Microdisección de captura láser Atlas estereotáctico de regiones del cerebro afectadas por la lesión traumática
11 de septiembre de 2017
Describimos el uso del microdissection de la captura del laser para obtener muestras de poblaciones celulares distintas de regiones cerebrales diferentes para el análisis de gen y microRNA. Esta técnica permite el estudio de los efectos diferenciales de la lesión cerebral traumática en regiones específicas del cerebro de rata.
El objetivo general de este protocolo de microdisección de captura láser es recolectar células de regiones cerebrales específicas afectadas por lesiones cerebrales traumáticas para análisis molecular. Soy la doctora Helen Hellmich. Mi asistente graduado, Harris Weisz, que es estudiante en el programa de Fisiopatología Humana y Medicina Traslacional aquí en la rama médica de la Universidad de Texas, va a demostrar cómo usamos los métodos de microdisección de captura láser en nuestros estudios de lesiones cerebrales.
Este método podría ayudar a dilucidar los mecanismos y las consecuencias de los cambios inducidos por el TCE en regiones cerebrales discretas, como la corteza frontal, que controla las funciones ejecutivas. Y el hipocampo, que es importante para los procesos dependientes de la memoria. La principal ventaja de esta técnica es que podemos estudiar el efecto de un proceso de enfermedad en múltiples regiones cerebrales discretas o tipos de células individuales del mismo cerebro.
Antes de cualquier procedimiento de LCM que incluya un análisis transcripcional, limpie todas las superficies con detergente eliminador de RNace para mitigar el riesgo de contaminación y degradación del ARN. Recupera el tejido cerebral del almacén. Y colóquelo en un cirostato enfriado a menos 20 grados centígrados.
Deje que el cerebro se equilibre a la temperatura de la cámara de criostato durante aproximadamente diez minutos. Coloque el cerebro, con el lado ventral hacia arriba, sobre una sábana de gasa encima de la etapa de criostato. Con una cuchilla de afeitar de ARN limpia, corte la porción posterior justo rostral al cerebelo y la porción justo anterior al quiasma óptico.
Coloque una pequeña cantidad de medio a temperatura de corte óptima en dos moldes criogénicos separados. Coloque el cerebro que contiene la corteza de asociación frontal y el núcleo accumbens en un molde criogénico con el interior hacia abajo. Agregue suficiente medio OCT para cubrir el tejido.
Repita este paso con el trozo de tejido cerebral que contiene el hipocampo y el núcleo supraquiasmático. Deje que el medio OCT se congele completamente durante unos 20 minutos en el criostato. Una vez que el tejido y el medio OCT estén completamente congelados, exprima una pequeña cantidad de OTC en un cabezal de montaje.
Presione un crimolde congelado en el cabezal de montaje y deje que el OCT se congele por completo para que el molde que contiene el tejido esté firmemente unido al cabezal. Asegure el accesorio de cabeza al soporte de sección y apriete el tornillo. Ajuste el ángulo de corte en relación con la cuchilla de criostato con las palancas de ajuste para asegurarse de que las secciones se corten de manera uniforme.
Ajuste el grosor de la sección a 30 micras. Al seccionar el bloque de tejido que contiene el hipocampo y la NEE, seccionar hasta que el quiasma óptico se aplane a 0,48 milímetros cuando el tercer ventrículo se haga evidente. A continuación, recoja las secciones para el SEM desde este punto colocando suavemente portaobjetos de membrana de naptalato de polietileno a temperatura ambiente encima del tejido seccionado.
Asegure visualmente la adherencia al portaobjetos confirmando que el tejido y el OTC se han derretido completamente en el portaobjetos. Guarde todos los portaobjetos con secciones de tejido en el criostato hasta que se manchen. Detenga las secciones de recolección en la bregma 0,72 milímetros cuando comience la decusación supraóptica.
Para la recolección del hipocampo, corte hasta que los cuernos de la capa de células granulosas del giro dentado sean visibles a bregma 3.00 milímetros. Recoja las secciones hasta que los subcampos CA del hipocampo se fusionen en las secciones coronales a bregma 4,78 milímetros. Esto permite la recolección completa del hipocampo debajo de la craneotomía y el sitio de la lesión.
Antes de teñir, lave toda la vajilla y el área de tinción con una campana extractora química con detergente eliminador de RNasa. Tome la rejilla de lados del criostato y colóquela en la campana extractora. Deje que los portaobjetos se calienten durante 30 segundos.
Tiñe las secciones con violeta cresilo y transparente con solución salina. Deje que la rejilla de portaobjetos manchados se seque al aire durante no más de diez minutos a temperatura ambiente en la campana extractora. Una vez seco, proceda inmediatamente a LCM.
Antes de comenzar cualquier procedimiento de LCM para el análisis de ARN, limpie el área de recolección y el área alrededor del dispositivo con detergente que elimina la ARNasa y etanol al 100%. Accione el interruptor de encendido de la unidad generadora de láser con infrarrojo antes de encender la base del microscopio y permita que el sistema se inicialice antes de que el software se inicie desde el escritorio. Una vez que el software se inicia y se ejecuta a través de los pasos de inicialización, abra el panel de configuración del software y presione el botón de etapa actual.
La etapa modular se moverá a la posición donde se cargarán y descargarán las macros de LCM y se ejecutarán. Coloque hasta tres correderas de membrana de bolígrafo en los soportes con el borde esmerilado hacia la derecha. Seleccione el área de manejo de la tapa y el portaobjetos junto al portaobjetos respectivo y haga clic en la casilla de verificación MEM para indicar al software que se han cargado los portaobjetos de vidrio de membrana.
A continuación, haga clic en la diapositiva que desee capturar primero. Para capturar una imagen en mosaico para la ubicación del tejido y la orientación para la colocación de los tapones, seleccione imagen en la barra de herramientas y seleccione adquirir información general. Coloque el cursor sobre el área de la imagen en mosaico, haga clic con el botón derecho y seleccione Colocar tapa en el centro de la región.
El software colocará automáticamente una tapa sobre la posición seleccionada. Después de localizar los láseres infrarrojos y UV, elija la opción de dibujo a mano alzada en el panel de herramientas de selección. Con el lápiz óptico de pantalla táctil, dibuje alrededor del perímetro de la región de interés mientras se asegura de no perder el contacto entre la pantalla táctil y el cabezal del lápiz óptico.
Asegúrate de conectar los puntos inicial y final. Para la recolección del hipocampo, captura con láser los subcampos del hipocampo CA1, CA2 y CA3 a partir de bregma 3.00 milímetros y utilizando la capa granular completamente formada del giro dentado como punto de referencia físico de identificación morfológica. Después de la recolección, mueva las cápsulas macro LCM a la posición de control de calidad e inspeccione la adherencia completa del tejido asegurándose visualmente de que el tejido cortado por UV esté adherido a la membrana.
Es imperativo que el láser UV corte alrededor de la totalidad del tejido. De lo contrario, el tejido se adherirá incompletamente al capuchón LCM. A continuación, coloque rápidamente cada tapa en un tubo de reacción de pared diluida de 0,5 mililitros libre de ARNasa que contenga 100 microlitros de tampón de lisus celular.
Agite las muestras brevemente para garantizar un lisus completo y almacene a menos 80 grados Celsius hasta que esté listo para realizar el análisis genómico posterior. Las siguientes son imágenes representativas de secciones de tejido recogidas del lado epcilateral del sitio de la lesión con funciones de láser infrarrojo y UV en el sistema LCM. Esta es un área de la corteza de asociación frontal.
Esta imagen muestra la misma región después de la recolección. Y este es el tejido en la tapa después de la recolección. Esta imagen muestra los componentes de las capas parameatales CA1, CA2 y CA3 del hipocampo ubicados junto a los cuernos completamente formados de la capa anual del giro dentado.
Se recolectaron las regiones CA2 y CA3 y estas poblaciones celulares se observan en el sombrero. Aquí, un área del núcleo accumbens proximal adrostral a la comisura anterior se ha reproducido fielmente en el sombrero. Por último, el núcleo rostral supraquiasmático al quiasma supraóptico fue capturado por LCM después de un TCE.
Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para procesar un cerebro en aproximadamente ocho horas. Eso incluye el procesamiento de tejidos, la tinción y el LCM. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis epigenético, para responder preguntas sobre los patrones de metilación o la expresión micrónica.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar LCM en múltiples regiones del cerebro en el mismo cerebro.
Resumen
Este artículo describe el uso de la microdisección por captura láser (LCM) para obtener poblaciones celulares específicas de diversas regiones cerebrales de rata con el fin de analizar la expresión génica y de microARN. La técnica mejora la comprensión de los impactos diferenciales de la lesión cerebral traumática (TBI) en distintas regiones cerebrales, como la corteza frontal y el hipocampo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Análisis Molecular
Antecedentes
- El TCE puede provocar diversos efectos en diferentes regiones del cerebro.
- Comprender estos efectos a nivel celular requiere técnicas de muestreo precisas.
- La MAC permite el análisis selectivo de tipos específicos de células sin contaminación.
- Este estudio conlleva implicaciones tanto prácticas como metodológicas para la investigación en neurociencia.
Objetivo del estudio
- Utilizar la microdisección por láser para aislar células cerebrales afectadas por el TCE.
- Analizar la expresión génica y de microARN relacionada con el TCE.
- Elucidar las consecuencias moleculares del TCE en áreas cerebrales selectivas.
Métodos Utilizados
- La microdisección por captura láser (LCM) es la plataforma principal utilizada.
- El modelo biológico consiste en tejidos cerebrales de rata, dirigiéndose específicamente a regiones afectadas por lesión cerebral traumática (TBI).
- El estudio establece líneas de tiempo críticas para la preparación del tejido, la sección y la tinción.
- Se enfatizan cuidadosas medidas para prevenir la contaminación a lo largo del protocolo.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de poblaciones celulares diana de regiones como la corteza frontal y el hipocampo.
- Conocimientos sobre los cambios inducidos por el TCE a nivel molecular, lo que apoya futuros estudios mecanicistas.
- Identificación de etapas críticas de corte y tinción para la recolección confiable de ARN.
Conclusiones
- El estudio demuestra cómo la microdisección por captura láser puede facilitar análisis moleculares dirigidos de los efectos del traumatismo craneoencefálico.
- Las implicaciones incluyen una mejor comprensión de los mecanismos neuronales afectados por la lesión.
- Este método mejora la precisión en la investigación en neurociencia y ofrece vías para la exploración terapéutica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microdisección por captura láser (LCM) permite un perfilado molecular preciso de regiones cerebrales discretas afectadas por una lesión cerebral traumática (TBI), apoyando la validación de dianas mediante el análisis espacialmente resuelto de la expresión génica y de microARN. Este enfoque reduce las señales confusas procedentes de tejidos heterogéneos, mejorando la confianza predictiva en la desactivación mecanicista de las vías asociadas a la TBI. Al aislar respuestas específicas de regiones procedentes del mismo animal, la LCM mejora la continuidad traslacional y la selección de carteras en el descubrimiento neurocientífico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de regiones afectadas por el TBI, como la corteza frontal y el hipocampo, para esclarecer las vías implicadas.
- Valor operacional: Proporciona una validación de dianas biológicamente más segura mediante un análisis molecular con resolución espacial, sin los artefactos derivados de la disociación del tejido.
- Valor predictivo: Facilita la selección de proyectos en cartera al vincular cambios en la expresión génica específicos de cada región con resultados funcionales en procesos ejecutivos y de memoria.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensayos genómicos posteriores mediante la preservación de la integridad espacial y la posición nativa de las regiones cerebrales.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad de los ensayos mediante la sección guiada por puntos de referencia anatómicos utilizando un atlas del cerebro de rata.
- Valor de escalabilidad: Permite la evaluación confiable de compuestos al proporcionar lecturas moleculares cuantitativas y específicas de regiones discretas del cerebro.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor Translacional: Mantiene la relevancia de la enfermedad al permitir el análisis de alteraciones inducidas por el TCE en la expresión génica y de microARN dentro de áreas cerebrales anatómicamente definidas.
- Continuidad Preclínica: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al permitir perfiles moleculares longitudinales desde la fase de descubrimiento hasta las etapas preclínicas.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Se centra en el valor predictivo al aislar cambios moleculares causales en regiones discretas, en lugar de promedios de tejido completo.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
La MAC se integra en el continuo de descubrimiento desde la identificación del blanco hasta la optimización del fármaco y la validación preclínica, permitiendo un análisis basado en hipótesis de los mecanismos del TCE en regiones cerebrales clave.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al aislar poblaciones celulares específicas de regiones afectadas por lesiones, como el núcleo accumbens central y el núcleo supraquiasmático.
- Selección: Garantiza la preparación del ensayo mediante seccionado estandarizado en coordenadas definidas de bregma y procesamiento libre de RNasas para obtener un rendimiento confiable de ARN.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes, incluyendo perfiles de expresión génica y de microARN a partir de tejido capturado con láser.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con trabajos preclínicos al permitir análisis epigenéticos y de metilación tras la microdisección láser, como se indica en el protocolo.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable en diversos modelos de enfermedad, con principios aplicables a estudios de expresión genómica en otros contextos de lesión o enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante la validación de objetivos y la reducción de ambigüedades mecanicistas en el análisis de vías de LEC.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad mediante corte con criostato, guía de atlas y protocolos controlados por RNasa.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases tardías mediante el aislamiento de respuestas moleculares específicas de cada región.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en la coincidencia de biomarcadores con resolución espacial.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en neuroanatomía, corte con criostato y manejo de instrumentación para microdisección láser.
- Depende de ambientes libres de RNasas, criostato a -20°C, medio de temperatura óptima para corte y sistemas láser UV/IR.
- Necesita estandarización entre equipos para los protocolos de tinción, recolección de secciones y carga de cubreobjetos en equipos de neurociencia y biología molecular.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen ajustar las coordenadas de corte basadas en el bregma para diferentes regiones cerebrales y modelos animales.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de un control minucioso de la contaminación y competencia técnica en el trazado con láser UV para lograr la adherencia completa del tejido.
