado.

Cargue 1,5 microlitros de una escalera de ADN de 100 pares de bases en una ranura del gel como estándar de tamaño. Cierre la tapa de la unidad de electroforesis, conéctela a una fuente de alimentación y haga funcionar el gel a 100 voltios por centímetro durante 35 minutos. Después de la ejecución de la electroforesis, retire el gel y colóquelo en un baño de tinción previamente preparado durante aproximadamente 10 minutos.

Finalmente, retire el gel del baño de tinción y colóquelo en un sistema de documentación de gel, y visualícelo de acuerdo con el manual. Para analizar el contenido intestinal de los depredadores, utilice soluciones de trabajo previamente preparadas de extracto de ADN. Realice reacciones de PCR separadas para cada uno de los 16 conjuntos de cebadores específicos del grupo de presas.

Incluya un control positivo con ADN de un espécimen perteneciente al grupo de presas respectivo y un control negativo con ADN de la especie depredadora. Es crucial documentar exactamente la asignación de muestras dentro de cada placa de PCR para evitar agrupar diferentes muestras mientras se cargan en una placa de secuenciación para la detección de un secuenciador de asignación y, en última instancia, asignar los resultados incorrectos a un consumidor individual. A continuación, ejecute las reacciones de PCR utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente, ajustado a la temperatura de recocido específica y al número de ciclo para cada juego de cebadores utilizado.

Para detectar los fragmentos amplificados en estas reacciones de PCR, ejecute análisis de fragmentos automatizados en dos lotes, A y B. Prepare una mezcla que contenga solución de carga de muestra, o SLS, y el estándar de tamaño respectivo para cada lote. A continuación, descongele los productos de PCR previamente congelados de las ocho reacciones de PCR pertenecientes al lote respectivo, asegurándose de que se mantengan en la oscuridad. Use una opción de tirada corta de una mini centrífuga para reducirlos.

En una placa de secuenciación, cargue el número de pocillos correspondiente al número de muestras a analizar con 22 microlitros de la mezcla estándar de tamaño SLS respectiva para cada muestra. A continuación, cargue un microlitro de producto de PCR de cada una de las ocho reacciones de PCR en los pocillos respectivos de la placa. A continuación, use una opción de tirada corta de una mini centrífuga de placa para centrifugar cuidadosamente esta mezcla.

Después de eso, cubra cada pozo con una gota de aceite mineral. A continuación, llene los pocillos de reacción de una placa tampón con 250 a 300 microlitros de tampón de separación de ADN. Utilice el software del secuenciador capilar para crear una configuración de muestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Asegúrese de que la asignación de muestras dentro de la configuración de muestras coincida con la asignación de muestras en la placa de secuenciación y que la configuración de muestras contenga el método adecuado para procesar el lote respectivo. Al analizar los resultados, es importante volver a comprobar visualmente el electroferograma de cada muestra y confirmar/desconfirmar cada pico llamado para cada conjunto de cebadores marcadores por separado e insertar picos no llamados que se ajusten a los criterios de un conjunto de cebadores marcadores manualmente o eliminar los incorrectos. Después de realizar experimentos de alimentación para determinar la efectividad de los conjuntos de cebadores específicos del grupo establecidos para los análisis de PCR realizados en este protocolo, los resultados de la PCR utilizando ADN del tracto gastrointestinal del depredador se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa, así como polimorfismo de conformación de cadena simple, o SSCP.

La electroforesis en gel de agarosa reveló bandas individuales de ADN bicatenario, que no pudieron distinguirse entre las diferentes especies de presas estudiadas. Por el contrario, la electroforesis SSCP logró distinguir entre las diferentes especies de presas comparando las muestras de contenido intestinal con las muestras de referencia. El ADN extraído del intestino del ácaro de agua después del experimento de alimentación se secuenció en diferentes períodos de tiempo después del consumo de presas.

De una a 50 horas después de la alimentación, las cantidades relativas de ADN de presa detectadas se redujeron significativamente. El ADN extraído del anfípodo invasor, Dikerogammarus villosus gut, se analizó para detectar el ADN de presas de macroinvertebrados utilizando 16 conjuntos de cebadores específicos de grupo descritos en este protocolo. Solo el 16% del contenido intestinal de D. villosus fue positivo para el ADN perteneciente a cualquiera de los 16 taxones de presas objetivo.

Además, se encontró ADN de 12 taxones de presas analizados en al menos una muestra, mientras que nunca se detectó ADN de cuatro taxones. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los cebadores utilizados son específicos para los taxones dentro de su sistema. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ampliar su investigación sobre las interacciones tróficas complementando los métodos utilizados habitualmente en su laboratorio con análisis genéticos.