Medición In Vivo cambios en los neurotransmisores extracelulares durante naturalmente gratificante comportamientos en hámsteres sirios femeninos

El objetivo general de este procedimiento experimental es medir la liberación de neurotransmisores en animales que se comportan despiertos. Aunque este video demuestra la aplicación a la neurociencia del comportamiento, con la capacidad de caracterizar la liberación de neurotransmisores específicos, en relación con eventos conductuales específicos, esta técnica se puede emplear en una variedad de otras subdisciplinas de la neurociencia, como con la inyección de medicamentos. La principal ventaja de esta técnica es su naturaleza llave en mano para medir la liberación casi en tiempo real de neurotransmisores in vivo.

Comience inyectando 500 microgramos de progesterona en 0,1 mililitros de aceite de semilla de algodón, por vía subcutánea, cuatro horas antes de la introducción del macho para inducir la receptividad sexual. Asegúrese de evaluar a cada animal al comienzo de la fase oscura de su ciclo diario, ya que los comportamientos sociales de los roedores están sujetos a alteraciones en condiciones de prueba de luz blanca y luz roja. Haga que las soluciones de calibración estén frescas el día de la prueba en tubos de centrífuga de vidrio de 20 mililitros.

Para la solución de analito, disuelva 7,4 miligramos de ácido L-glutámico en 10 mililitros de agua ultrapura invirtiendo suavemente el tubo. Luego, haga la solución de interferencia disolviendo 176,1 miligramos de AA en 10 mililitros de agua ultrapura. Configure la calibración colocando un agitador magnético en la base de un soporte de anillo de laboratorio básico.

Coloque un vaso de precipitados encamisado de 20 mililitros encima del agitador magnético y sujételo en su lugar con una abrazadera mediana de dos puntas. Conecte el vaso de precipitados encamisado a un baño de agua circulante para calentar la solución tampón a 37 grados centígrados. Agregue una barra agitadora magnética y 20 mililitros de solución salina tamponada con fosfato 100 milimolar, o PBS, en el vaso de precipitados encamisado.

A continuación, coloque el soporte de calibración del sensor en la parte superior del vaso de precipitados encamisado y coloque un preamplificador de calibración de cuatro canales en la parte superior, asegurándolo en su lugar con una abrazadera de ángulo recto. A continuación, conecte el preamplificador a un dispositivo de acondicionamiento y adquisición de datos para registrar los datos de calibración. Pruebe la sensibilidad de cada biosensor enzimático al glutamato antes del registro experimental colocando la sonda en el soporte de calibración, encima de un vaso de precipitados encamisado, sumergiendo la cavidad de detección y una parte del cable de referencia de cloruro de plata en la solución tampón.

Inicie una nueva grabación en la interfaz de la computadora utilizando un software de adquisición descargable de forma gratuita. Y luego, conecte cada sensor que se esté probando a un puerto en un preamplificador de calibración de cuatro canales. Permita que los sensores alcancen una línea de base estable.

Comience a agregar las inyecciones de analito cuando los sensores hayan alcanzado una línea de base estable. Utilice el orificio del soporte de calibración para introducir una punta de pipeta en la solución tampón. A continuación, utilice la herramienta de anotación rápida de teclas del software de grabación para anotar cuándo se realiza una inyección.

A continuación, realice 10 inyecciones micromolares de glutamato pipeteando 40 microlitros de la solución de analito en la solución tampón. Espere a que el sensor se estabilice entre adiciones. A continuación, añada tres inyecciones de solución de analito antes de añadir una sola inyección de la solución AA interferente.

Cubra la cámara de prueba con ropa de cama tomada de la jaula del animal. Retire el obdurador oclusivo de la cánula guía e inserte el electrodo de fibra de carbono o la sonda enzimática a través del eje guía. Conecte el sensor al sistema de grabación.

A continuación, estabilice la conexión del sensor atornillando un accesorio de clavija en el soporte de la cabeza. Luego, coloque al animal en la cámara de pruebas. Comience a grabar el video y la señal amperométrica bloqueada por tiempo en el programa de software.

Permita que el sensor se equilibre en el cerebro antes de las pruebas experimentales. Luego, introduzca un estímulo masculino en la cámara de prueba. Después de la primera monta con inserción del pene por parte del macho estímulo, continúe grabando durante 10 a 30 minutos adicionales, dependiendo de los objetivos experimentales.

Finalmente, después de las pruebas de comportamiento, desconecte el sensor hembra. Retire ambos hámsters de la cámara de prueba, así como la ropa de cama, para limpiar la cámara con etanol al 70%. Comience por ver y anotar los videos, utilizando software gratuito descargable comercialmente, en cámara lenta para codificar con precisión los comportamientos bloqueados en el tiempo de la señal amperométrica.

Anotar Comienza la lordosis en el encuadre cuando la hembra inicia una dorsiflexión de su espalda y desvía su cola hacia arriba. Anotar Fin de la lordosis cuando la hembra termina esta postura, lo que a menudo ocurre cuando la hembra se reajusta a otra ubicación en la cámara de pruebas. A continuación, anote Start AI cuando la hembra esté en la postura de lordosis y el macho mueva su hocico hacia la región anogenital de la hembra, donde puede haber olfateado, lamido o acariciado su región perineal.

Anotación Fin de la IA cuando el macho retira el hocico de la proximidad a la región anogenital de la hembra. A continuación, anote Iniciar montura cuando el macho se acerque y coloque sus patas delanteras sobre la hembra en una postura de montura, independientemente de la orientación del intento de montura. Del mismo modo, anote Iniciar la intromisión cuando el empuje exitoso obtiene el acceso del pene masculino montado a la vagina de la mujer.

Cuando corresponda, anote la eyaculación, que se puede notar mediante un movimiento de pisada con la pata trasera del macho. Por último, anote End Intromission y End Mount simultáneamente en el encuadre cuando el macho haya retirado sus dos patas delanteras y, por lo tanto, no tenga contacto con la hembra. Debido a la frecuente incapacidad de visualizar su retirada, codifique simultáneamente estos dos comportamientos para permitir la consistencia y la confiabilidad en los episodios de apareamiento.

En la pestaña de archivo, seleccione la función Exportar y elija la pestaña TSV para guardar las mediciones de voltaje como un archivo de extensión TSV. Abra cada archivo con un programa de hoja de cálculo y guárdelo como XLS/XLSX. Por último, agregue manualmente anotaciones para el inicio de la lordosis previa al apareamiento al mismo tiempo que comienza el comportamiento de la lordosis que también incluye un comportamiento de montura, y también al comienzo de una nueva sesión de apareamiento si la hembra permanece en la postura de lordosis .

Durante los episodios de apareamiento, la transitoriedad dopaminérgica en los titulares del núcleo surge durante la inserción vaginal, o intermedio, por parte del macho. Se ha observado un patrón similar en otros animales con respecto a la liberación de glutamato. Con una transitoriedad rápida que corresponde a interrupciones individuales en el núcleo dorsal accumbens durante un combate copulatorio.

Una vez dominada, esta técnica, sin incluir las cirugías estereotácticas preparatorias, se puede completar en un día. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que cada sensor funcione. Aunque este video muestra la grabación de una sola sonda, este enfoque se puede extender a la grabación dual simultánea.

Pero esto añade una capa de complejidad que no es trivial. Este video se muestra en condiciones de luz para facilitar la visibilidad. Sin embargo, llevamos a cabo nuestros experimentos de comportamiento en condiciones de oscuridad, y este parámetro puede modificarse en función de las necesidades experimentales específicas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis histológico posterior de los cortes de cerebro, con el fin de identificar y confirmar la ubicación exacta del sensor. Además, se puede realizar un análisis de datos adicional, utilizando los datos de comportamiento codificados, con respecto a cualquier parámetro que sea de interés. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la liberación de neurotransmisores, incluidos los neurotransmisores no electroactivos como el glutamato casi en tiempo real en animales que se comportan despiertos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo calibrar sondas glutamatérgicas, implantar sondas, ejecutar un experimento de comportamiento que mida los cambios en la liberación de neurotransmisores a diferentes componentes del comportamiento y codificar esos datos para su posterior análisis. No olvide que cuando trabaje con animales vivos, debe ser sensible a su comodidad y bienestar general para garantizar sus mejores resultados y los de los animales.