Microdisección de captura láser Atlas estereotáctico de regiones del cerebro afectadas por la lesión traumática
11 de septiembre de 2017
Describimos el uso del microdissection de la captura del laser para obtener muestras de poblaciones celulares distintas de regiones cerebrales diferentes para el análisis de gen y microRNA. Esta técnica permite el estudio de los efectos diferenciales de la lesión cerebral traumática en regiones específicas del cerebro de rata.
El objetivo general de este protocolo de microdisección por captura láser es recopilar células de regiones cerebrales específicas afectadas por una lesión cerebral traumática para su análisis molecular. Soy la doctora Helen Hellmich. Mi asistente de posgrado, Harris Weisz, quien es estudiante del programa de Fisiopatología Humana y Medicina Traductiva en la Escuela de Medicina de la Universidad de Texas, va a demostrar cómo utilizamos los métodos de microdisección por captura láser en nuestros estudios sobre lesiones cerebrales.
Este método podría ayudar a esclarecer los mecanismos y consecuencias de los cambios inducidos por el TCE en regiones cerebrales discretas, como la corteza frontal, que controla las funciones ejecutivas, y el hipocampo, que es importante para los procesos dependientes de la memoria. La ventaja principal de esta técnica es que podemos estudiar el efecto de un proceso patológico en múltiples regiones cerebrales discretas o en tipos celulares individuales a partir del mismo cerebro.
Antes de cualquier procedimiento de LCM que incluya análisis transcripcional, limpie todas las superficies con detergente RNace para mitigar el riesgo de contaminación y degradación del ARN. Retire el tejido cerebral del almacenamiento y colóquelo en un criostato enfriado a menos 20 grados Celsius.
Deje que el cerebro se equilibre a la temperatura de la cámara del criostato durante aproximadamente diez minutos. Coloque el cerebro, con el lado ventral hacia arriba, sobre una gasa colocada encima de la platina del criostato. Con una cuchilla de afeitar para ARN limpia, corte la porción posterior justo por delante del cerebelo y la porción justo anterior al quiasma óptico.
Coloque una pequeña cantidad de medio de temperatura óptima para corte en dos moldes criogénicos separados. Coloque el cerebro que contiene la corteza de asociación frontal y el núcleo accumbens central en el interior de uno de los moldes criogénicos con la cara inferior hacia abajo. Añada suficiente medio OCT para cubrir el tejido.
Repita este paso con el fragmento de tejido cerebral que contiene el hipocampo y el núcleo supraquiasmático. Deje que el medio OCT se congele completamente durante aproximadamente 20 minutos en el criostato. Una vez que el tejido y el medio OCT estén completamente congelados, exprima una pequeña cantidad de OTC sobre un cabezal de montaje.
Presione un molde criogénico congelado sobre la cabeza de montaje y deje que el OCT se congele completamente para que el molde que contiene el tejido quede firmemente unido a la cabeza. Fije el accesorio de la cabeza al soporte de corte y apriete el tornillo. Ajuste el ángulo de corte con respecto a la hoja del criostato mediante las palancas de ajuste para asegurar que los cortes se realicen de manera uniforme.
Establezca un grosor de corte de 30 micrones. Al cortar el bloque de tejido que contiene el hipocampo y el SEN, realice cortes hasta que el quiasma óptico esté aplanado en el bregma a 0,48 milímetros cuando el tercer ventrículo se vuelva evidente. Luego, recoja los cortes para el SEM desde este punto colocando suavemente sobre el tejido seccionado portaobjetos con membrana de naftalato de polietileno a temperatura ambiente.
Verifique visualmente la adherencia al portaobjetos confirmando que el tejido y el OTC se han fundido completamente sobre el portaobjetos. Almacene todos los portaobjetos con secciones de tejido en el criostato hasta la tinción. Detenga la recolección de secciones en el bregma 0,72 milímetros cuando comience la decusación supraóptica.
Para la recolección del hipocampo, seccione hasta que las astas de la capa de células granulares del giro dentado sean visibles en bregma 3,00 milímetros. Recolecte secciones hasta que los subcampos CA del hipocampo estén fusionados en las secciones coronales en bregma 4,78 milímetros. Esto permite la recolección completa del hipocampo bajo la craneotomía y el sitio de lesión.
Antes de la tinción, lave toda la vidriería y el área de tinción en una campana extractora con un detergente eliminador de RNasas. Saque el portaportas del criostato y colóquelo en la campana extractora. Deje que los portaobjetos se calienten durante 30 segundos.
Tiña los cortes con violeta de cresilo y aclárelos con solución salina. Deje que el portaobjetos con los cortes teñidos se seque al aire durante no más de diez minutos a temperatura ambiente en la campana extractora. Una vez secos, pase inmediatamente a la microdisección láser (LCM).
Antes de comenzar cualquier procedimiento de MAC para análisis de ARN, limpie el área de recolección y la zona alrededor del dispositivo con detergente eliminador de ARNasas y etanol al 100 %. Encienda el interruptor de alimentación de la unidad generadora de láser infrarrojo antes de encender la base del microscopio y permita que el sistema se inicialice antes de iniciar el software desde el escritorio. Una vez que el software se haya cargado y completado sus pasos de inicialización, abra el panel de configuración del software y presione el botón de posición actual del portaobjetos.
La plataforma modular se moverá a la posición donde se pueden cargar y descargar las tapas macro LCM y las portaobjetos. Coloque hasta tres portaobjetos con membrana de bolígrafo en los soportes con el borde mate orientado hacia la derecha. Seleccione el área de manejo de tapas y portaobjetos junto al portaobjetos correspondiente y haga clic en la casilla de verificación MEM para indicarle al software que se han cargado los portaobjetos de vidrio con membrana.
Luego, haga clic en la diapositiva deseada que se capturará primero. Para capturar una imagen en mosaico que muestre la ubicación y orientación del tejido para la colocación de las cápsulas, seleccione imagen en la barra de herramientas y elija adquirir vista general. Coloque el cursor sobre el área de la imagen en mosaico, haga clic derecho y seleccione colocar cápsula en el centro de la región.
El software colocará automáticamente una tapa sobre la posición seleccionada. Después de localizar los láseres infrarrojo y ultravioleta, seleccione la opción de dibujo a mano alzada en el panel de herramientas de selección. Utilizando un lápiz óptico en pantalla táctil, dibuje alrededor del perímetro de la región de interés asegurándose de no perder el contacto entre la pantalla táctil y la punta del lápiz óptico.
Asegúrese de conectar los puntos inicial y final. Para la recolección del hipocampo, capture con láser los subcampos hipocampales CA1, CA2 y CA3 comenzando en el bregma a 3.00 milímetros y utilizando la capa granular completamente formada del giro dentado como referencia anatómica física para la identificación morfológica. Después de la recolección, mueva los casquetes macro LCM a la posición de control de calidad e inspeccione la adherencia completa del tejido asegurando visualmente que el tejido cortado con UV esté unido a la membrana.
Es fundamental que el láser UV corte alrededor de la totalidad del tejido. La falta de hacerlo resultará en una adherencia incompleta del tejido al casquete de MAC. Luego, coloque rápidamente cada casquete en un tubo de reacción de paredes delgadas de 0,5 mililitros libre de ARNasas que contenga 100 microlitros de tampón de lisis celular.
Vortexe brevemente las muestras para asegurar una lisis completa y almacénelas a menos 80 grados Celsius hasta que estén listas para realizar el análisis genómico posterior. A continuación se muestran imágenes representativas de secciones de tejido obtenidas del lado epilateral del sitio de lesión con las funciones de láser infrarrojo y ultravioleta del sistema de microdisección por láser. Esta es una zona de la corteza de asociación frontal.
Esta imagen muestra la misma región después de la recolección. Y este es el tejido sobre el capuchón tras la recolección. Esta imagen muestra los componentes de las capas parameatales CA1, CA2 y CA3 del hipocampo ubicadas junto a los cuernos completamente formados de la capa granular del giro dentado.
Se recogieron las regiones CA2 y CA3, y estas poblaciones celulares se observan en el capuchón. Aquí, un área del núcleo accumbens, ubicada en la parte proximal adrostral a la comisura anterior, fue el objetivo y se ha reproducido fielmente en el capuchón. Por último, el núcleo supraquiasmático, situado en la parte rostral al quiasma supraóptico, fue capturado mediante microdisección láser tras la lesión cerebral traumática (TBI).
Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para procesar un cerebro en aproximadamente ocho horas. Eso incluye el procesamiento del tejido, la tinción y la microdisección láser. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis epigenético, para responder preguntas sobre patrones de metilación o expresión de microARN.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la MAC en múltiples regiones cerebrales del mismo cerebro.
Resumen
Este artículo describe el uso de la microdisección por captura láser (LCM) para obtener poblaciones celulares específicas de diversas regiones cerebrales de rata con el fin de analizar la expresión génica y de microARN. La técnica mejora la comprensión de los impactos diferenciales de la lesión cerebral traumática (TBI) en distintas regiones cerebrales, como la corteza frontal y el hipocampo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Análisis Molecular
Antecedentes
- El TCE puede provocar diversos efectos en diferentes regiones del cerebro.
- Comprender estos efectos a nivel celular requiere técnicas de muestreo precisas.
- La MAC permite el análisis selectivo de tipos específicos de células sin contaminación.
- Este estudio conlleva implicaciones tanto prácticas como metodológicas para la investigación en neurociencia.
Objetivo del estudio
- Utilizar la microdisección por láser para aislar células cerebrales afectadas por el TCE.
- Analizar la expresión génica y de microARN relacionada con el TCE.
- Elucidar las consecuencias moleculares del TCE en áreas cerebrales selectivas.
Métodos Utilizados
- La microdisección por captura láser (LCM) es la plataforma principal utilizada.
- El modelo biológico consiste en tejidos cerebrales de rata, dirigiéndose específicamente a regiones afectadas por lesión cerebral traumática (TBI).
- El estudio establece líneas de tiempo críticas para la preparación del tejido, la sección y la tinción.
- Se enfatizan cuidadosas medidas para prevenir la contaminación a lo largo del protocolo.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de poblaciones celulares diana de regiones como la corteza frontal y el hipocampo.
- Conocimientos sobre los cambios inducidos por el TCE a nivel molecular, lo que apoya futuros estudios mecanicistas.
- Identificación de etapas críticas de corte y tinción para la recolección confiable de ARN.
Conclusiones
- El estudio demuestra cómo la microdisección por captura láser puede facilitar análisis moleculares dirigidos de los efectos del traumatismo craneoencefálico.
- Las implicaciones incluyen una mejor comprensión de los mecanismos neuronales afectados por la lesión.
- Este método mejora la precisión en la investigación en neurociencia y ofrece vías para la exploración terapéutica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microdisección por captura láser (LCM) permite un perfilado molecular preciso de regiones cerebrales discretas afectadas por una lesión cerebral traumática (TBI), apoyando la validación de dianas mediante el análisis espacialmente resuelto de la expresión génica y de microARN. Este enfoque reduce las señales confusas procedentes de tejidos heterogéneos, mejorando la confianza predictiva en la desactivación mecanicista de las vías asociadas a la TBI. Al aislar respuestas específicas de regiones procedentes del mismo animal, la LCM mejora la continuidad traslacional y la selección de carteras en el descubrimiento neurocientífico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de regiones afectadas por el TBI, como la corteza frontal y el hipocampo, para esclarecer las vías implicadas.
- Valor operacional: Proporciona una validación de dianas biológicamente más segura mediante un análisis molecular con resolución espacial, sin los artefactos derivados de la disociación del tejido.
- Valor predictivo: Facilita la selección de proyectos en cartera al vincular cambios en la expresión génica específicos de cada región con resultados funcionales en procesos ejecutivos y de memoria.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensayos genómicos posteriores mediante la preservación de la integridad espacial y la posición nativa de las regiones cerebrales.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad de los ensayos mediante la sección guiada por puntos de referencia anatómicos utilizando un atlas del cerebro de rata.
- Valor de escalabilidad: Permite la evaluación confiable de compuestos al proporcionar lecturas moleculares cuantitativas y específicas de regiones discretas del cerebro.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor Translacional: Mantiene la relevancia de la enfermedad al permitir el análisis de alteraciones inducidas por el TCE en la expresión génica y de microARN dentro de áreas cerebrales anatómicamente definidas.
- Continuidad Preclínica: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al permitir perfiles moleculares longitudinales desde la fase de descubrimiento hasta las etapas preclínicas.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Se centra en el valor predictivo al aislar cambios moleculares causales en regiones discretas, en lugar de promedios de tejido completo.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
La MAC se integra en el continuo de descubrimiento desde la identificación del blanco hasta la optimización del fármaco y la validación preclínica, permitiendo un análisis basado en hipótesis de los mecanismos del TCE en regiones cerebrales clave.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al aislar poblaciones celulares específicas de regiones afectadas por lesiones, como el núcleo accumbens central y el núcleo supraquiasmático.
- Selección: Garantiza la preparación del ensayo mediante seccionado estandarizado en coordenadas definidas de bregma y procesamiento libre de RNasas para obtener un rendimiento confiable de ARN.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes, incluyendo perfiles de expresión génica y de microARN a partir de tejido capturado con láser.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con trabajos preclínicos al permitir análisis epigenéticos y de metilación tras la microdisección láser, como se indica en el protocolo.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable en diversos modelos de enfermedad, con principios aplicables a estudios de expresión genómica en otros contextos de lesión o enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante la validación de objetivos y la reducción de ambigüedades mecanicistas en el análisis de vías de LEC.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad mediante corte con criostato, guía de atlas y protocolos controlados por RNasa.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases tardías mediante el aislamiento de respuestas moleculares específicas de cada región.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en la coincidencia de biomarcadores con resolución espacial.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en neuroanatomía, corte con criostato y manejo de instrumentación para microdisección láser.
- Depende de ambientes libres de RNasas, criostato a -20°C, medio de temperatura óptima para corte y sistemas láser UV/IR.
- Necesita estandarización entre equipos para los protocolos de tinción, recolección de secciones y carga de cubreobjetos en equipos de neurociencia y biología molecular.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen ajustar las coordenadas de corte basadas en el bregma para diferentes regiones cerebrales y modelos animales.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de un control minucioso de la contaminación y competencia técnica en el trazado con láser UV para lograr la adherencia completa del tejido.
