Name: Microdisección de captura láser Atlas estereotáctico de regiones del cerebro afectadas por la lesión traumática (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprende microdisección por captura láser para analizar expresión génica y de microARN en regiones cerebrales específicas de rata afectadas por lesión traumática. Este método permite estudiar mecanismos moleculares del TBI con precisión.

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Nos gustaría reconocer a Elizabeth Sumner ayuda edición de este manuscrito. Financiamiento para este proyecto fue proporcionado en parte por el proyecto de Moody ' s para la investigación traslacional de lesión de cerebro traumática y RO1NS052532 a HLH.

Nota: todos los experimentos con animales son aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad del rama médico de Tejas, Galveston, Texas, dirigido por los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de Animales de laboratorio (8ª edición, Nacional Consejo de investigación).
 1. colección de tejidos, la identificación de región y secciones <ol><li>adulto tema, hombre, ratas Sprague-Dawley, aproximadamente seis semanas de edad y 250-300 g, lesiones de percusión experimental de fluidos, como se describe en Shimamura et al. 4.</li> <li>veinticuatro horas después de TBI experimental, humanamente eutanasia a los animales, colocando en una cámara con una concentración de isoflurano de 4% hasta profundamente anestesiados. Asegurar la muerte por decapitación, suprimir los cerebros y congelar inmediatamente en hielo seco en polvo. Tienda congelados cerebros en un congelador de-80 ° C hasta secciones.</li>
	<li>Previo a cualquier procedimiento de LCM que incluye el análisis transcripcional, limpie todas las superficies con Rnasa eliminar detergente para mitigar el riesgo de contaminación y degradación del RNA. 
	Nota: Esta limpieza incluye el área usada para la tinción, el criostato donde se secciona el tejido, y la zona que rodea el dispositivo LCM.</li>
	<li>Recuperar el tejido cerebral de almacenamiento y el lugar en un criostato enfriado a -20 ° C. permita que el cerebro alcancen la temperatura de la cámara de criostato ~ 10 min</li>
	<li>Colocar el lado ventral del cerebro para arriba en una hoja de Gasa encima de la etapa de criostato. Con una cuchilla de afeitar limpia, libre de Rnasa, cortar la parte posterior apenas rostral al cerebelo (puede ser guardado o descartado) y la parte a anterior quiasma óptico (och).</li>
	<li>Coloque una pequeña cantidad de medio de temperatura (OCT) de corte óptimo en dos cryomolds separados. Coloque el cerebro (que contiene la corteza de asociación frontal (FrA) y núcleo de accumbens del núcleo (CAPV)) en el lado anterior de la cryomolds hacia abajo. Añada suficiente medio de OCT para cubrir el tejido.
	<ol><li>Repita este paso con el tejido cerebral con el hipocampo (Hp) y el núcleo supraquiasmático (SCN).</li>
		<li>Permitir que el medio de OCT congelar completamente por ~ 20 min en el criostato.</li>
	</ol></li> <li>Una vez el tejido medio OCT son totalmente helada, apriete una pequeña cantidad de OCT en el cabezal de un montaje y pulse el cryomolds congelado que contiene el tejido en la cabeza de montaje. Permitir que la OCT se congelen completamente para que el molde que contiene el tejido esté fijado firmemente a la cabeza.</li>
	<li>Asegure el accesorio principal en el soporte de seccionamiento y apriete el tornillo. Ajustar el ángulo de corte en relación con la hoja de criostato con las palancas de ajuste para asegurar que las secciones se cortan uniformemente.</li>
	<li>Establecer el espesor de la sección a 30 μm. Cuando corte el bloque de tejido que contiene la FrA y la CAPV, primero empezar secciones hasta que la corteza cerebral es evidente y luego Inicio recoger.</li>
	<li>Refiriendo al Atlas del cerebro de rata 12, sección y cerebro recoge secciones colocando suavemente diapositivas de membrana temperatura polietileno napthalate (PEN) en la parte superior el tejido seccionado para el FrA hasta la corteza motora secundaria (M2 ) se llega al vértice 5.16 mm.
	<ol><li>Visualmente asegurar adherencia se deslice por inspección si tejido y OCT se derritan completamente en la diapositiva. Guardar todas las diapositivas con las secciones de tejido en el criostato hasta coloración.</li>
	</ol></li> <li>Continuar sección hasta la comisura anterior (aca) se hace visible y une en una comisura completa por debajo de los ventrículos laterales ahora aparentes (LV) en Bregma 1.80 mm.</li>
	<li>Recogemos secciones hasta las LVs parecen conectar con el aca en Bregma 0,84 mm.</li>
	<li>Una vez completado el seccionamiento de la FrA y la CAPV, quitar el bloque de tejido montado y reemplazar con el bloque que contienen HP y SCN.</li>
	<li>Sección hasta HCO es aplanado en Bregma-0,480 mm, cuando el tercer ventrículo (3V) llega a ser evidente.</li>
	<li>Recoger las secciones para el SCN desde este punto hasta el Bregma-0,720 mm, cuando comienza el decussation supraóptico (sox). 
	Nota: Puede ser necesario recoger más secciones de tejido a lo largo de la och como el SCN se pasó fácilmente.</li>
	<li>Para la colección de HP, son visiblemente evidente en Bregma sección hasta los cuernos de la célula del gránulo capa convolución del cerebro dentada (GrDG) mm-3,000.</li>
	<li>Recoger las secciones hasta que el hipocampales subcampos de CA se fusionan en las secciones coronales en Bregma mm-4,780. Este detalle permite la colección completa del hipocampo en el sitio de la craneotomía y la lesión de. 
	Nota: Como se demuestra en las publicaciones anteriores de este laboratorio, las células más dañadas será evidentes dentro de esta gama y es apropiado para el análisis de expresión génica o microRNA.</li>
</ol> 2. Protocolo de tinción <ol><li>previo a toda coloración, lavado vajilla y el área de tinción en una campana de vapores químicos con detergente eliminación de Rnasa. Esta preparación mitiga el riesgo de degradación de RNA debido a la contaminación.</li>
	<li>Preparar todos los reactivos y soluciones de nucleasa tinción agua.</li>
	<li>Tomar un rack de diapositivas en el criostato y el lugar en la capilla del humo. Deje que los portaobjetos calentar 30 lugar s. en tinción soluciones (preparadas con agua libre de nucleasas) como sigue: 75% EtOH durante 1 min., libre de nucleasas de agua por 1 minuto, violeta de cresilo 1% durante 1 min., agua libre de nucleasa para 30 s, agua libre de nucleasa para 30 s , 95% EtOH por 30 s, 100% EtOH por 30 s, xileno por 3 min y xileno durante 3 minutos</li>
	<li>Permite el rack para secar al aire durante no más de 10 minutos a temperatura ambiente en la campana. Como alternativa, colocar estantes en un desecador de vacío libre de Rnasa para un secado más rápido. Una vez seco, proceder inmediatamente a LCM.</li>
</ol> 3. Estereotáctica Atlas guiados Capture Microdissection del Laser con el sistema LCM <ol><li>antes de comenzar cualquier procedimiento de LCM para análisis de ARN, limpiar la zona de recogida y la zona alrededor del aparato con detergente eliminación de RNasa y 100% EtOH.</li>
	<li>El interruptor del tirón en el láser de IR generando la unidad antes de encender el microscopio base y permitir que el sistema se inicializa antes de que software se inicia desde el escritorio. 
	Nota: Si no se completa en este orden, el software no reconoce el microscopio.</li>
	<li>Una vez que el software ha arrancado y recorren sus pasos de inicialización, pulse la &#34; fase &#34; en botón software &#34; Panel de configuración. &#34; el escenario modular se moverá a la posición donde LCM Macro tapas diapositivas ser cargadas y descargadas.</li>
	<li>Colocar las diapositivas de la membrana de pluma en los soportes (hasta tres a la vez) con el canto helado rightward. 
	Nota: Si se coloca en el soporte en la orientación incorrecta, el software puede no ser capaz de reconocer correctamente el área deseada de corte de IR o UV.</li>
	<li>Haga clic en la &#34; Mem &#34; casilla de verificación en el &#34; Cap y área de manejo de diapositivas &#34; junto a la diapositiva correspondiente (es decir, A, B o C). Este paso indica si la diapositiva es un portaobjetos de vidrio de membrana. Haga clic en la diapositiva deseada para ser capturado primero.</li>
	<li>Para que la cámara toma una imagen de mosaico para la localización de tejido y orientación para la colocación de la tapa, seleccione &#34; imagen &#34; en la barra de herramientas y seleccione &#34; adquirir Resumen. &#34; 
	Nota: Si el usuario está familiarizado con los tejidos recogidos, este paso puede omitirse utilizando la bola de desplazamiento manual para colocar el &#34; región centro &#34; para la colección.</li>
	<li>Coloque el cursor sobre el área en la imagen de baldosas (o ubicación relativa sin azulejos de la imagen), haga clic derecho y seleccionar &#34; tapa de lugar en la región centro. &#34; el software colocará automáticamente una tapa sobre la posición seleccionada.</li>
	<li>Seleccionar una ubicación. 
	Nota: Para asegurar que el láser IR está correctamente alineado y a recoger sólo las áreas donde se presentan manchas por el software se deben colocar antes de proceder.
	<ol>
		<li>Hacia un área dentro de la tapa donde no está presente tejido. Haga clic en &#34; &#34; en el &#34; Microdissect panel de herramientas de &#34; y seleccione el &#34; busque IR &#34; ficha. En el panel, de disparar una tiro para evaluar donde está disparando el láser IR y el tamaño del punto de prueba IR.</li>
		<li>Con el cursor, haga clic derecho en el medio de IR punto y seleccione &#34; encuentra IR lugar. &#34; 
		Nota: Tamaño y la intensidad de los rayos directamente pueden cambiarse modificando manualmente el &#34; poder, el diámetro o duración &#34; bajo cada indicador de tamaño de punto o moviendo la escala en la parte inferior del cuadro de diálogo. Varios tiros de prueba deba ser despedido para asegurar el correcto tamaño de punto. El láser IR debe ubicarse nuevamente cada vez que se cambia la posición de la tapa cambios o diapositivas.</li>
		<li>UV para corte, localizar el láser UV la &#34; UV Ubique &#34; ficha en el cuadro de diálogo. 
		Nota: Porque el láser UV y el IR se mueven al unísono, no es necesario continuamente volver a localizar el láser UV cada vez que se cambia la posición.</li>
	</ol></li> <li>Elegir la &#34; dibujo a mano alzada &#34; opción en la &#34; Seleccione el panel de herramientas de &#34;. Utilizando un lápiz óptico de pantalla táctil, dibujar alrededor del perímetro de la región de interés y asegurarse de no perder el contacto entre la pantalla táctil y el stylus. Asegúrese de conectar el comienzo y los extremos entre sí. 
	Nota: Puntos de IR se establecerán automáticamente a través del software pero el usuario puede elegir establecer puntos adicionales para asegurar el tejido se adhiere a la tapa después de que se ha realizado corte UV.</li>
	<li>Colección de FrA, realizar una captura láser bruto de tejido cortical hasta cuando aparece la corteza M2 en Bregma 5.16 mm. 
	Nota: Este dato puede ser modificado tal que sólo determinadas partes de la FrA o tipos específicos de la célula son recogidos.</li>
	Colección de <li>para la CAPV, láser captura un área de cerca cerca de aca. 
	El núcleo y la cáscara de la CAPV realizan funciones diferentes y son fisiológicamente únicos. Por lo tanto es importante seguir el atlas del cerebro tan cerca como sea posible. Se recomienda recoger en ningún otro pasado bregma 0,84 mm, como las dos subregiones se convierten en demasiado estrechamente con los demás.</li>
	<li>Colección de Hp, laser captura CA 1, 2 y 3 subcampos hipocampales desde Bregma 3.00 mm y usando el GrDG completamente formado como una señal física para identificación morfológica. 
	Nota: Para los efectos de este estudio, no recoja más allá de Bregma-4,780 mm, que puede ser delimitada visualmente como el punto de cuando los subcampos de Hp están fusionados y punto ventral. Esta zona fue elegida como más heridos las neuronas pueden ser descubiertas directamente en el sitio de lesión 6.</li>
	<li>Para la colección de SCN, primero identificar visualmente los núcleos densamente que sentarse dorsal a HCO y luego recogen.</li>
	<li>Después de la recolección de las regiones (mencionadas anteriormente), mover LCM Macro gorras para la &#34; posición del control de calidad &#34; e inspeccionar para adherencia de tejido completo garantizando visuales UV corta tejido se une a la membrana. Rápidamente Coloque el casquillo ontoan libre de Rnasa 0,5 mL finas paredes tubo de reacción conteniendo 100 μl de tampón de lisis celular.</li>
	<li>Muestras de vortex brevemente para asegurar la completa lisis y almacenar a-80 ° C. En este punto, LCM puede pausarse y las muestras almacenadas hasta su uso para análisis genómico aguas abajo 6.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para los estudios moleculares del cerebro mamífero, LCM se ha convertido en una técnica esencial. Este artículo demuestra que utilizando la combinación de los láseres de corte de IR y UV en el sistema LCM puede capturar cambios genómicos en cualquier región del cerebro mamífero. Estas regiones incluyen aquellos con manchas de LCM-compatible convencionales, como el violeta de cresilo o hematoxilina y eosina. La velocidad del proceso de captura de láser y capacidad de realizar LCM en secciones gruesas de μm 30 en preparaciones de membrana de pluma permite no sólo obtener suficientes cantidades de muestras de células, sino también para aislar el RNA de muestras de LCM de calidad adecuado para todo tipo de aguas abajo Análisis genómico; Estos análisis incluyen microarrays16, PCR arrays17y cuantitativa PCR en tiempo real18.
Nuestros datos proporcionan un fundamento para los estudios que utilizan tejido de LCM. Nos encontramos con que miR-15b es upregulated en el hipocampo y la corteza (figura 4) o en el Núcleo accumbens y puede ser biológicamente relevante para la comprensión de los efectos diferenciales de la LCT, en el cerebro. Un estudio anterior sugirió que aumentos en la vulnerabilidad neuronal cortical lesiones resultan de sobreexpresión de varios miRNAs que regulan negativamente la pro-supervivencia genes, tales como Bcl-219. Objetivos análisis análisis demuestra Bcl-2 también está regulada por miR-15b; así, nuestros datos sugieren una explicación mecanicista por qué regiones específicas del cerebro (es decir,, FCx) pueden ser selectivamente vulnerables a TBI. Es importante recordar la mayoría de los genes está regulada por varios miRNAs y correlacionar cambios en cualquier uno miRNA a un gene específicos es difícil. Por otra parte, estos datos indican que ciertos cambios en la expresión génica y microRNAs pueden utilizarse como biomarcadores de daño cerebral de cada región. De hecho, actualmente estamos usando estos datos en estudios de neuroprotectores como nuevos compuestos de drogas con propiedades antidepresivo pueden afectar diferencialmente expresión génica y microRNA en regiones del cerebro vinculadas a trastornos neuropsiquiátricos. Una limitación de nuestro estudio es que durante varios pasos de los procesos de preparación de diapositivas para LCM, integridad del RNA puede ser comprometida. Este protocolo describe los pasos necesarios para mitigar el riesgo de degradación de RNA. Otra limitación es el tamaño de muestra relativamente pequeño utilizado para cálculo estadístico. En el futuro estudios, aumento de tamaño de la muestra deben disminuir los efectos de las variaciones de expresión génica y miRNA entre animales individuales.
El beneficio de LCM se realiza en estudios de genómica traslacionales usando los modelos animales de enfermedades humanas y de los tejidos enfermos20,21,22,23. Sin la capacidad de captura de poblaciones celulares específicas, los perfiles transcripcionales de regiones diferentes del cerebro sería una mezcla indescifrable y desconocida de muchos tipos de células. Métodos de LCM en estudios de lesiones de cerebro ha llevado a esfuerzos actuales para delinear biomarcadores específicos de la región de cerebro y entender cómo correlacionan con biomarcadores de TBI que circula.

El cerebro mamífero es notablemente complejo y heterogéneo con cientos o miles de células tipo1. De hecho, los estudios en humanos han demostrado que en regiones como la corteza frontal, estructurales y las diferencias funcionales en materia blanca y gris se reflejan en perfiles distintos y divergentes transcripcional2. Heterogeneidad de cerebro ha sido un gran obstáculo para interpretar datos de expresión genética y en el campo de la lesión cerebral. Esta ambigüedad en estudios preclínicos ha llevado posteriormente a cientos de ensayos clínicos fallidos de los tratamientos para lesiones de cerebro3.
Utilizamos láser captura de microdisección (LCM) métodos para el estudio de la lesión cerebral traumática (TBI)-inducida dysregulation del gene en la rata cerebro4, centrándose en el hipocampo, una región del cerebro que es esencial para el aprendizaje y la memoria5. La capacidad de captura con láser y análisis de expresión génica tanto en morir como sobrevivir las neuronas nos da una mayor comprensión del papel de la estocasticidad en la expresión génica en la determinación de los resultados (supervivencia neuronal) después de TBI6. Técnicas de LCM también han demostrado ser útiles para explorar los efectos de la TBI en neuronas hipocampales al comparar7 o ratas de ratones jóvenes y el envejecimiento8.
En estudios recientes, se examinaron otras regiones del cerebro de rata impactado por TBI, centrándose en áreas en ratas y en pacientes TBI humanos asociados a la función ejecutiva (es decir, 9de la corteza frontal) y comorbilidades TBI; Estas comorbilidades como depresión (es decir, Núcleo accumbens10) y trastornos del ritmo circadiano (de núcleo supraquiasmático11). En estudios previos, Huusko y Pitkanen12 y Drexel et al. 13 utiliza LCM para examinar la expresión de gene en el tálamo y el hipotálamo. Nuestro estudio se basa en las observaciones anteriores e incluye cuatro otras regiones cerebrales. Para estudiar los cambios moleculares específicos inducidos después de TBI, fue necesario obtener conocimientos en la identificación y obtención de tipos de la célula en estas regiones mediante un sistema de LCM. Los láseres de corte de UV e infrarrojos (IR) permiten la microdisección precisa de regiones cerebrales deseadas. Aquí, describimos cómo utilizamos este sistema LCM, guiado por coordenadas estereotáxicas en el atlas de cerebro de rata de14, para identificar y láser captura cuatro rata regiones del cerebro que son afectadas diferencialmente por el método de lesión experimental cerebro fluido percusión 4.

<table><tbody><tr><td>Sistema de microdisección de captura láser Arcturus</td><td>Biosystems Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizador Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN Portaobjetos de vidrio de membrana&nbsp;</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Capsure Tapas LCM Applied</td><td>Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Acetato violeta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Xileno (grado histológico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 prueba (grado histológico)</td><td>UTMB Pharmacy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microkit acuoso de ARN</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Gene Expression Primer/Sondas</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Expression Primer/Sondas</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 96 System</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microdisección de captura láser atlas estereotáctico de regiones del cerebro afectadas por la lesión traumática

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

La capacidad de aislar las regiones específicas del cerebro de interés puede ser impedida en técnicas de disociación de tejidos que no conservan su distribución espacial. Estas técnicas también potencialmente sesgan el análisis de expresión génica porque el proceso sí mismo puede alterar los patrones de expresión en células individuales. Aquí describimos un método láser captura de microdisección (LCM) para recoger selectivamente regiones específicas del cerebro afectadas por lesión cerebral traumática (TBI) mediante el uso de un modificado Nissl (cresil violeta) tinción de protocolo y la dirección de un atlas del cerebro de rata. LCM proporciona acceso a las regiones del cerebro en su posición natural y la habilidad de usar puntos anatómicos para la identificación de cada región específica. Con este fin, LCM se ha utilizado anteriormente para examinar la expresión de genes específicos de región cerebro en TBI. Este protocolo permite el examen de las alteraciones inducidas por el TCE en la expresión génica y microRNA en áreas del cerebro distintas dentro del mismo animal. Los principios de este protocolo pueden ser modificados y aplicados a una amplia gama de estudios que examinan la expresión genómica en otras enfermedades o en modelos animales.

El esquema presentado en la figura 1 ilustra el flujo de trabajo general de LCM atlas guiados de potenciales aplicaciones de análisis posteriores y regiones específicas del cerebro. Este estudio se centró en cuatro regiones cerebrales relevantes Fisiopatología TBI y el desarrollo de comorbilidades: FrA, CAPV, SCN y Hp. Una limitación presente en LCM de regiones específicas del cerebro es que localizaciones anatómicas son a menudo oscurecidas por la falta de límites definidos, como puede verse en la figura 2 (A, D, G, J). El uso de un atlas del cerebro seccionado y captura de regiones específicas con láser reduce la posibilidad de contaminación de las muestras con las regiones del cerebro que no sea el objetivo. Cuando se tiene cuidado para seguir monumentos de tejido durante el seccionamiento y después de la tinción de Nissl, LCM tecnología puede proporcionar un medio altamente constante de adquirir las poblaciones discretas de células, núcleos o regiones15. Los objetivos a largo plazo de estos estudios son identificar genes y microRNAs que potencialmente pueden servir como sustituto, biomarcadores no invasivos región específico de lesión de cerebro. El primer paso en esta tubería de desarrollo de biomarcadores es la caracterización de los cambios transcripcionales específicos de tejido después de TBI experimental. Estos datos entonces pueden ser correlacionados con los cambios inducidos por lesiones en la circulación de biofluidos.
Los procedimientos presentados fueron optimizados para reducir el riesgo de degradación de RNA para permitir análisis de ARN mediante transcripción inversa del ARN total de LCM antes de PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). ARN total (incluyendo pequeñas y grandes especies de RNA) fue aislado usando un método de aislamiento basado en la columna sobre el tejido que fue capturado por el láser de regiones individuales del cerebro. Evaluar integridad del RNA, la calidad y la cantidad después de los procedimientos de aislamiento, muestras de RNA brevemente fueron desnaturalizadas a 70 ° C y ejecutar en un analizador de RNA. Las mediciones cualitativas incluyen analizar amplitudes máxima de las bandas de rRNA de 18s y 28s ()figura 3), que puede ser representante de la degradación total y usando el "RNA integridad número" (RIN). Si técnicas de cuidado libre de Rnasa, RNA había aislado de muestras de LCM típicamente resultados en RINs que van desde los 6-8. Un RIN más bajo puede implicar mala calidad de RNA y puede potencialmente disminuir la exactitud del análisis de expresión génica y microRNA. Por el contrario, un RIN mayor puede mejorar la confianza en la validez de los resultados generados a partir de análisis de ARN.
RT-qPCR fue realizada usando conjuntos de primer punta de prueba para genes individuales y microRNAs (figura 4). Aproximadamente 1 ng de RNA total fue revés transcrito a cDNA y previamente amplificada antes de qPCR se realizó según el protocolo del fabricante. Genes relacionados con las lesiones evaluados en este estudio incluyeron BCL2 asociados X, regulador de la Apoptosis (Bax), LLC/linfoma de células B 2 (Bcl-2), caspasa 3, Apoptosis-Related cisteína peptidasa (Casp3) , Derivado de cerebro Factor neurotrófico (Bdnf) y campo elemento sensible proteína 1 de Unión (Creb). MiR-15b fue seleccionada porque se ha demostrado para ser alterada después de TBI experimental en neuronas individuales moribundas. También ha validado experimentalmente y bioinformatically prevé objetivos gene con funciones de pro-supervivencia (datos no publicados). Se calcularon los ratios normalizada doble-cambio por ΔΔCt método comparando niveles de expresión de gene y microRNA en TBI animales y controles de ingenua, con la normalización a un gene endógeno (Gapdh) o RNA pequeño (U6), respectivamente. Un cambio doble por encima de 1 indica una regulación al alza global en ese gen o microRNA, y por el contrario, un doblez de cambio inferior a 1 indica una regulación a la baja. Análisis estadístico mostró cambios significativos en la expresión génica entre control de LCT e ingenuo (p ≤ 0.05) que dependían del región del cerebro. Cambios significativos en la expresión de miR-15b no se detectaron entre control de LCT y naif, pero hubo una tendencia hacia la expresión más alta y más baja de una manera dependiente de la región cerebral. Estos datos sugieren que otra optimización es necesario para evaluar los cambios en la expresión de microARN. También es posible que el tamaño de muestra fue demasiado pequeño para obtener significación estadística, en parte debido a la variabilidad inherente en la expresión. Futuros estudios incluirán animales simulada funciona para asegurar que el gen y cambios de expresión de microARN se atribuyen a TBI y no debido a la preparación quirúrgica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig1.jpg"> 
Figura 1. Flujo de trabajo de LCM guiada por el Atlas para análisis genómico aguas abajo. (A-F) Procedimientos de preparación del animal para análisis de qPCR aguas abajo: (A) adulto, macho ratas Sprague Dawley (~ 6 semanas de edad y un peso de 300 g) es anestesiados, sometido a la TBI de fluido percusión y humanitariamente sacrificados 24 h después de la lesión. (B) (30 μm) las secciones seriales del cerebro congelado fresco se basan en coordenadas de regiones específicas del cerebro (FrA, CAPV, Hp, SCN) del atlas de Paxinos y Watson el cerebro de la rata. (C) las secciones son fijas, tinción de Nissl (1% violeta de cresilo), deshidratado y secada al aire. (D). LCM en identificado regiones del cerebro con un sistema de LCM. (E) tapas de Macro LCM transferida a un tubo de 0,5 mL libre de Rnasa con 100 μL de tampón de lisis celular y almacenadas a-80 º c hasta aislamiento de RNA para posteriores análisis genómico. RNA puede ser transcripción reversa para que análisis de RT-qPCR gene o microRNA examinar la expresión diferencial de blanco molecular después de TBI o entre regiones del cerebro de interés (F). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig2.jpg"> 
Figura 2. LCM de TBI afectadas las regiones del cerebro. Imágenes representativas de las secciones de tejido recogidas desde el lado ipsolateral del sitio de la lesión con IR y UV laser funciones en el sistema LCM (A-I). El tejido fue seccionado en un criostato (30 μm) y recogido en preparaciones de membrana de pluma. Las secciones fueron entonces fijos, Nissl-teñidas con violeta de cresilo (1%) y deshidrataron para identificar las regiones específicas del cerebro basadas en puntos anatómicos en Paxinos y Watson Rat Brain Atlas. (A-C) Un área de la corteza de asociación frontal (FrA) (D-F) componentes de las capas piramidales CA1, CA2 y CA3 del hipocampo (Hp) situado al lado de los cuernos completamente formados de la capa del gránulo de la convolución del cerebro dentada (GrDG). (G-I) Un área del Núcleo accumbens core (CAPV) proximal y rostral a la comisura anterior (aca). (J-K) Núcleo supraquiasmático (SCN) rostral al quiasma supraóptico (och). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig3.jpg"> 
Figura 3. Representante análisis de ARN calidad. Representante de electropherograms e imágenes de gel asociado de ARN derivados de LCM recogieron tejido (A-D). Electropherograms e imágenes de gel asociado muestran intacta RNA basado en la aparición de picos de rRNA de 18s y 28s y bandas de gel. Este ARN es adecuado para todas las aplicaciones posteriores, incluyendo genómica y análisis proteómico. (A) Asociación de la corteza Frontal (FrA) RNA. RIN 6.1. (B) hipocampo (Hp) RNA. RIN 4.4. (C) Núcleo accumbens núcleo RNA (CAPV). RIN 7.3. (D) supraquiasmático (SCN) del núcleo RNA. RIN 7.6. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig4.jpg"> 
Figura 4. Posteriores análisis de cerebro cada región genética y expresión de microARN mediante RT-qPCR. Individual RT-qPCR para genes de interés (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb) y microRNA de interés (miR-15b) se realizó en las regiones del cerebro láser capturado después de TBI (Hp y CAPV n = 5, FrA n = 4) y en comparación con animales ingenuos ileso (n = 4). Se realizó análisis de genes relacionados con la patogénesis TBI para Hp, CAPV, FCx. datos se presentan como doblez normalizado relaciones de cambio comparados con regiones del cerebro ingenuo control (test t no pareado con corrección de ± de Welch SEM; * p ≤ 0.05) (A). Expresión diferencial de miR-15b en regiones diferentes del cerebro se presenta como cambios normalizada doble en comparación con el control de ingenuo (± SEM) (B). Datos del SCN (n = 2) no incluido. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Describimos el uso del microdissection de la captura del laser para obtener muestras de poblaciones celulares distintas de regiones cerebrales diferentes para el análisis de gen y microRNA. Esta técnica permite el estudio de los efectos diferenciales de la lesión cerebral traumática en regiones específicas del cerebro de rata.

Microdisección de captura láser Atlas estereotáctico de regiones del cerebro afectadas por la lesión traumática

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

El objetivo general de este protocolo de microdisección por captura láser es recopilar células de regiones cerebrales específicas afectadas por una lesión cerebral traumática para su análisis molecular. Soy la doctora Helen Hellmich. Mi asistente de posgrado, Harris Weisz, quien es estudiante del programa de Fisiopatología Humana y Medicina Traductiva en la Escuela de Medicina de la Universidad de Texas, va a demostrar cómo utilizamos los métodos de microdisección por captura láser en nuestros estudios sobre lesiones cerebrales.Este método podría ayudar a esclarecer los mecanismos y consecuencias de los cambios inducidos por el TCE en regiones cerebrales discretas, como la corteza frontal, que controla las funciones ejecutivas, y el hipocampo, que es importante para los procesos dependientes de la memoria. La ventaja principal de esta técnica es que podemos estudiar el efecto de un proceso patológico en múltiples regiones cerebrales discretas o en tipos celulares individuales a partir del mismo cerebro.Antes de cualquier procedimiento de LCM que incluya análisis transcripcional, limpie todas las superficies con detergente RNace para mitigar el riesgo de contaminación y degradación del ARN. Retire el tejido cerebral del almacenamiento y colóquelo en un criostato enfriado a menos 20 grados Celsius.Deje que el cerebro se equilibre a la temperatura de la cámara del criostato durante aproximadamente diez minutos. Coloque el cerebro, con el lado ventral hacia arriba, sobre una gasa colocada encima de la platina del criostato. Con una cuchilla de afeitar para ARN limpia, corte la porción posterior justo por delante del cerebelo y la porción justo anterior al quiasma óptico.Coloque una pequeña cantidad de medio de temperatura óptima para corte en dos moldes criogénicos separados. Coloque el cerebro que contiene la corteza de asociación frontal y el núcleo accumbens central en el interior de uno de los moldes criogénicos con la cara inferior hacia abajo. Añada suficiente medio OCT para cubrir el tejido.Repita este paso con el fragmento de tejido cerebral que contiene el hipocampo y el núcleo supraquiasmático. Deje que el medio OCT se congele completamente durante aproximadamente 20 minutos en el criostato. Una vez que el tejido y el medio OCT estén completamente congelados, exprima una pequeña cantidad de OTC sobre un cabezal de montaje.Presione un molde criogénico congelado sobre la cabeza de montaje y deje que el OCT se congele completamente para que el molde que contiene el tejido quede firmemente unido a la cabeza. Fije el accesorio de la cabeza al soporte de corte y apriete el tornillo. Ajuste el ángulo de corte con respecto a la hoja del criostato mediante las palancas de ajuste para asegurar que los cortes se realicen de manera uniforme.Establezca un grosor de corte de 30 micrones. Al cortar el bloque de tejido que contiene el hipocampo y el SEN, realice cortes hasta que el quiasma óptico esté aplanado en el bregma a 0,48 milímetros cuando el tercer ventrículo se vuelva evidente. Luego, recoja los cortes para el SEM desde este punto colocando suavemente sobre el tejido seccionado portaobjetos con membrana de naftalato de polietileno a temperatura ambiente.Verifique visualmente la adherencia al portaobjetos confirmando que el tejido y el OTC se han fundido completamente sobre el portaobjetos. Almacene todos los portaobjetos con secciones de tejido en el criostato hasta la tinción. Detenga la recolección de secciones en el bregma 0,72 milímetros cuando comience la decusación supraóptica.Para la recolección del hipocampo, seccione hasta que las astas de la capa de células granulares del giro dentado sean visibles en bregma 3,00 milímetros. Recolecte secciones hasta que los subcampos CA del hipocampo estén fusionados en las secciones coronales en bregma 4,78 milímetros. Esto permite la recolección completa del hipocampo bajo la craneotomía y el sitio de lesión.Antes de la tinción, lave toda la vidriería y el área de tinción en una campana extractora con un detergente eliminador de RNasas. Saque el portaportas del criostato y colóquelo en la campana extractora. Deje que los portaobjetos se calienten durante 30 segundos.Tiña los cortes con violeta de cresilo y aclárelos con solución salina. Deje que el portaobjetos con los cortes teñidos se seque al aire durante no más de diez minutos a temperatura ambiente en la campana extractora. Una vez secos, pase inmediatamente a la microdisección láser (LCM).Antes de comenzar cualquier procedimiento de MAC para análisis de ARN, limpie el área de recolección y la zona alrededor del dispositivo con detergente eliminador de ARNasas y etanol al 100 %. Encienda el interruptor de alimentación de la unidad generadora de láser infrarrojo antes de encender la base del microscopio y permita que el sistema se inicialice antes de iniciar el software desde el escritorio. Una vez que el software se haya cargado y completado sus pasos de inicialización, abra el panel de configuración del software y presione el botón de posición actual del portaobjetos.La plataforma modular se moverá a la posición donde se pueden cargar y descargar las tapas macro LCM y las portaobjetos. Coloque hasta tres portaobjetos con membrana de bolígrafo en los soportes con el borde mate orientado hacia la derecha. Seleccione el área de manejo de tapas y portaobjetos junto al portaobjetos correspondiente y haga clic en la casilla de verificación MEM para indicarle al software que se han cargado los portaobjetos de vidrio con membrana.Luego, haga clic en la diapositiva deseada que se capturará primero. Para capturar una imagen en mosaico que muestre la ubicación y orientación del tejido para la colocación de las cápsulas, seleccione imagen en la barra de herramientas y elija adquirir vista general. Coloque el cursor sobre el área de la imagen en mosaico, haga clic derecho y seleccione colocar cápsula en el centro de la región.El software colocará automáticamente una tapa sobre la posición seleccionada. Después de localizar los láseres infrarrojo y ultravioleta, seleccione la opción de dibujo a mano alzada en el panel de herramientas de selección. Utilizando un lápiz óptico en pantalla táctil, dibuje alrededor del perímetro de la región de interés asegurándose de no perder el contacto entre la pantalla táctil y la punta del lápiz óptico.Asegúrese de conectar los puntos inicial y final. Para la recolección del hipocampo, capture con láser los subcampos hipocampales CA1, CA2 y CA3 comenzando en el bregma a 3.00 milímetros y utilizando la capa granular completamente formada del giro dentado como referencia anatómica física para la identificación morfológica. Después de la recolección, mueva los casquetes macro LCM a la posición de control de calidad e inspeccione la adherencia completa del tejido asegurando visualmente que el tejido cortado con UV esté unido a la membrana.Es fundamental que el láser UV corte alrededor de la totalidad del tejido. La falta de hacerlo resultará en una adherencia incompleta del tejido al casquete de MAC. Luego, coloque rápidamente cada casquete en un tubo de reacción de paredes delgadas de 0,5 mililitros libre de ARNasas que contenga 100 microlitros de tampón de lisis celular.Vortexe brevemente las muestras para asegurar una lisis completa y almacénelas a menos 80 grados Celsius hasta que estén listas para realizar el análisis genómico posterior. A continuación se muestran imágenes representativas de secciones de tejido obtenidas del lado epilateral del sitio de lesión con las funciones de láser infrarrojo y ultravioleta del sistema de microdisección por láser. Esta es una zona de la corteza de asociación frontal.Esta imagen muestra la misma región después de la recolección. Y este es el tejido sobre el capuchón tras la recolección. Esta imagen muestra los componentes de las capas parameatales CA1, CA2 y CA3 del hipocampo ubicadas junto a los cuernos completamente formados de la capa granular del giro dentado.Se recogieron las regiones CA2 y CA3, y estas poblaciones celulares se observan en el capuchón. Aquí, un área del núcleo accumbens, ubicada en la parte proximal adrostral a la comisura anterior, fue el objetivo y se ha reproducido fielmente en el capuchón. Por último, el núcleo supraquiasmático, situado en la parte rostral al quiasma supraóptico, fue capturado mediante microdisección láser tras la lesión cerebral traumática (TBI).Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para procesar un cerebro en aproximadamente ocho horas. Eso incluye el procesamiento del tejido, la tinción y la microdisección láser. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis epigenético, para responder preguntas sobre patrones de metilación o expresión de microARN.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la MAC en múltiples regiones cerebrales del mismo cerebro.

stereotactic-atlas-guided-laser-capture-microdissection-brain-regions

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Furmanski, O., et al. Modelo de impacto cortical controlado de lesión cerebral de ratón con trasplante terapéutico de células neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. J. Vis. Exp. (2019)En este video, las células neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos se inyectan estereotáxicamente en el borde de materia gris-materia blanca de la corteza profunda en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática. Las células...

Trasplante estereotáxico de suspensión de células neurales en un ratón con lesión cerebral traumática

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Microdisección de captura láser Atlas estereotáctico de regiones del cerebro afectadas por la lesión traumática

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