Name: Protocolo de laboratorio para análisis genéticos de contenido intestinal de macroinvertebrados acuáticos con grupo-específica rDNA cartillas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-05T12:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprende métodos genéticos para identificar presas en macroinvertebrados acuáticos mediante análisis de ADN de tractos gastrointestinales. Esta técnica mejora estudios de ecología trófica y redes alimentarias.

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Agradecemos a Silke Classen del Instituto de investigación para el análisis de ecosistemas y evaluación (gaiac), RWTH Aquisgrán para su asistencia en el establecimiento de los conjuntos de primer grupo específico utilizado en el presente Protocolo. También agradecemos a Peter Martin y Laura Schynawa de la Universidad de Kiel para la colaboración en los experimentos de los ácaros de agua. También agradecemos a los asistentes de laboratorio técnico para mantenimiento de laboratorio funcionando sin problemas y preparar el registro de empresas y números de catálogo. Este trabajo fue financiado por la Fundación de investigación alemana (DFG; proyecto GE 2219/3-1).

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, presentamos un método fácil y costo-eficiente para la polimerización en cadena-basado determinación de interacciones depredador-presa de muestras de campo a través de cartillas de Grupo-específicas para las regiones de ADNr, que pueden combinarse con otros análisis no moleculares de las mismas muestras. Sin embargo, hay varios pasos críticos dentro del protocolo. En primer lugar, es esencial asegurar la especificidad de los cebadores utilizados. En segundo lugar, es crucial para evitar la contaminación y pérdida de...

Las interacciones depredador-presa, que constituyen la mayoría de las interacciones tróficas y dinámica trófica, son aspectos claves para caracterizar los flujos de materia y energía a través de redes tróficas dentro y entre ecosistemas, que es uno de los principales objetivos de la ecología 1. la determinación de la fuente y el flujo de carbono y nutrientes es promover la comprensión de la conectividad ecológica entre los ecosistemas2. Sin embargo, los ecosistemas, tales como ríos y sus cuencas, no están ligados sólo por flujos de materia orgánica y nutrientes sino también por los movimientos de los organismos3. Así, alteraciones de hábitat interrumpiendo el flujo de recursos que los sistemas pueden fuertemente alterar las redes tróficas de ambos ecosistemas, no sólo directamente sino también indirectamente cambiando la composición respectiva de las comunidades de depredador-presa. Por ejemplo, cambios de redes tróficas han demostrado para ser ligado a los movimientos de depredador solo especies (e.g., trucha arco iris)4. Tales cambios potencialmente amenazan la biodiversidad y el funcionamiento de los ecosistemas acuáticos. Por lo tanto, analizando las interacciones depredador-presa en el campo es esencial para determinar el impacto de los cambios ambientales inducidos por humanos, como prácticas de manejo de agua, en la biodiversidad nativa de los ecosistemas acuáticos.
Puesto que el seguimiento de los vínculos tróficos es difícil en sistemas complejos, varios acercamientos se han establecido que permiten la evaluación de la alimentación de las interacciones en el campo5. Tradicionalmente, las investigaciones de interacciones en el campo de la alimentación se basan en la identificación visual de los restos de la presa en intestinos disecados y requieren un amplio conocimiento acerca de la diversidad morfológica de la presa. Análisis de contenido de Visual intestino han proporcionado penetraciones en el uso de los recursos de varios grupos de consumidores (por ejemplo, variación estacional en la dieta de langosta pescado de6 y7,8 o alimentación preferencias de copépodos). Sin embargo, el proceso físico de digestión dificulta el análisis de contenido de visual intestino y generalmente falta presa-organismos con cuerpo blando9. Para la alimentación de las especies por ingestión de líquido o para algunos consumidores invertebrados que intensivo dilacerar su comida antes de la ingestión, como anfípodos, identificación visual de especies de presas en contenido estomacal es imposible10. Debido a estas limitaciones, el análisis molecular ofrece una alternativa prometedora.
Los análisis moleculares se han convertido en una herramienta común que permiten la detección de la presa rápida y precisa en el contenido estomacal. La gama de tales técnicas es diversa: estrategias basadas en anticuerpos monoclonales o reacciones en cadena de polimerasa (polimerización en cadena) se utilizan a menudo, debido a su alta especificidad y sensibilidad11. El desarrollo de nuevos anticuerpos monoclonales es intensivo en tiempo y costo, por lo tanto, la aplicación de otras técnicas moleculares es más útil cuando los anticuerpos ya no existen11. Otro método común es la amplificación de regiones del ácido desoxirribonucleico (ADN), como el ácido ribonucleico ribosomal (ARN) genes presentes en la mayoría de las especies, usando la cartilla universal establece12,13. Cuando se utiliza esta técnica, a menudo no es posible identificar toda la gama de organismos presa dentro de fuentes mixtas de ADN14. Un enfoque eficaz para evitar tal inconveniente es usar primer grupo-específicas para el análisis de contenido intestinal genéticos. Diseñado para amplificar sólo regiones de ADN de grupos particulares y excluyen otras especies15,16, cebadores específicos de Grupo permiten la identificación de organismos presa en el nivel taxonómico de los grupos especificados sin análisis secundario de tiempo y costosa. Sin embargo, como todo análisis de contenido de la tripa, tales análisis proporcionan sólo una instantánea del comportamiento alimentario. Por lo tanto, la combinación de análisis de contenido intestinal molecular con análisis de marcadores naturales integración de tiempo (por ejemplo, los isótopos estables) se considera beneficioso1,2.
Aquí, describimos un método detallado para las investigaciones basadas en la PCR de las interacciones depredador-presa utilizando conjuntos de primer grupo-específicas para las regiones de ADN (ADNr) ribosomales nucleares para ser combinado con análisis de isótopos estables de la misma muestra. Describimos la detección de ADN de grupos de presas solo mediante electroforesis en gel de agarosa. Además, se presenta una oportunidad para mayores posteriores análisis de productos PCR de tales cartillas de Grupo-específicas aplicables siempre que se requiera una mayor resolución taxonómica que la especificidad de los cebadores. Porque la sola DNA trenzada (ssDNA) fragmentos de conformaciones terciaria de forma que se determinaron por su secuencia primaria17, pequeñas variaciones en los fragmentos amplificados por tales cebadores específicos de grupo conducen a cambios conformacionales. Estos cambios pueden detectarse por análisis de polimorfismo (SSCP) conformación de cadena única con geles de poliacrilamida17,18, lo que permite una identificación más precisa de organismos presa (hasta el nivel de especie).
Mientras que la electroforesis en gel de agarosa es una herramienta común y barata para visualizar fragmentos de ADN y determinar su longitud aproximada19, la resolución depende de la cantidad de ADN y el tinción colorante usado20. Por lo general, la visualización es sencillo cuando se trabaja con muestras de ADN puras, pero potencialmente bajas cantidades de presas DNA en el contenido estomacal de los consumidores puede complicar el marcador de resultados de electroforesis de gel de agarosa. Todavía, este método de detección es factible para detectar un bajo número de muestras al consumidor desde el campo uno o presa de algunos grupos, pero complicación en el marcador hace que la proyección de un gran número de muestras por múltiples presas taxones extremadamente tiempo intensivo y así impracticable. Un método de detección más sensible es el análisis automatizado de fragmentos por electroforesis capilar, que además permite la determinación de la longitud exacta de fragmentos21. Varios microsatélites en estudios han demostrado que mediante el uso de diferentes tintes fluorescentes como las etiquetas, es posible detectar y determinar diferentes fragmentos de longitud comparable por fragmento automatizado análisis22,23, 24. Por lo tanto, también presentamos un protocolo detallado para paralelo detección de ADN de presas múltiples grupos mediante PCR con conjuntos de etiquetado específico de grupo primer y detección mediante análisis del fragmento automatizado con un secuenciador automatizado. Además, presentamos los resultados de un estudio de caso que demuestra que la detección del ADN de la presa mediante el análisis del fragmento automatizado es un enfoque que también permite una cuantificación relativa de la presa ingerida.

<table><tbody><tr><td>nitrógeno líquido</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td>Para el transporte de muestras de campo de macroinvertebrados al laboratorio.</td></tr><tr><td>Tubos de reacción de 1,5 ml - Safelock</td><td>Any</td><td>NA</td><td>Para la recolección de muestras de consumo en el campo y su posterior conservación en nitrógeno líquido, los tubos de reacción no necesitan estar necesariamente limpios por PCR. Para evitar la explosión de los tubos, la tapa de los tubos debe perforarse con una aguja.</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td>Asegúrese de que el aumento sea adecuado para preparar el tracto gastrointestinal del tamaño del consumidor de interés.</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td>Para diseccionar el tracto gastrointestinal de especímenes de consumo bajo el estereomikroscopio.</td></tr><tr><td>Fórceps de acero inoxidable: pinza Dumont n.º 7</td><td>Bioform</td><td>B40d</td><td>Esta pinza curvada de acero inoxidable a veces puede ser muy útil para sujetar la muestra fija entre la parte curva sin perforar el tracto gastrointestinal.</td></tr><tr><td>Fórceps de acero inoxidable: Pinza Dumont Electronic Nº 5</td><td>Bioform</td><td>B40b</td><td>Esta fina pinza de acero inoxidable es ideal para la preparación del tracto gastrointestinal de muestras de consumo.</td></tr><tr><td>DNA-ExitusPlus</td><td>AppliChem</td><td>A7409,1000RF</td><td>Solución de descontaminación para la eliminación de contaminaciones de ADN y ARN</td></tr><tr><td>Toalla de papel sin pelusa</td><td>Cualquier</td><td></td> báscula de laboratorio NA <td></td></tr><tr><td>Cualquier</td><td></td><td>precisión</td> NA <td>debe ser de al menos 0,01 g.</td></tr><tr><td>Pipetas de microlitros (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 &mu; L)</td><td>Cualquier</td> tubo <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 2.0 ml</td><td>VWR</td><td>211-2165</td><td>¡Es crucial que estos tubos de reacción estén libres de ADN, DNasa, RNasa e inhibidores de PCR (PCR clean)!</td></tr><tr><td>Tubos Safe-Lock 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>211-2164</td><td>¡Es crucial que estos tubos de reacción estén libres de ADN, DNasa, RNasa e inhibidores de PCR (PCR clean)!</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio &ge; 99.5%, p.a., ACS, ISO</td><td>carlroth</td><td>3957.3</td><td>Para tampón de extracción de sal (SEB) y solución de NaCl 5M necesarios para la extracción de ADN.</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)-aminometano Tris</td><td>carlroth</td><td>4855.2</td><td>Para tampón de extracción de sal (SEB) y tampón TBE</td></tr><tr><td>Pipetas de microlitros (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 &mu; L)</td><td>carlroth</td><td>8043.1</td><td>Para tampón de extracción de sal (SEB) y tampón TBE</td></tr><tr><td>Ácido bórico &ge; 99,8 %, p.a., ACS, ISO</td><td>carlroth</td><td>6943.2</td><td>Para tampón TBE. No es necesario si se obtiene un tampón TBE disponible en el mercado.</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>carlroth</td><td>4360.1</td><td>Para la extracción de ADN</td></tr><tr><td>proteinasa K liofilo.</td><td>carlroth</td><td>7528.1</td><td>Prepare una solución de trabajo que contenga 10 mg/ml.</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Quiagen</td><td>85300</td><td>Molino de bolas para la homogeneización de las muestras.</td></tr><tr><td>Perlas de acero inoxidable, 5 mm</td><td>Quiagen</td><td>69989</td><td>Para la homogeneización de muestras.</td></tr><tr><td>Termoagitador de calefacción</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada: himac CT 15 RE</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td>Centrífuga refrigerada utilizada para la centrifugación durante la extracción de ADN (Protocolo 1).</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>carlroth</td><td>6752.5</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99.8 %, p.a.</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>agua de NA Agua de biología molecular (ddH2O)</td><td>AppliChem</td><td>A7398,1000</td><td>agua libre de nucleasas (esterilizada por corriente y tratada con DPC) utilizada para la resuspensión de ADN y siempre que se haga referencia a ddH2O dentro del manuscrito</td></tr><tr><td>Olegonucleótidos no modificados</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>NA</td><td>Primers sin etiquetar</td></tr><tr><td>Olegonucleótidos modificados</td><td>Metabion International AG</td><td>NA</td><td>Imprimaciones con la etiqueta</td></tr><tr><td>peqGOLD Taq todo incluido</td><td>VWR Peqlab</td><td>01-1000</td><td>Taq todo incluido para mezclas de reacción PCR (tampón de reacción Y y S, dNTPs y MgCl2)</td></tr><tr><td>Termociclador de gradiente avanzado Primus 96 o peqStar96x Universal Gradient</td><td>Peqlab</td><td>NA</td><td>Los juegos de cebadores se establecieron originalmente en un termociclador de gradiente avanzado Primus 96. Como este ciclador era bastante antiguo, comprobamos si nuestros juegos de cebadores eran eficientes y específicos en las mismas condiciones utilizando el peqSta96x (que también podía simular el modelo anterior). Sin embargo, las pruebas demostraron que nuestros cebadores funcionan bien y siguen siendo específicos (véase Koester et al. 2013) sin utilizar la simulación de la máquina antigua.</td></tr><tr><td>Placas de PCR estándar de 96 pocillos</td><td>VWR Peqlab</td><td>732-2879</td><td>utilizadas para reacciones de PCR.</td></tr><tr><td>Tiras de tubo de perfil bajo de 0,15 ml con tiras de tapa plana</td><td>VWR Peqlab</td><td>732-3223</td><td>Tiras de tapa utilizadas para cerrar las placas de PCR.</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td>Se utiliza para la electroforesis en gel.</td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Matraz cónico</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de medición</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de electroforesis horizontal y sus respectivos peines con dientes</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td>Para electroforesis en gel de agarosa.</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación para electroforesis PS3002</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Solución de bromuro de etidio 1 %</td><td>carlroth</td><td>2218.1</td><td>Se utiliza para preparar un baño de tinción para geles de agarosa.</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>carlroth</td><td>6749.1</td><td>Necesario para el tampón de desnaturalización para análisis SSCP.</td></tr><tr><td>Azul de bromphenol</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td>Necesario para la carga de colorante para la electroforesis en gel de agarosa.</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>carlroth</td><td>4621.1</td><td>Necesaria para el colorante de carga para la electroforesis en gel de agarosa.</td></tr><tr><td>100 bp-DNA-Escalera extendida</td><td>carlroth</td><td>T835.1</td><td>Como tamaño estándar para la electroforesis en gel de agarosa.</td></tr><tr><td>Sistema de documentación UV</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td>Para visualizar los resultados de la electroforesis en gel.</td></tr><tr><td>Rotiphorese NF-Acrilamida/Bis-solución 40 % (29:1)</td><td>carlroth</td><td>A121.1</td><td>Para la preparación de geles de poliacrílamida.</td></tr><tr><td>Peroxidisulfato de amonio</td><td>carlroth</td><td>9592.2</td><td>Para la preparación de geles de poliacrílamida.</td></tr><tr><td>clips plegables (32 mm)</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td>Para la preparación de geles de poliacrílamida.</td></tr><tr><td>caja de plástico de forma cuadrada (21 &veces; 6,5 veces; 5 cm)</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td>Para la preparación de geles de poliacrílamida.</td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>carlroth</td><td>23.67.1</td><td>Para la preparación de geles de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RC 10 Enfriador digital</td><td>VWR</td><td>462-0138</td><td>Para análisis SSCP mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Unidad de electroforesis vertical P10DS (OWL Separation Systems)</td><td>VWR</td><td>700-2361</td><td>Para análisis SSCP con electroforesis en gel de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Placa de vidrio con muescas</td><td>VWR</td><td>730-0261</td><td>Para análisis SSCP con electroforesis en gel de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Placa de vidrio en bruto</td><td>VWR</td><td>730-0260</td><td>Para análisis SSCP mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Espaciadores</td><td>VWR</td><td>730-0262</td><td>Para análisis SSCP mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Peine de 25 dientes</td><td>VWR</td><td>730-0294</td><td>Para análisis SSCP con electroforesis en gel de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Plataforma de agitación</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td>Para la agitación constante del baño de tinción.</td></tr><tr><td>Tinción de ácido nucleico GelStar (Lonza Rockland, Inc.)</td><td>Biozym</td><td>850535 (50535)</td><td>Para la tinción de geles de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp</td><td>AB Sciex</td><td>608098</td><td>Para análisis automatizados de fragmentos. Estándar de tamaño para el lote B.</td></tr><tr><td>GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp</td><td>AB Sciex 608095</td><td></td><td>Para análisis automatizados de fragmentos. Estándar de tamaño para el lote A.</td></tr><tr><td>Solución de carga de muestras (SLS)</td><td>AB Sciex</td><td>608082</td><td>Para análisis automatizados de fragmentos.</td></tr><tr><td>Placa de secuestro - Microplaca PCR de polipropileno de 96 pocillos</td><td>Costar</td><td>6551</td><td>Para análisis automatizados de fragmentos.</td></tr><tr><td>Centrífuga de placas, minicentrífuga de placas PerfectSpin P</td><td>VWR Peqlab</td><td>NA</td><td>utilizada para centrifugar productos de PCR.</td></tr><tr><td>Placa amortiguadora - 96 pocillos EIA/RIA Poliestireno transparente de fondo plano sin tratar Microplaca</td><td>Corning</td><td>9017</td><td>Para análisis automatizados de fragmentos.</td></tr><tr><td>GenomeLab Tampón de separación</td><td>AB Sciex</td><td>608012</td><td>Para análisis automatizados de fragmentos.</td></tr><tr><td>Gel de separación - LPAI</td><td>AB Sciex</td><td>608010</td><td>Para análisis automatizados de fragmentos.</td></tr><tr><td>Sequenzer - CEQ8000 Sistema de Análisis Genético</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>Para análisis automatizados de fragmentos.</td></tr><tr><td>GeneMarker V1.95</td><td>Softgenetics</td><td>NA</td><td>Para analizar los resultados de análisis automatizados de fragmentos.</td></tr></tbody></table>

protocolo de laboratorio para análisis genéticos de contenido intestinal de macroinvertebrados acuáticos con grupo-específica rdna cartillas

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Análisis de redes tróficas es esencial para una mejor comprensión de los ecosistemas. Por ejemplo, las interacciones tróficas pueden sufrir cambios severos causados por la invasión de especies no autóctonas. Sin embargo, es difícil en muchos casos una identificación exacta de las interacciones depredador-presa de campo. Estos análisis a menudo se basan en una evaluación visual del contenido de la tripa o el análisis de ratios de isótopos estables (δ15N y δ13C). Tales métodos requieren amplio conocimiento, respectivamente, diversidad morfológica o la firma isotópica de organismos presa individual, conduce a obstáculos en la identificación exacta de organismos presa. Análisis de contenido de Visual intestino especialmente subestimar organismos presa de cuerpo suave, porque maceración, ingestión y digestión de presas organismos dificultan la identificación de especies específicas. Por lo tanto, estrategias de polimerasa en la reacción en cadena (PCR), por ejemplo el uso de la cartilla del específico de grupo se establece, brindan una herramienta poderosa para la investigación de las interacciones tróficas. Aquí, describimos protocolos detallados para investigar el contenido estomacal de los consumidores de macroinvertebrados del campo mediante sistemas específicos de grupo primer nuclear ácido desoxirribonucleico ribosómico (ADNr). ADN puede ser extraído de especímenes enteros (en el caso de taxa pequeño) o de contenido estomacal de ejemplares recolectados en el campo. Presencia y eficiencia funcional de las plantillas de ADN necesitan ser confirmado directamente desde el individuo probado usando la cartilla universal establece contra la subunidad correspondiente del DNA. También demostramos que presa consumida puede ser determinado más a nivel de especie mediante PCR con cebadores específicos de grupo sin modificar combinan con análisis de polimorfismo (SSCP) hebra posterior conformación utilizando geles de poliacrilamida. Además, nos muestran que el uso de diferentes tintes fluorescentes como etiquetas permite proyección paralela para fragmentos de ADN de grupos de presas diferentes de múltiples muestras contenido intestinal mediante el análisis del fragmento automatizado.

Hemos utilizado con éxito pasos descritos en este protocolo para el análisis de la dieta en diferentes estudios. En esta sección, presentamos ejemplos que describe la aplicabilidad de las distintas secciones del protocolo.
Por ejemplo, para demostrar la efectividad de los sistemas de primer grupo-específica establecida por los autores28 y el potencial de mayores aguas abajo análisis de productos PCR por a...

Análisis de contenido intestinal más común de macroinvertebrados son visuales. Que requiere intenso conocimiento sobre la diversidad morfológica de los organismos presa, perder presa con cuerpo suave y, debido a la fuerte trituración de presa, son casi imposibles para algunos organismos, incluyendo los anfípodos. Ofrecemos detallados novela enfoques genéticos para macroinvertebrados presa de identificación en la dieta de los anfípodos.

Protocolo de laboratorio para análisis genéticos de contenido intestinal de macroinvertebrados acuáticos con grupo-específica rDNA cartillas

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

El objetivo general de este protocolo es mejorar las investigaciones de ecología trófica, especialmente a partir de muestras de campo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ecología de redes tróficas, como el impacto de especies invasoras sobre las interacciones tróficas. La principal ventaja es la aplicación adicional a análisis tróficos con mayor integración temporal para exactamente los mismos especímenes, y que puede ser aplicado por prácticamente cualquier ecólogo.Aunque establecimos este enfoque para obtener información sobre el consumo de presas por consumidores acuáticos, también puede aplicarse para otros fines, por ejemplo, para determinar la composición de especies en muestras de macroinvertebrados bentónicos. El procedimiento será demostrado por Christian Sodemann, un técnico de nuestro laboratorio. Para comenzar este experimento, transfiera el tracto gastrointestinal del depredador previamente diseccionado a un tubo de reacción seguro de dos mililitros que contenga 440 microlitros de tampón de extracción salina.Congele inmediatamente las muestras a menos 20 grados Celsius hasta la extracción de ADN. Después de retirar las muestras del congelador, inicie la extracción de ADN utilizando pinzas para agregar una esfera de acero inoxidable de cinco mililitros a cada tubo de muestra, y luego deje las muestras sobre la bancada a temperatura ambiente para que descongelen. Mediante un molino de bolas, homogenice las muestras durante un minuto a 15 hercios.Después de centrifugar brevemente las muestras, añada 90 microlitros de SDS al 10 % y cinco microlitros de proteinasa K a 10 miligramos por mililitro a las muestras. A continuación, vortexe bien las muestras e incúbelas a 60 grados Celsius con agitación constante a 400 rpm en un ThermoMixer durante una hora. Para promover aún más la lisis, vortexe las muestras cada 10 minutos durante esta incubación.Después de una breve centrifugación, pipetee 350 microlitros de cloruro de sodio cinco molar en las muestras. Vortexee durante 30 segundos a un minuto para mezclar completamente las muestras. Luego, centrifugue a 16.200 ×g a cinco grados Celsius durante 40 minutos.Por lo tanto, una de las cosas más críticas al retirar las muestras de la centrífuga es evitar que las perlas se muevan y perturben el botón que contiene todas las partículas que deben eliminarse en este paso. A continuación, transfiera cuidadosamente aproximadamente 600 microlitros del sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros, asegurándose de no perturbar el botón. Añada 600 microlitros de isopropanol frío con hielo e invierta cuidadosamente el tubo varias veces.Almacene a menos 20 grados Celsius durante la noche. Después de retirar las muestras del congelador, centrifúgelas a 16.200 ×g a temperatura ambiente durante 20 minutos. Descarte el sobrenadante asegurándose de no perder el precipitado y use un papel absorbente para secar cuidadosamente el tubo.Lave estos pellets que contienen ADN añadiendo 200 microlitros de etanol al 70 % frío con hielo y luego centrifugando a 16 200 × g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante con precaución y use papel de tejido sin pelusas para secar cuidadosamente el tubo. Finalmente, utilizando una pipeta de 10 microlitros ajustada a ocho microlitros, retire cuidadosamente el sobrenadante restante, asegurándose de no perturbar el pellet.Seque el precipitado hasta que todo el etanol se haya evaporado. Luego, agregue de 50 a 100 microlitros de agua libre de nucleasas, mezcle brevemente por vórtex y deje a cuatro grados Celsius durante la noche para disolver el precipitado. Para verificar la eficiencia funcional de las muestras de ADN extraídas aquí, analice cada una mediante PCR, utilizando conjuntos de cebadores universales adecuados para la fuente alimentaria respectiva.Comience agregando los cebadores, la mezcla de dNTP, el tampón de reacción, la polimerasa Taq de ADN y agua purificada en un tubo de reacción de 1,5 o 2,5 mililitros, y agite la mezcla de reacción estándar en vórtex. A continuación, para cada muestra de ADN, transfiera un microlitro del extracto de ADN correspondiente a nueve microlitros de la mezcla de reacción estándar dentro de una placa de PCR. Cierre la placa y colóquela en el termociclador, luego inicie el programa de PCR.Después de finalizada la reacción de PCR, utilice una opción de centrifugado corto en una minicentrífuga para precipitar los productos de PCR. Luego mezcle tres microlitros de cada producto de PCR con un microlitro de colorante de carga seis veces concentrado. Cargue estas muestras en los pozos de un gel de agarosa previamente preparado.Cargue 1,5 µL de un marcador de ADN de 100 pares de bases en un carril del gel como estándar de tamaño. Cierre la tapa de la unidad de electroforesis, conéctela a una fuente de alimentación y corra el gel a 100 voltios por centímetro durante 35 minutos. Después de la electroforesis, retire el gel y colóquelo en un baño de tinción previamente preparado durante aproximadamente 10 minutos.Finalmente, retire el gel del baño de tinción y colóquelo en un sistema de documentación de geles, y visualícelo de acuerdo con el manual. Para analizar el contenido intestinal del depredador, utilice soluciones de trabajo previamente preparadas del extracto de ADN. Realice reacciones de PCR separadas para cada uno de los 16 conjuntos de cebadores específicos del grupo de presas.Incluya un control positivo con ADN de un espécimen perteneciente al grupo de presas respectivo y un control negativo con ADN de la especie depredadora. Es fundamental documentar exactamente la asignación de las muestras dentro de cada placa de PCR para evitar mezclar muestras diferentes al cargarlas en una placa de secuenciación para la detección en un secuenciador de asignación y, en última instancia, asignar resultados incorrectos a un individuo consumidor. A continuación, realice las reacciones de PCR utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente, ajustado a la temperatura específica de hibridación y al número de ciclos para cada conjunto de cebadores utilizado.Para detectar los fragmentos amplificados en estas reacciones de PCR, realice análisis automatizados de fragmentos en dos lotes, A y B. Prepare una mezcla que contenga solución de carga para la muestra, o SLS, y el estándar de tamaño respectivo para cada lote. A continuación, descongele los productos de PCR previamente congelados de las ocho reacciones de PCR pertenecientes al lote respectivo, asegurándose de mantenerlos en la oscuridad. Utilice la opción de centrifugación rápida de una mini centrífuga para sedimentarlos.En una placa de secuenciación, cargue el número de pozos correspondiente al número de muestras que se analizarán, añadiendo 22 microlitros de la mezcla respectiva del estándar de tamaño SLS por cada muestra. Luego, cargue un microlitro del producto de PCR de cada una de las ocho reacciones de PCR en los pozos respectivos de la placa. A continuación, utilice la opción de centrifugación rápida de una microcentrífuga para hacer un breve centrifugado y sedimentar cuidadosamente esta mezcla.Después de eso, cubra cada pocillo con una gota de aceite mineral. Luego, llene los pocillos de reacción de una placa de tampón con 250 a 300 microlitros de tampón de separación de ADN. Utilice el software del secuenciador capilar para crear una configuración de muestras según las instrucciones del fabricante.Asegúrese de que la asignación de muestras dentro del diseño de la muestra coincida con la distribución de las muestras en la placa de secuenciación y de que el diseño de la muestra incluya el método adecuado para procesar el lote correspondiente. Al analizar los resultados, es importante verificar visualmente el electroferograma de cada muestra y confirmar o descartar cada pico detectado para cada conjunto de cebadores del marcador por separado, e insertar manualmente los picos no detectados que cumplan con los criterios de un conjunto de cebadores del marcador o eliminar los incorrectos. Después de realizar experimentos de alimentación para determinar la eficacia de los conjuntos de cebadores específicos de grupo establecidos para los análisis de PCR realizados en este protocolo, los resultados de PCR utilizando ADN del tracto gastrointestinal del depredador se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y también mediante polimorfismo de conformación de cadena simple, o SSCP.La electroforesis en gel de agarosa reveló bandas simples de ADN de doble cadena, que no pudieron distinguirse entre las diferentes especies de presas estudiadas. En contraste con eso, la electroforesis de SSCP logró distinguir entre las diferentes especies de presas mediante la comparación de las muestras del contenido intestinal con las muestras de referencia. El ADN extraído del intestino del ácaro acuático después del experimento de alimentación fue secuenciado en diferentes periodos de tiempo tras el consumo de la presa.De una a 50 horas después de la alimentación, las cantidades relativas de ADN de presas detectadas se redujeron significativamente. El ADN extraído del intestino del anfípodo invasor, Dikerogammarus villosus, fue analizado para detectar ADN de presas macroinvertebradas utilizando 16 conjuntos de cebadores específicos por grupo descritos en este protocolo. Solo el 16% del contenido intestinal de D. villosus dio positivo para ADN perteneciente a cualquiera de los 16 taxa de presas objetivo.Además, el ADN de 12 taxones de presas analizados se encontró en al menos una muestra, mientras que el ADN de cuatro taxones nunca se detectó. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que los cebadores utilizados sean específicos para los taxones presentes en su sistema. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ampliar su investigación sobre interacciones tróficas mediante el complemento de los métodos que habitualmente se usan en su laboratorio con análisis genéticos.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Esta publicación describe cómo utilizar el pescado Agilent Sistema de Identificación de Especies para identificar las especies de peces mediante la extracción de ADN y la realización de PCR y RFLP.

Basada en el ADN de especies de peces Protocolo de identificación

La comunidad bacteriana activo asociado con el intestino de Spodoptera littoralis, se determinó por isótopos estables-palpador (SIP) acoplado a la pirosecuenciación. Utilizando esta metodología, se realizó la identificación de las especies de bacterias metabólicamente activas dentro de la comunidad con alta resolución y precisión.

La identificación de bacterias metabólicamente activas en el intestino de la Generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Vía ADN isótopos estables Uso<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucosa

PCR combinada con el análisis de fusión de alta resolución (HRMA) se demuestra como un método rápido y eficiente para determinar el genotipo de pez cebra.

Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución

Se proporciona un protocolo para cuantificar los genes de ARNr 16S bacterianos y las transcripciones de los sedimentos costeros mediante PCR en tiempo real. La metodología incluye la co-extracción de ADN y ARN; preparación de ARN libre de ADN; y cuantificación de genes y transcripciones del ARNr 16S mediante RT-q-PCR, incluida la construcción de curvas estándar.

ADN-ARN simultánea extracción de los sedimentos costeros y cuantificación de 16S rRNA genes y las transcripciones de PCR en tiempo real

Se presenta un protocolo para la evaluación funcional de amplias bibliotecas de saturación de un solo sitio de mutagénesis de proteínas utilizando secuenciación de alto rendimiento. Es importante destacar que este enfoque utiliza pares de cebadores para multiplexar ortogonales construcción de la biblioteca y secuenciación. Se proporcionan resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamasa seleccionado en una dosis clínicamente relevante de ampicilina.

Un protocolo para la evaluación funcional de la Proteína Total-mutagénesis de saturación Bibliotecas La utilización de secuenciación de alto rendimiento

Este manuscrito describe un detallado protocolo estandarizado de secuenciación de amplicones de rRNA 16S de alto rendimiento. El protocolo presenta un protocolo integrado, uniformado, factible y de bajo costo a partir de la recolección de muestras fecales a través de análisis de datos. Este protocolo permite el análisis de un gran número de muestras con estándares rigurosos y varios controles.

Protocolo guía para caracterización microbiana Fecal por secuencia de 16S rRNA-productos

Aquí, describimos un protocolo para obtener datos de la secuencia del amplicón del suelo, rizosfera y raíz endosphere microbiomes. Esta información puede utilizarse para investigar la composición y diversidad de las comunidades microbianas asociadas de planta y es conveniente para el uso con una amplia gama de especies de plantas.

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

Pez cebra se han utilizado como organismos modelo genética fiable en la investigación biomédica, especialmente con el advenimiento de las tecnologías de edición de gene. Cuando se esperan fenotipos larvales, identificación de extracción y genotipo de ADN puede ser difícil. Aquí, describimos un procedimiento eficiente de genotipado para larvas de pez cebra, por cola de recorte, tan pronto como 72 h post fertilización.

Extracción de ADN de alto rendimiento y genotipificación de 3dpf larvas de pez cebra por recorte de aleta

Este protocolo describe un enfoque eficaz de hibridación in situ para detectar los niveles de expresión de ARNm y los patrones espaciales de los genes diana en el líquido celómico Sipunculus nudus.

Hibridación in situ para Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Los ensayos de ADN ambiental requieren un diseño riguroso, pruebas, optimización y validación antes de que pueda comenzar la recopilación de datos de campo. Aquí, presentamos un protocolo para llevar a los usuarios a través de cada paso del diseño de un ensayo qPCR específico de la especie, basado en sondas para la detección y cuantificación de un ADN de especies objetivo a partir de muestras ambientales.

Desarrollo y pruebas de ensayos cuantitativos de PCR específicos de especies para aplicaciones de ADN ambiental

El protocolo detecta genes clave del ciclo del metano en los humedales costeros del sur de Texas y visualiza su distribución espacial para mejorar la comprensión de la regulación del metano y sus impactos ambientales en estos ecosistemas dinámicos.

Visualización de la dinámica microbiana del ciclo del metano en los humedales costeros

Aprende métodos genéticos para identificar presas en macroinvertebrados acuáticos mediante análisis de ADN de tractos gastrointestinales. Esta técnica mejora estudios de ecología trófica y redes alimentarias.

Protocolo de laboratorio para análisis genéticos de contenido intestinal de macroinvertebrados acuáticos con grupo-específica rDNA cartillas (Video) | JoVE Journal

Protocolo de laboratorio para análisis genéticos de contenido intestinal de macroinvertebrados acuáticos con grupo-específica rDNA cartillas

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