Planta promotor análisis: Identificación y caracterización del promotor de la raíz específica de nódulo en el frijol común

Las raíces peludas se utilizan para obtener raíces transformadas en Phaseolus con una construcción reportera. Las raíces transgénicas resultantes se utilizan para examinar la expresión del gen reportero. Los estudios de expresión de promotores son cruciales para comprender los patrones de expresión espacio-temporal de los genes.

Hoy vamos a demostrar las metodologías para la inducción de raíces pilosas y estudiar los patrones de expresión de promotores en raíces pilosas transgénicas bajo condiciones simbióticas de nódulos radiculares en Phaseolus. Estrada-Navarrete y sus colegas han establecido previamente el sistema de raíces pilosas inducidas por Agrobacterium rhizogenes en Phaseolus. El método actual ayudará a acelerar la duración de la inducción de la raíz pilosa y, por lo tanto, mejorará la versatilidad del sistema.

Los encargados de demostrar los procedimientos estarán a cargo de mi colega Manoj-Kumar Arthikala y las estudiantes de pregrado Alma Leticia y Brenda Mariana de mi laboratorio. Para empezar, busque la secuencia del gen NIN en la base de datos del genoma de Phaseolus vulgaris de Phytozome y seleccione la longitud requerida de la secuencia aguas arriba de ATG. Diseñar los oligonucleótidos siguiendo el análisis de la secuencia promotora adecuada.

El ADN genómico de Phaseolus recién preparado servirá como plantilla para la PCR y amplificar la secuencia del promotor. Prepare la mezcla maestra de PCR con polimerasa Taq de alta fidelidad y componentes de PCR estándar, junto con los oligonucleótidos previamente diseñados. Aliquotar la mezcla maestra en tubos de PCR de 2 mL, y realizar la amplificación del fragmento promotor en un termociclador y con un programa adecuado.

Separar el producto de PCR electroforéticamente en un gel de agarosa al 1,2%. Visualice el fragmento de NIN amplificado a 700 pares de bases bajo transiluminación UV. Escide, eluya y clone el fragmento en el vector de entrada de puerta de enlace vector pENTR/D-TOPO siguiendo las instrucciones estándar.

Transforme dos microlitros de la mezcla de reacción en células de E. coli competentes a 42 grados Celsius durante 50 segundos, y coloque la E. coli transformada en LB suplementada con 50 miligramos por litro de kanamicina. Cultive las células plateadas a 37 grados centígrados durante la noche. Realizar una reacción de PCR para plásmidos aislados de colonias de E. coli seleccionadas al azar utilizando oligonucleótidos M13.

El fragmento a 1024 pares de bases debe indicar clones positivos. Realice la reacción LR entre el clon de entrada positivo y el vector binario de destino. Transformar dos microlitros de mezcla de reacción en E. coli y seleccionar las colonias con 100 miligramos por litro de espectinomicina a 37 grados centígrados.

Amplifique los plásmidos con oligonucleótidos específicos de NIN. El clon positivo debe amplificarse a 700 pares de bases. Secuenciar y verificar la exactitud del fragmento de clon.

Movilizar la construcción del promotor de NIN en células electrocompetentes de Agrobacterium rhizogenes K599. Y una vez más, confirmar el clon con oligonucleótidos específicos del promotor. El azufre esteriliza las semillas de Phaseolus vulgaris y germina en papeles de filtro estériles y húmedos durante dos días en la oscuridad a 28 grados centígrados.

Esparcir 150 microlitros de células de Agrobacterium rhizogenes con construcción de NIN y vector de control en placas LB con selección de espectinomicina. Cultive el cultivo durante la noche a 28 grados centígrados. Cubra las plántulas de Phaseolus y raspe las células de Agrobacterium rhizogenes con una punta doblada de 200 microlitros del plato.

Y vuelva a suspender en el tubo Eppendorf con un ml de agua destilada estéril. Recoja las células de Agrobacterium rhizogenes en una jeringa de tres ml y coloque las plántulas de Phaseolus en un tubo previamente preparado. Pinchar ligeramente los hipocótilos de las semillas germinadas con la punta de la aguja, inyectando simultáneamente las células de Agrobacterium rhizogenes.

Se debe tener cuidado de que la aguja no pase a través del hipocótilo. Mantenga las plántulas inyectadas en una cámara de crecimiento a 28 grados centígrados con 16 horas de luz y ocho horas de fotoperiodo oscuro. El callo en los hipocótilos heridos debe ser visible entre cinco y siete días.

Después de dos semanas, retire la raíz primaria cortando el tallo dos centímetros por debajo de las raíces peludas y trasplántelas a macetas que contengan vermiculita estéril. Simultáneamente, inocular las plantas con un ml de Rhizobium tropici para inducir la nodulación. Asegúrese de diluir el cultivo de Rhizobium a 6 a DO 600.

Mantenga las plantas en una cámara de crecimiento a 28 grados centígrados, 16 horas de luz y ocho horas de fotoperiodo oscuro, y riegue con solución B y D. Para estudiar los patrones de expresión espacio-temporal del promotor de NIN, el muestreo se realiza en diferentes puntos temporales. Saque las plantas sin dañar las raíces y lave las raíces sin motas de vermiculita.

Seleccione aleatoriamente las raíces de las plantas NIN y de control, y proceda a la tinción histoquímica de GUS incubando las muestras en tampón de ensayo GUS a 37 grados Celsius durante 16 horas en la oscuridad. Observe las raíces teñidas con GUS bajo microscopio estereoscópico y compuesto. Esta imagen muestra la expresión del promotor de NIN inducida por Rhizobium en las raíces primarias.

La expresión del promotor de NIN también se pudo observar en las células ciliadas de la raíz infectadas con Rhizobium. Además, la expresión de GUS se puede documentar en diferentes etapas del desarrollo del nódulo radicular. No se observó expresión de GUS en las raíces de control vectorial.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión del diseño de sus construcciones promotoras y el estudio de los patrones de expresión del promotor en raíces pilosas transgénicas de Phaseolus. Este sistema podría extenderse aún más para estudiar los patrones de expresión de promotores bajo otras interacciones simbióticas y patógenas en Phaseolus y también en otras eudicotiledóneas.