Name: Medición In Vivo cambios en los neurotransmisores extracelulares durante naturalmente gratificante comportamientos en hámsteres sirios femeninos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprende a medir la liberación de dopamina y glutamato en hámsteres sirios despiertos mediante amperometría de potencial fijo y biosensores enzimáticos. Este método ofrece alta resolución temporal para estudiar neurociencia conductual.

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Los autores desean agradecer a licenciatura Daniel Korus por su ayuda ejecutando el código Matlab y pregrado Alex Boettcher por su ayuda en el funcionamiento de los experimentos conductuales. Este proyecto es apoyado por NSF IOS 1256799 a R.L.M. y por el Instituto Nacional sobre abuso de drogas de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número T32DA007234.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque relativamente sencilla, algunos temas pueden surgir al utilizar esta técnica. En primer lugar, la colocación estereotáctica de las puntas de prueba debe ser precisa: a diferencia de microdialysis que muestras un radio más amplio del medio extracelular que rodea a la sonda, esta técnica sólo permite la medición de un neurotransmisor que entra en contacto directo con la sonda. En segundo lugar, en el caso de la grabación de la fibra de carbono, debido a la anchura pequeña de la fibra, puede ocurrir una falla, y la s...

La capacidad de medir la liberación de neurotransmisor en animales comportamiento despiertos permite a los investigadores vincular conductas específicas con patrones espaciales y temporales de la neurotransmisión, una poderosa herramienta para investigar los mecanismos y circuitos subyacentes tanto natural y conductas operante en tiempo real. Históricamente, se ha empleado microdiálisis para medir sustancias eléctricamente reactivas y no reactivas en el medio extracelular del cerebro1. Esta técnica utiliza un flujo continuo de una solución acuosa de composición iónica similar al líquido extracelular, a través de una sonda de microdiálisis compuesto por un pequeño eje con una punta de una fibra hueca semipermeable membrana2. Después de la inserción de la sonda, neurotransmisores u otros analitos de interés pueden cruzar la membrana semipermeable por difusión pasiva antes de ser recogidos a intervalos para posterior análisis por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), un técnica de química analítica utilizada comúnmente para separar, identificar y cuantificar los componentes de una mezcla heterogénea3.
Aunque la microdiálisis es una técnica sensible que puede utilizarse para medir cualquier analito de interés, la resolución temporal es baja, con tasas de muestreo máxima del orden de minutos a decenas de minutos1,2. La invención de la voltametría cíclica de barrido rápido (FSCV), una técnica que se basa en el potencial redox de las especies electroactivas, puede aclarar cerca de instantáneas concentraciones del analito de interés en el líquido extracelular. En breve (ver Robinson et al. 4 para una revisión extensa), se aplica un electrodo para subir y bajar la tensión de forma de onda triangular en una escala de tiempo rápido4. Cuando la tensión está en el rango correcto, el compuesto de interés varias veces es oxidado y reducido. Esta oxidación y reducción resulta en un movimiento de electrones que genera una pequeña corriente alterna. Analizar las tasas tendrá lugar en la escala de fracciones de segundos con la oxidación y la reducción de compuestos que ocurren en microsegundos. Restando el actual fondo creado por la punta de prueba de la corriente resultante, uno puede generar una tensión vs actual parcela única a cada uno de ellos. Debido a que la escala de tiempo de las oscilaciones de voltaje, estos datos pueden utilizarse para calcular una parcela de la corriente como función del tiempo. Por lo tanto, pueden determinarse las concentraciones relativas de los compuestos como el número de electrones transferidos en cada oxidación y reacción de reducción se conoce4.
Esta especificidad química y alta resolución temporal que FSCV una técnica poderosa para la detección del cambio de concentraciones químicas en vivo. Sin embargo, a pesar de estas múltiples ventajas, esta técnica requiere amplios conocimientos técnicos y equipo costoso y configuración. Además, nonelectroactive neurotransmisores (por ejemplo, glutamato) no se puede medir usando esta técnica. Afortunadamente, los avances tecnológicos en el campo de la electroquímica5, así como la comercialización de estos inventos, ha introducido un enfoque relativamente sencillo para medir no electroactivos neurotransmisores en animales comportamiento despiertos sin comprometer el temporal precisión, una técnica conocida como tecnología de biosensores enzimáticos. Esta técnica utiliza conversión enzimática del neurotransmisor nonelectroactive de interés en dos substratos, uno de los cuales es el peróxido de hidrógeno electroactivos que es detectado como una oxidación amperométrico actual generada un potencial aplicado5 . Biosensor comercialmente disponibles sondas (ver figura 1) medir selectivamente los analitos de interés competitivos reduciendo la contribución de interferentes endógenos. En el caso del glutamato, la contribución del ácido ascórbico interferencias comun (AA) se reduce competitivamente a la corriente medida por localizar Co oxidasa AA en la superficie enzimática activa del sensor, conversión de AA a no electroactivos dihydroascorbate y agua. Además, una capa de polímero Nafion cargada negativamente presente debajo de la capa de enzima excluye compuestos aniónicos endógenos.
Esta misma configuración experimental de biosensor puede medir electroactivos neurotransmisores como en la FSCV, pero en su lugar emplea un potencial fijo grabación6. En contraste con la tensión oscilante aplicada en FSCV, en una grabación de potencial fijo el voltaje se mantiene en el redox potencial para el analito de interés. Aunque es menos químicamente selectiva que FSCV como múltiples neurotransmisores pueden tener el mismo potencial, de redox en áreas del cerebro que abrumadoramente sesgan hacia un neurotransmisor, la naturaleza de la llave de este enfoque compensa la falta de química especificidad.
La capacidad de medir electroactivos y nonelectroactive liberación de neurotransmisor en casi en tiempo real y un enlace a eventos específicos de comportamiento proporciona una oportunidad para examinar la liberación de neurotransmisor convergentes. Este manuscrito detalla el uso de este sistema para interrogar la neurotransmisión de dopamina y glutamato en respuesta a la natural recompensa en hámsters comportamiento despiertos. El objetivo de este artículo es detallar el proceso de medición esta liberación de neurotransmisores durante el comportamiento sexual en hámsteres femeninos, con el objetivo de demostrar su viabilidad para examinar otros comportamientos y paradigmas experimentales.
Hámsters son un modelo ideal para su uso en grabaciones de electroquímicas Históricamente, se han empleado modelos de ratas y ratones en el estudio del comportamiento sexual. Estos roedores participan en una secuencia copulatoria dinámica, que involucra numerosos comportamientos de solicitud femenina que incluyen saltos entrando y oído ondulación para atraer al macho a perseguir y finalmente montar la hembra7. El montaje por el hombre (con o sin penetración vaginal) dura sólo unos segundos, durante el cual la hembra se dedica a su postura comportamiento sexual (denominada lordosis) también sólo durante unos segundos antes de volver a comportamientos de solicitud activa. Este patrón de comportamiento, compuesto por altos niveles de actividad intercalados con breves períodos de inmovilidad, es problemático para la medición de la neurotransmisión en comportamiento de animales. En primer lugar, puede haber artefactos de movimiento en las grabaciones de amperométricos que se relaciona con la actividad de los nervios. En segundo lugar, la locomoción se asocia con la liberación de neurotransmisores especialmente en ciertas regiones del cerebro. Por ejemplo, la liberación de dopamina se han unido a la actividad locomotriz en el estriado dorsal y ventral8,9, un hallazgo que formó la base para las mediciones de microdiálisis de dopamina después de psicoestimulantes administración10. Porque los comportamientos de la mujer típica solicitud en mosroedores de t implican altos niveles de actividad locomotora y son representados por la mayor parte de una prueba del comportamiento sexual de 10 minutos, esto hace difícil atribuir los cambios en la neurotransmisión a los componentes explícitos de comportamiento sexual que colectivamente sólo minutos.
Para analizar el perfil neuroquímico del comportamiento sexual femenino, este laboratorio buscó una especie en que existe mínima actividad locomotriz que acompañan el comportamiento sexual. La secuencia de copulación en hamsters sirios (Mesocricetus auratus) es ideal para grabaciones neuroquímicas debido a la falta de comportamientos solicitud típicamente visto en ratas y ratones11. Como consecuencia, hamsters hembra entrará y mantener la postura de lordosis para más de 9 minutos a 10 minutos de prueba sesión12. Con la falta de extraños movimientos locomotores por la mujer, en vivo pueden obtenerse grabaciones electroquímicas que pueden estar asociadas con los componentes de las interacciones sexuales con el varón.
Combates consistieron en hamsters Después de la introducción de un animal macho de estímulo en la cámara de prueba, el hombre inicialmente participarán en investigación de anogenital (IA) de la hembra antes de montar su (elfigura 2A). En orden para el macho de Monte, la mujer debe asumir una postura sexual receptiva conocida como lordosis, en la que arquea su espalda y su cola se desvía para que el hombre de montaje puede acceder pene a su vagina. El macho montará mujer, juntando su trasero con ambas patas (figura 2B) y comenzar a empujar en un intento por ganar la intromisión del pene (figura 2C). El macho Monte a la hembra (sin inserción), y se intromit varias veces antes de alcanzar finalmente la eyaculación. Esta secuencia de Montes y de intromisiones a la eyaculación se denomina una "pelea de copula". Los machos tendrá varios combates consistieron en una sola sesión.

<table><tbody><tr><td>Nembutal</td><td>Oak Pharmaceuticals Inc.</td><td>76478-501-50 Inyección de</td><td>pentobarbital sódico, USP. Este laboratorio utiliza 8,5 mg/100 g de peso corporal, inyectado por vía intraperpertina.</td></tr><tr><td>Loxicom analgésico&nbsp;</td><td>Laboratorios Norbrook&nbsp;</td><td>6451603670</td><td>AINE antiinflamatorio y analgésico utilizado para el control del dolor postoperatorio. Genérico: meloxicam.</td></tr><tr><td>Antibiótico Enroflox&nbsp;</td><td>Laboratorios Norbrook&nbsp;</td><td>5552915411</td><td>Antibiótico fluoroquinolona para la prevención de infecciones postoperatorias. Genérico: Enrofloxacina.</td></tr><tr><td>Beuthanasia-D&nbsp;</td><td>Merck Animal Health</td><td>00061047305</td><td>Pentobarbital Sodio, Fenitoína Sódica agente de eutanasia.</td></tr><tr><td>Tornillos para huesos</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>8111-16</td><td>Tornillo óseo de 1/8" (Paquete de 16) utilizado para fijar la tapa del cráneo al cráneo.</td></tr><tr><td>Acrílico dental (Bosworth Duz-All)</td><td>Bosworth&nbsp;</td><td>166261C&nbsp;</td><td>El acrílico dental autocurable se utiliza en la construcción de una tapa de cráneo para fijar la cánula y el montaje de la cabeza al cráneo.</td></tr><tr><td>Configuración de biosensores de hardware&nbsp;</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>8400-K2</td><td>Pinnacle ofrece kits de hardware completos para nuevos usuarios de nuestro sistema de biosensores atados para ratas. Los kits incluyen un conmutador, un preamplificador y un sistema de acondicionamiento y adquisición de datos</td></tr><tr><td>Paquete de computadora de video base</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>9000-K1</td><td>El paquete básico de computadoras incluye una computadora preconfigurada con amplio almacenamiento en disco duro, un monitor de alta definición, un teclado y un mouse, una fuente de alimentación ininterrumpida y todos los cables necesarios.</td></tr><tr><td>Paquete de cámara Video EQ700 EverFocus</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>&nbsp; 9000-K10&nbsp;</td><td>La cámara de caja con capacidad de visión nocturna EQ700 con fuente IR independiente se obtuvo como parte del paquete de computadora de video Pinnacle. Las opciones de cámara domo (9000-K9) y cámara HD (9000-K11) también están disponibles.</td></tr><tr><td>Sirenia Software de adquisición</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>Gratis--disponible para descargar desde pinnaclet.com</td><td>Sirenia&nbsp; Acquisition proporciona una plataforma única para registrar datos de cualquier sistema de hardware de Pinnacle. El software cuenta con sincronización de todos los flujos de datos, ajustes configurables por el usuario, consolidación de datos y múltiples opciones de exportación. Además, el software incluye módulos básicos de revisión y análisis para los registros de biosensores. Sirenia&nbsp; Ofrece software LL-in-One gratuito que es ideal para la adquisición y revisión de datos.</td></tr><tr><td>Rata atada&nbsp; in vitro&nbsp; kit de calibración</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7000-K2-T-BAS&nbsp;</td><td>Con el fin de relacionar los cambios actuales medidos por un biosensor con los cambios reales en la concentración de analito, es necesario calibrar el biosensor antes de su implantación en el animal. El proceso también confirma la integridad y selectividad de los sensores. El kit de calibración incluye vaso de precipitados encamisado de 20 mL (#7058), barra agitadora magnética de 1/2" por 1/8" (#7059), abrazadera de ángulo recto (#7056), pinza de ajuste simple de 2 clavijas (#7055), preamplificador de calibración de 4 canales (#7053) y soporte de calibración (#7051).&nbsp;</td></tr><tr><td>Plato de revuelto &nbsp;</td><td>Corning</td><td>6795-410D</td><td>Agitador digital Corning, 5" x 7", 120 VAC utilizado para hacer girar el agitador magnético en un vaso de precipitados encamisado durante la calibración in vitro de biosensores de glutamato.</td></tr><tr><td>Baño de agua con capacidad de circulación de circuito cerrado</td><td>PolyScience</td><td>8006A11B</td><td>PolyScience 8006A11B 6L Baño de circulación calentado digital estándar, se utilizó un baño de agua de 120VAC con tubos de plástico para calentar el vaso de precipitados encamisado a la temperatura fisiológica.</td></tr><tr><td>Sensor de fibra de carbono con cánulas para ratas BASi</td><td>Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7002-CFS</td><td>Electrodo de fibra de carbono utilizado para registrar la neurotransmisión de dopamina.</td></tr><tr><td>Electrodo de referencia Ag/AgCl</td><td>Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7065</td><td>Necesario para grabaciones de fibra de carbono.</td></tr><tr><td>Biosensores de glutamato&nbsp;</td><td>Tecnología Pinnacle, Inc.</td><td>7001 y nbsp;</td><td>Sonda biosensora enzimática utilizada para el registro de la neurotransmisión glutamatérgica.</td></tr><tr><td>Cánulas guía BASi</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7030&nbsp;</td><td>Cánulas guía implantadas en la región cerebral de interés para guiar la sonda.</td></tr><tr><td>Cabezal de plástico de cánula BASi para ratas&nbsp;</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7011 y nbsp;</td><td>El montaje en cabeza estabiliza la sonda y se conecta al potenciostato.</td></tr></tbody></table>

medición in vivo cambios en los neurotransmisores extracelulares durante naturalmente gratificante comportamientos en hámsteres sirios femeninos

Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters

La capacidad de medir la liberación de neurotransmisores en una escala de tiempo rápida permite patrones de neurotransmisión vinculados a comportamientos específicos o manipulaciones; una herramienta poderosa en la aclaración de mecanismos y circuitos subyacentes. Mientras que la técnica de microdiálisis se ha utilizado durante décadas para medir casi cualquier analito de interés en el cerebro, esta técnica está limitada en resolución temporal. Por otra parte, voltametría cíclica de barrido rápido es temporal precisa y extremadamente sensible; sin embargo, porque este método técnicamente difícil se basa en la electroactivity del analito de interés, se elimina la posibilidad de detectar sustancias nonelectroactive (por ejemplo, el neurotransmisor glutamato). Este documento detalla el uso de un sistema de llave en mano que combina el potencial fijo Amperometría y enzimática biosensores para medir neurotransmisores electroactivos y nonelectroactive con precisión temporal. El apareamiento de estas dos técnicas de gran alcance permite la medición de neurotransmisión fásica y tónico con relativa facilidad y permite la grabación de múltiples neurotransmisores simultáneamente. El objetivo de este manuscrito es demostrar el proceso de medición de dopamina y glutamato neurotransmisión en vivo mediante un comportamiento naturalmente gratificante (es decir, comportamiento sexual) en hámsteres femeninos, con el objetivo de mostrar la viabilidad técnica de este ensayo para examinar otros comportamientos y paradigmas experimentales.

Usando el electroquímico y conductual codificación metodología descrita anteriormente, este laboratorio ha comenzado a caracterizar las fluctuaciones fásicas de dopamina y glutamato y tónico durante grabaciones en vivo de comportamiento sexual. Debido a la manera temporal precisa de esta metodología, con mayor precisión podemos caracterizar la neurotransmisión durante el comportamiento sexual; así como atribuir cambios específicos en los patrones de liberación a los correspondien...

Este documento detalla el uso de grabaciones de potencial fijo amperométrico utilizando electrodos de fibra de carbono y la tecnología de biosensores enzimáticos para medir la liberación de dopamina y glutamato con alta resolución temporal durante el comportamiento natural de gratificante en el hamster hembra.

Medición In Vivo cambios en los neurotransmisores extracelulares durante naturalmente gratificante comportamientos en hámsteres sirios femeninos

The ability to measure neurotransmitter release on a rapid time scale allows patterns of neurotransmission to be linked to specific behaviors or ...

El objetivo general de este procedimiento experimental es medir la liberación de neurotransmisores en animales despiertos y con comportamiento activo. Aunque este video demuestra su aplicación en neurociencia del comportamiento, con la capacidad de caracterizar la liberación específica de neurotransmisores en relación con eventos conductuales concretos, esta técnica puede emplearse en diversas subdisciplinas de la neurociencia, como en estudios con inyección de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es su naturaleza inmediata para medir la liberación de neurotransmisores en tiempo casi real in vivo.Comience inyectando 500 microgramos de progesterona en 0,1 mililitros de aceite de semilla de algodón, por vía subcutánea, cuatro horas antes de la introducción del macho para inducir la receptividad sexual. Asegúrese de evaluar a cada animal al inicio de la fase oscura de su ciclo diario, ya que los comportamientos sociales de los roedores están sujetos a alteraciones bajo condiciones de prueba con luz blanca y luz roja. Prepare las soluciones de calibración frescas el día de la prueba en tubos de centrífuga de vidrio de 20 mililitros.Para la solución de analito, disuelva 7,4 mi

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Investigación

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Neurociencia

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Este artículo describe un nuevo protocolo para la medición cuantitativa de la motivación social en ratones utilizando el condicionamiento operante para una recompensa social. El protocolo es útil para la medición de la motivación social en modelos de ratón de autismo y otros trastornos del comportamiento social.

La cuantificación de la motivación social en ratones utilizando Condicionamiento operante

Se describe un protocolo para inducir gratificante y nonrewarding experiencias en moscas de la fruta (Drosophila melanogaster), utilizando el consumo voluntario de etanol como una medida de los cambios en los estados de recompensa.

Una manera sencilla de medir alteraciones en el comportamiento de búsqueda de recompensa Uso<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este protocolo mide aprendizaje espacial y memoria con el laberinto de Barnes. Un nuevo paradigma de Damsel en señal de socorro se utiliza para evaluar la actividad locomotriz y conducta prosocial en ratones.

Analizar el aprendizaje espacial y el comportamiento Prosocial en los ratones con el laberinto de Barnes y paradigmas de la damisela en peligro

El protocolo presentado aquí proporciona información sobre la electroencefalografía simultánea (EEG) y la evaluación del comportamiento en tiempo real. Hemos discutido todos los pasos involucrados en este protocolo como una solución atractiva para los investigadores en muchos campos de la neurociencia, particularmente en las áreas de aprendizaje y memoria.

Monitoreo simultáneo de electrofisiología inalámbrica y prueba de comportamiento de memoria como herramienta para estudiar la neurogénesis del hipocampo

Los modelos de roedores son herramientas valiosas para estudiar los comportamientos básicos relacionados con el trastorno del espectro autista (TEA). En este artículo, exponemos dos pruebas de comportamiento para modelar las características principales del TEA en ratones: el autoacicalamiento, que evalúa el comportamiento repetitivo, y la prueba de interacción social de tres cámaras, que documenta las deficiencias sociales.

Estrategias para evaluar comportamientos similares al autismo en ratones

Se estableció un modelo de atracones en ratones utilizando el acceso intermitente a M&amp;M's (un alimento altamente palatable hecho de grasa y azúcar). Los ratones con acceso intermitente a este alimento rico en grasas y azúcares mostraron comportamientos similares al estrés, una mayor ingesta calórica y una preferencia por ese alimento sobre la comida estándar en comparación con los ratones con acceso continuo o nulo a la comida.

Modelo de ingesta de atracones intermitentes en ratones

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

Aprende a medir la liberación de dopamina y glutamato en hámsteres sirios despiertos mediante amperometría de potencial fijo y biosensores enzimáticos. Este método ofrece alta resolución temporal para estudiar neurociencia conductual.

Medición In Vivo cambios en los neurotransmisores extracelulares durante naturalmente gratificante comportamientos en hámsteres sirios femeninos (Video) | JoVE Journal

Medición In Vivo cambios en los neurotransmisores extracelulares durante naturalmente gratificante comportamientos en hámsteres sirios femeninos

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