Name: Planta promotor análisis: Identificación y caracterización del promotor de la raíz específica de nódulo en el frijol común (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprende a inducir raíces pilosas en frijol común con Agrobacterium rhizogenes para caracterizar promotores específicos de nódulo. Este protocolo permite estudiar patrones de expresión génica en simbiosis.

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Este trabajo fue parcialmente financiado por la Dirección General de Asuntos del Personal Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (no de la concesión. IN219916 M.L y IA205117 a M-K. A) y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (beca CONACYT no. 240614 a M.L.).

1. identificación, aislamiento y clonación de P. Vulgaris NIN promotor
<ol>
	<li>Identificar la secuencia del promotor del gen de interés. Hay varias bases de datos del genoma y las herramientas de análisis disponibles para las plantas tales como Phytozome, plantas de Ensembl, NCBI, etc. A leguminosas promotor p. vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) fue utilizado en este estudio20.</li>
	<li>Diseño de oligos para la puerta de enlace o tradicional enzima de restricción dependiendo del sistema de vectores de clonación utilizados (figura 1A). Nota: Estándar (25-35 bp), desalado iniciadores trabajan bien. Secuencias de oligo Reverse que bordean entre el promotor y el gen son recomendables.</li>
	<li>Amplificar la región promotora de PvNIN (o región del promotor del gen de interés) de recién aislados de p. vulgaris DNA genomic usando el promotor específico oligo. Uso de una polimerasa de alta fidelidad con las siguientes condiciones PCR: 95 ° C por 5 min; 30 ciclos (95 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 1 min); y 72 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>El fragmento amplificado en gel de agarosa al 1% a los 60 V en una bandeja de gel de 7 x 10 cm y eluir el amplicón correspondiente (700 bp, figura 1B) y el clon en el vector D/pENTR-TOPO según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Transformar 2 μl de la reacción en competente Escherichia coli las células utilizando las instrucciones del fabricante y placa 150 μL de la mezcla de transformación el hermano de la Lisogenia (LB) suplementado con kanamicina 50 mg/L (Kan50). Crecen las células plateadas a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Toma 3-6 colonias y cultura que durante la noche en medio LB con Kan50. Plásmido ADN mediante el método de elección de aislar y analizar el plásmido por PCR con los oligos M13 específico de vector. Para PCR, uso 100 ng de plásmido, 12:03 de oligos, 10 X buffer PCR 0,5 U de Taq ADN polimerasa y 10 mM dNTPs.</li>
	<li>Utilice las siguientes condiciones de amplificación de PCR; 95 ° C por 3 min; 30 ciclos (95 ° C por 30 s, 58 ° C por 30 s, 72 ° C durante 75 s); y 72 ° C por 7 minutos visualizar los productos PCR en gel de agarosa al 1%. Asegúrese de que las inserciones correctas tienen una banda en 1.024 bp y vectores sin voluntad insertos una banda 324 de bp (figura 1).</li>
	<li>Realizar la reacción de la LR entre un vector de entrada (pENTR/D-TOPO-PvNIN) y destino de vectores pBGWFS7.021 utilizando una mezcla de enzima comercial según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Transformar 2 μl de reacción de LR en competentes de e. coli las células utilizando técnicas estándar como se describe en las instrucciones y placa 150 μL de mezcla de transformación LB suplementado con 100 mg/L de espectinomicina (Spe100). Crecen las células plateadas a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Recoger aproximadamente 5 colonias y de la cultura les durante la noche en medio LB con Spe100. El plásmido de ADN usando un método de elección de aislar y analizar el plásmido por PCR con los oligos específicos del promotor.</li>
	<li>Utilizar las condiciones de la PCR en el paso 1.3. Visualizar los productos PCR en gel de agarosa al 1% para confirmar la amplificación. Amplicons son 700 bp.</li>
	<li>La secuencia del plásmido positivas pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (figura 1) con los oligos específicos del promotor para verificar la autenticidad de la pieza de inserción.</li>
	<li>Transformar la plásmidos en a. rhizogenes cepa K599 (sin embargo, se pueden utilizar cualquier otra de las cepas de a. rhizogenes ). Añadir 2 μl de la preparación de plásmido a 50 μl de células de espectro y electroporate en una cubeta de 1 mm con la configuración siguiente: 1,8 kV, 25 μF y 200 Ω.</li>
	<li>Recupera las células en ~ 500 μl de medio SOC y agitar a 28 ° C por 2 h. placa LB-Spe100 y crecer a 28 ° C durante 2 días.</li>
	<li>Proyección de la Colonia como se menciona en el paso 1.7 y las condiciones de la PCR como en el paso 1.3. Hacer acciones de glicerol de clones positivos y almacenarlas a-80 ° C.</li>
	<li>Uso de a. rhizogenes cultura albergando vector pBGWFS7.0 vacío como control negativo.</li>
</ol>
2. A. Rhizogenes transforman melenudas raíces de frijol común
<ol>
	<li>Esterilizar las semillas de frijol (p. vulgaris variedad Negro Jamapa) (aproximadamente 20) en 50 mL de etanol al 96% durante 1 min y descartar el etanol; Añada 50 mL de lejía (hipoclorito sódico) de 20% por 10 min, con una mezcla constante en campana de flujo laminar. Quitar el cloro y lavar en exceso agua estéril 3 veces. Nota: Otros cultivares de p. vulgaris pueden utilizarse para la inducción de raíz melenuda.</li>
	<li>Germinar las semillas estériles en los papeles de filtro estériles humedecidos con Broughton &#38; Dilworth (B &#38; D) solución22 (tabla 1) por 2 días en la oscuridad a 28 ° C.</li>
	<li>El día antes de transformación preparar lo siguiente:
	<ol>
		<li>Raya a 150 μL del cultivo de a. rhizogenes albergando el vector binario (preparado en los pasos 1.13 y 1.14) en Spe100 LB sólido y crece a 28 ° C durante la noche.</li>
		<li>Llene un tubo de 15 mL con B &#38; solución D y volver a colocar la caperuza a rosca con doble capa de aluminio. Este montaje en un tubo de vidrio de 22 cm que contiene 10 mL de B &#38; D solución (figura 2) y autoclave.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>En el día de transformación, ensamble los siguientes materiales estériles en campana de flujo laminar: germinaron las semillas en el paso 2.2, placa de cultivo de paso 2.3.1, tubos de paso 2.3.2, agua bidestilada estéril (10 mL), pipetas y puntas de pipeta, pinzas estériles, y jeringas de 3 mL.</li>
	<li>Utilice una punta de 200 μL doblada para raspar las células de a. rhizogenes de la placa en un tubo de microcentrífuga y resuspender en 1 mL de agua estéril doble. Del mismo modo, preparar a las células del control vectorial por separado.
	<ol>
		<li>Mezclar las células suavemente para resuspender. No no agitar con vortex.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hacer un agujero de 3 mm en el papel de aluminio de los tubos de paso 2.3.2 utilizando una pipeta estéril.</li>
	<li>Recoger las células (ya sea promotor o vector control) de paso 2.5 con la jeringa y pinchar ligeramente los hypocotyls de semillas germinadas con la punta de la aguja (figura 2). Nota: Asegúrese de que la aguja penetra en el tejido vascular (4 - 6 veces) e inyectar pequeñas (~ 5 μl) gotas de las células de la herida en diferentes posiciones alrededor del hipocótilo.</li>
	<li>Inserte con cuidado las raíces de las plántulas inyectadas en el agujero de 3 mm de tubo de 15 mL que contiene el B &#38; solución D. Volver la configuración entera en 22 mL tubos de cristal y junta para mantener la humedad.</li>
	<li>Incubar los tubos en una cámara de crecimiento mantenida a 28 ° C con 16 h de luz: 8 h fotoperíodo oscuro. Notas: 3-4 días después de la incubación, las plantas crecen en el borde de los tubos de vidrio de 22 mL.</li></ol>En esta etapa, retire las tapas y selle el borde con parafilm alrededor del tallo como se muestra en la figura 2I.
	<li>Observar el callo en los sitios de herida al 5-7 días y encontrar ~ raíces peludas 2 cm por 10-12 días después de la transformación. Nota: Es importante mantener la B &#38; solución D constantemente en tubos de plástico y vidrio.</li>
	<li>Después de 2 semanas, retire la raíz primaria cortando el tallo 2 cm por debajo de las raíces pilosas y las raíces primarias del trasplante en macetas con vermiculita estéril. Mantener las plantas en una cámara de crecimiento (16 h luz: 8 h oscuro a 28 ° C) y regar con B &#38; solución D.</li>

3. promotor análisis: NIN promotor expresión en rizobios nódulos de frijol común
<ol>
	<li>Para la inducción de nódulos radiculares, inocular Rhizobium tropici o Rhizobium etli (que son compatibles con el frijol común) en 100 mL de medio PY (peptona 0.5 g, extracto de levadura 0,3 g) suplementado con 700 mM de CaCl2 y 20 mg mL−1 ácido nalidíxico. Incubar a 30 ° C por 24 h con agitación a 300 rpm. Nota: Cualquier antibióticos específicos podrían utilizarse en el caso de transgénicos Rhizobium.</li>
	<li>Sedimenten las células en una centrifugadora durante 3 min a 2.800 x g a temperatura ambiente y resuspender en 10 mL de 10 mM de MgSO4. Ajustar la do de las células a 0.6 a OD600 por dilución con 10 mM MgSO4.</li>
	<li>Inocular 1-2 mL de cultivo (preparado en el paso 3.2) por planta (promotor y vector control) para inducir el crecimiento de nódulos en las raíces pilosas. Regar las plantas con B &#38; solución D con nitrógeno limitada (2 mM KNO3) promover la nodulación.</li>
	<li>Dependiendo de la necesidad experimental, recoger las raíces pilosas en diferentes puntos temporales. Recogemos muestras para el estudio de hilos de infección entre 3-5 días post inoculación (dpi). Nota: Nódulo Primordial y pequeños nódulos pueden ser estudiados en 6-9 PPP y dpi 10-12 días, respectivamente. Por último, madurados y funcionales de los nódulos pueden ser estudiados en 14-21 dpi y nódulos senescentes en &#62; 28 dpi.</li>
	<li>Proceso de los raíz, nódulos para la actividad de los genes del reportero (GUS o GFP). Analizar la actividad de GUS según el protocolo descrito por Jefferson23. Observar GFP bajo el microscopio de fluorescencia. Excitar la fluorescencia de GFP con un láser de ion argón azul (488 nm) y recoger la fluorescencia emitida de 510 a 540 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+promoters+and+cis-actingregulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements.</a> Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).</li>
<li>Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+Thirst+for+Genome+Sequencing%2C+Data+Interpretation%2C+and+Database+Usage+in+Genomic+Era%3A+The+Road+towards+Fast-Track+Crop+Plant+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+Research+International%22%5BJournal%5D)">Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement.</a> Genetics Research International. , 684321(2015).</li>
<li>Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplast+isolation%2C+transient+transformation+of+leaf+mesophyll+protoplasts+and+improved+Agrobacterium-mediated+leaf+disc+infiltration+of+Phaseolus+vulgaris%3A+Tools+for+rapid+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis.</a> BMC Biotechnol. 16 (1), 53(2016).</li>
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<li>Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulation+of+cortical+cell+division+during+root+nodule+development+in+Lotus+japonicus+is+accompanied+by+auxin+response%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response.</a> Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).</li>
<li>Suzaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoreduplication-mediated+initiation+of+symbiotic+organ+development+in+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus.</a> Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).</li>
<li>Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-affinity+phosphate+transporter+GmPT5+regulates+phosphate+transport+to+nodules+and+nodulation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean.</a> Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).</li>
<li>Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Functional+Analysis+of+a+Novel+Group+of+Legume-specific+WRKY+and+Exo70+Protein+Variants+from+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean.</a> Sci Rep. 6, 32090(2016).</li>
<li>Montiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Phaseolus+vulgaris+NADPH+oxidase+gene+is+required+for+root+infection+by+Rhizobia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia.</a> Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).</li>
<li>Arthikala, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PvRbohB+negatively+regulates+Rhizophagus+irregularis+colonization+in+Phaseolus+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris.</a> Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).</li>
<li>Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RbohB+a+Phaseolus+vulgaris+NADPH+oxidase+gene%2C+enhances+symbiosome+number%2C+bacteroid+size%2C+and+nitrogen+fixation+in+nodules+and+impairs+mycorrhizal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization.</a> New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).</li>
<li>Barraza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+PvTRE1+enhances+nodule+biomass+and+bacteroid+number+in+the+common+bean%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean.</a> New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).</li>
<li>Estrada-Navarrete, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autophagy-related+kinase+is+essential+for+the+symbiotic+relationship+between+Phaseolus+vulgaris+and+both+rhizobia+and+arbuscular+mycorrhizal+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi.</a> Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).</li>
<li>Nanjareddy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Legume+TOR+Protein+Kinase+Regulates+Rhizobium+Symbiosis+and+Is+Essential+for+Infection+and+Nodule+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development.</a> Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).</li>
<li>Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter+of+the+Vicia+faba+L.+gene+VfEnod12+encoding+an+early+nodulin+is+active+in+cortical+cells+and+nodule+primordia+of+transgenic+hairy+roots+of+Vicia+hirsuta+as+well+as+in+the+prefixing+zone+II+of+mature+transgenic+V.+hirsuta+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules.</a> Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).</li>
<li>Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+Sesbania+rostrata+leghemoglobin+glb3+gene+5%27-upstream+region+in+transgenic+Lotus+corniculatus+and+Nicotiana+tabacum+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants.</a> Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).</li>
<li>Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+network+governing+nodule+organogenesis+and+infection+in+the+model+legume+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus.</a> Nat Commun. 12, 1-10 (2010).</li>
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<li>Estrada-Navarrete, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-transformation+of+the+Phaseolus+spp.%3A+a+tool+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics.</a> Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Durante el análisis funcional de genes, el estudio de patrones de expresión genética desempeña un papel crucial en la comprensión de la regulación espacial y temporal de los genes en vivo. Es un método bien conocido para estudiar patrones de expresión del gen a clonar la región del promotor del gen de interés, río arriba a genes del reportero como genes marcador fluorescente (GFP, RFP, etc.) o β-glucuronidasa. En este documento, hemos seleccionado una región del promotor de la raíz nódulo simbiosis (RNS...

Promotores son herramientas biológicas moleculares importantes que desempeñan un papel crucial en la comprensión de la regulación de la expresión de genes de interés. Promotores son secuencias de ADN ubicadas aguas arriba de la traducción codón de la iniciación del gene de secuencias y llevan la información reguladora central de genes; por lo tanto, su correcta anotación y caracterización son vitales para entender la función del gene. Dependiendo de los patrones de expresión, promotores de la planta se clasifican como constitutivos, específicos de tejido, o específicos de etapa de desarrollo y inducible1. Avances en tecnologías transcriptómicos, mejoras en el modelado de la computadora y la disponibilidad de un número creciente de secuencias del genoma de diferentes especies de plantas han facilitado la predicción a gran escala de promotor secuencias2.
Por otro lado, también es fundamental para establecer instrumentos de evaluación del promotor y técnicas de transformación genética que son rápidos, eficientes y reproducibles. A diferencia de las otras plantas del modelo, la caracterización funcional de genes de leguminosa (p. vulgaris) frijol común es impedida principalmente debido a la naturaleza recalcitrante de Phaseolus SP. para la transformación genética estable. Transformación transitoria sistemas sirven como una alternativa para la caracterización funcional de genes rápida estudios3. En la investigación de la simbiosis de leguminosas, la interacción entre la planta huésped de leguminosas y rizobios bacteria es uno de los sistemas modelo más manejables para el análisis funcional de genes específicos de nódulo y promotor estudios. Caracterizado hasta el momento, han sido varios promotores de leguminosas relacionadas con estas simbiosis, viz, Medicago truncatula PT44, SWEET115, Lotus japonicus Cyclops, UBQ6, VAG17, glicina max PT5 8, Exo70J9, p. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, etcetera. CIS elementos influyen directamente en Regulación génica. El factor de transcripción ENBP1A se une a una región reguladora de Cis (−692 bp) de nodC temprana ENOD12 Vf, y esto facilita la expresión de un gen reportero en primordios de nódulo de Vicia faba16. Reemplazo de regiones reguladoras Cis (−161 para −48 bp) del promotor específico de nódulo melocotonero GLB3 con la heteróloga truncado promotores δ-p35S y δ-pNOS, resultó en una pérdida de especificidad del nódulo y disminución de la actividad de promotor17 .
Informes anteriores indican que el factor de transcripción NIN es necesario para el inicio de la infección por rizobios en las células de pelo de la raíz y también es esencial para la organogénesis del nódulo en L. japonicus18. En el presente estudio, se describe un protocolo para la identificación, aislamiento, clonación y caracterización del promotor específico de nódulos en las raíces pilosas de frijol común. Para lograr esto, seleccionamos promotora rizobios del NIN de simbiosis específica de p. vulgaris y reproducido en una fusión transcripcional a la quimérica reportero GUS-enhanced::GFP. Además, este protocolo describe un rápido y versátil sistema de transformación genética de p. vulgaris con a. rhizogenes inducida por raíces pilosas. Este sistema genera raíces pilosas en menos de 2 semanas después de la transformación. Finalmente, se evaluó la expresión espacio-temporal de promotor de NIN en nódulos radiculares de rizobios colonizados por tinción GUS.
El procedimiento descrito aquí puede ser útil no sólo para el estudio de la nodulación y micorrización11 de plantas leguminosas, sino también para el estudio de patrones de expresión del promotor en raíces19. Además, este protocolo es fácil de usar en laboratorios no especializados.

<table><tbody><tr><td>Primers para el ensayo qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN Forward</td><td>CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pNIN Reverse</td><td>CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13 Forward</td><td>GTA AAA CGA CGG CCA G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13 Reverse</td><td>CAG GAA ACA GCT ATG AC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ENTR/D-TOPO Cloning Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K243520</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzyme Mix&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791100</td><td></td></tr><tr><td>pBGWFS7.0&nbsp;</td><td>Biología de sistemas vegetales</td><td>https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/</td><td></td></tr> <tr><td>Platinum Taq ADN polimerasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10966018</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Kit de extracción rápida de gel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Pfx DNA Polymerasa</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>11708013</tr><tr><td>Biología Molecular Certificada Agarosa</td><td>Bio-Rad</td><td>1613102</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 E. coli químicamente competente</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar bacteriológico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de espectinomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1441</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Peptona bacteriológica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0556</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de</td> <td>calcioSigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Ácido nalidíxico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Solución de carga de gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7654</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>EQUIPO</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Veriti Termociclador</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Sigma</td><td>Sigma 1-14K</td><td></td></tr><tr><td>Gel unidad de documentación</td><td>Carestream</td><td>Gel Logic 212 PRO</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ SHKE6000 6000 Incubadora de agitación - 115VAC</td><td>Thermo scientific</td><td>EW-51708-70</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de crecimiento vegetal</td><td>MRC</td><td>PGI-550RH</td><td></td></tr><tr><td>Cabinata de flujo de aire laminar Horizantal</td><td>Lumistell</td><td>LH-120</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Leica</td><td>DM4500 B</td><td></td></tr><tr><td>Petridish</td><td>sym laboratorios</td><td>90X15</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí</td><td>Fisher scientific</td><td>53223</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga cónica Falcon 15mL Tubos</td><td>Fisher scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>22 mL tubos de vidrio</td><td>Thomas scientific</td><td>45048-16150</td><td></td></tr></tbody></table>

planta promotor análisis: identificación y caracterización del promotor de la raíz específica de nódulo en el frijol común

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

Las aguas arriba secuencias de codificación de secuencias del gene se llaman como secuencias de promotor. Estudiar los patrones de expresión de los promotores son muy importantes en la comprensión de la regulación génica y patrones espacio-temporales de expresión de genes diana. Por otro lado, también es fundamental para establecer instrumentos de evaluación del promotor y técnicas de transformación genética que son rápidos, eficientes y reproducibles. En este estudio, investigamos el patrón spatiotemporal de la expresión del promotor de creación (NIN) nódulo específico de simbiosis rizobios de Phaseolus vulgaris en las raíces pilosas transgénicos. Utilizando bases de datos de genoma vegetal y herramientas de análisis se identificaron, aislado y clonado el promotor NIN de p. vulgaris en una fusión transcripcional a la quimérica reportero GUS-enhanced::GFP de β-glucuronidasa (GUS). Además, este protocolo describe un rápido y versátil sistema de transformación genética en p. vulgaris usando Agrobacterium rhizogenes inducida por raíces pilosas. Este sistema genera raíces pilosas de ≥ 2 cm en 10 a 12 días después de la transformación. A continuación, se evaluó la expresión espacio-temporal de promotor de NIN en las raíces pilosas Rhizobium inoculados a intervalos periódicos de post-inoculación. Nuestros resultados descritas la actividad de GUS muestran que el promotor de NIN fue activado durante el proceso de nodulación. Juntos, el presente Protocolo muestra cómo identificar, aislar, clonar y caracterizar un promotor de la planta en las raíces pilosas de frijol común. Además, este protocolo es fácil de usar en laboratorios no especializados.

El objetivo de este estudio fue evaluar el patrón de expresión espacio-temporal de nódulo específico NIN de p. vulgaris . Para ello, se seleccionó una 700 bp región corriente arriba del codón de iniciación de traducción del gen NIN y un conjunto de oligos fue diseñado como se muestra en la figura 1A. Utilizando una polimerasa de alta fidelidad, el fragmento de promotor de NIN fue amplificado, aislado (figura 1B)...

Análisis de expresión del promotor son cruciales para mejorar la comprensión de la regulación de los genes y la expresión espacio-temporal de genes diana. Adjunto presentamos un protocolo para identificar, aislar y clonar un promotor de la planta. Además, se describe la caracterización del promotor específico de nódulos en las raíces pilosas de frijol común.

Planta promotor análisis: Identificación y caracterización del promotor de la raíz específica de nódulo en el frijol común

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Las raíces pilosas se utilizan para obtener raíces transformadas en Phaseolus con una construcción reportera. Las raíces transgénicas resultantes se emplean para examinar la expresión del gen reportero. Los estudios de expresión del promotor son fundamentales para comprender los patrones de expresión espacio-temporales de los genes.Hoy vamos a demostrar las metodologías para la inducción de raíces pilosas y para estudiar los patrones de expresión de promotores en raíces pilosas transgénicas bajo condiciones simbióticas de nódulos radiculares en Phaseolus. Estrada-Navarrete y colegas han establecido previamente el sistema de raíces pilosas inducidas por Agrobacterium rhizogenes en Phaseolus. El método actual ayudará a acelerar la duración de la inducción de raíces pilosas y, por ende, a mejorar la versatilidad del sistema.Quienes demostrarán los procedimientos serán mi colega Manoj-Kumar Arthikala y los estudiantes de licenciatura Alma Leticia y Brenda Mariana de mi laboratorio. Para comenzar, busque la secuencia del gen NIN en la base de datos del genoma de Phaseolus vulgaris en Phytozome, y seleccione la longitud requerida de la secuencia ubicada aguas arriba del ATG. Diseñe los oligonucleótidos siguiendo el análisis adecuado de la secuencia promotora.El ADN genómico de Phaseolus recién preparado servirá como molde para amplificar mediante PCR la secuencia del promotor. Prepare la mezcla maestra de PCR con polimerasa Taq de alta fidelidad y los componentes estándar para PCR, junto con los oligonucleótidos diseñados previamente. Aliquote la mezcla maestra en tubos de PCR de 2 mL y realice la amplificación del fragmento del promotor en un termociclador y con un programa adecuado.Separar el producto de PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,2 %. Visualizar el fragmento de NIN amplificado a 700 pares de bases mediante transiluminación UV. Cortar, eluir y clonar el fragmento en el vector de entrada Gateway pENTR/D-TOPO siguiendo las instrucciones estándar.Transforme dos microlitros de la mezcla de reacción en células competentes de E.coli a 42 grados Celsius durante 50 segundos, y siembre las células de E.coli transformadas en agar LB suplementado con 50 miligramos por litro de kanamicina. Incube las células sembradas a 37 grados Celsius durante la noche. Realice una reacción de PCR para plásmidos aislados de colonias aleatorias de E.coli utilizando oligonucleótidos M13.El fragmento de 1024 pares de bases debe indicar los clones positivos. Realice la reacción LR entre el clon de entrada positivo y el vector binario de destino. Transforme dos microlitros de la mezcla de reacción en E.coli y seleccione las colonias en 100 miligramos por litro de espectinomicina a 37 grados Celsius.Amplifique los plásmidos con oligonucleótidos específicos para NIN. El clon positivo debe amplificarse a 700 pares de bases. Secuencie y verifique la corrección del fragmento clonado.Introduzca el constructo del promotor NIN en células electrocompetentes de Agrobacterium rhizogenes K599. Nuevamente, confirme el clon mediante oligonucleótidos específicos para el promotor. Esterilice con azufre las semillas de Phaseolus vulgaris y germínelas sobre papeles de filtro húmedos y estériles durante dos días en oscuridad a 28 grados Celsius.Disperse 150 microlitros de células de Agrobacterium rhizogenes con el constructo NIN y el vector control en placas de LB con selección de espectinomicina. Incube el cultivo durante la noche a 28 grados Celsius. Desenvuelva plántulas de Phaseolus y retire las células de Agrobacterium rhizogenes con una punta doblada de 200 microlitros de la placa.Y resuspender en un tubo Eppendorf con un mL de agua estéril y destilada. Recoger las células de Agrobacterium rhizogenes en una jeringa de tres mL, y colocar las plántulas de Phaseolus en el conjunto de tubos previamente preparado. Pinchar ligeramente los hipocotilos de las semillas germinadas con la punta de la aguja, inyectando simultáneamente las células de Agrobacterium rhizogenes.Debe tenerse cuidado de que la aguja no atraviese el hipocótilo. Mantenga las plántulas inyectadas en una cámara de crecimiento a 28 grados Celsius con un fotoperíodo de 16 horas de luz y ocho horas de oscuridad. El callo en los hipocótilos heridos debería ser visible entre los cinco y siete días.Después de dos semanas, retire la raíz primaria cortando el tallo a dos centímetros por debajo de las raíces pilosas y transplántelas a macetas que contengan vermiculita estéril. Simultáneamente, inocule las plantas con un ml de Rhizobium tropici para inducir la nodulación. Asegúrese de diluir el cultivo de Rhizobium a 6 en OD 600.Mantenga las plantas en una cámara de crecimiento a 28 grados Celsius, con un fotoperíodo de 16 horas de luz y ocho horas de oscuridad, y riegue con solución B y D. Para estudiar los patrones de expresión espacio-temporales del promotor NIN, se realizan muestreos en diferentes puntos temporales. Retire las plantas sin dañar las raíces y lave las raíces sin ninguna partícula de vermiculita.Seleccione aleatoriamente las raíces de las plantas NIN y de control, y proceda a la tinción histoquímica de GUS incubando las muestras en tampón de ensayo de GUS a 37 grados Celsius durante 16 horas en la oscuridad. Observe las raíces teñidas con GUS bajo microscopio estereoscópico y compuesto. Esta imagen muestra la expresión del promotor NIN inducida por Rhizobium en las raíces primarias.La expresión del promotor NIN también se pudo observar en células pilosas de la raíz infectadas por Rhizobium. Además, la expresión de GUS se puede documentar en diferentes etapas del desarrollo del nódulo radicular. No se observó expresión de GUS en las raíces control con vector.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión del diseño de sus construcciones de promotores y del estudio de los patrones de expresión del promotor en raíces peludas transgénicas de Phaseolus. Este sistema podría ampliarse aún más para estudiar los patrones de expresión del promotor en otras interacciones simbióticas y con patógenos en Phaseolus y también en otras eudicotiledóneas.

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Investigación

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Biología

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Un método Simple para el aislamiento de protoplastos de soja y aplicación al análisis de expresión génica transitoria

El objetivo del protocolo presentado aquí es estudiar la respuesta de transcriptómicos de endosphere aislado de Bacillus mycoides a exudados de raíces de papa. Este método facilita la identificación de genes bacterianos importantes implicados en interacciones planta-microorganismo y es en principio aplicable a las plantas, con ajustes menores y otros endófitos.

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Visualización y medición del crecimiento de raíz en situ es extremadamente difícil. Se presenta un método rhizobox personalizable para seguir el desarrollo de la raíz y proliferación en el tiempo en respuesta al enriquecimiento de nutrientes. Este método se utiliza para analizar maíz diferencias genotípicas en la plasticidad de la raíz en respuesta a una fuente de nitrógeno orgánico.

Un protocolo de Rhizobox optimizada para visualizar el crecimiento de las raíces y la capacidad de respuesta a nutrientes localizadas

Aquí, presentamos dos protocolos para transformar plantas de patata. La transformación Agrobacterium tumefaciens conduce a una planta transgénica completa mientras que la Agrobacterium rhizogenes produce transgénicas raíces pilosas en una sesión de tipo salvaje que puede ser auto propagado. Entonces detectamos actividad de promotor por tinción de las raíces transformadas de GUS.

Tumefaciens de la agrobacteria y rhizogenes de la agrobacteria-transformación mediada de la patata y la actividad de promotor de un Gene del Suberin por GUS Staining

La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) ofrece la posibilidad de diseccionar programas de desarrollo con un procesamiento mínimo de órganos y tejidos. El protocolo produce ARN de alta calidad a partir de células dirigidas con una subunidad ribosomal etiquetada con proteína fluorescente verde (GFP). Las herramientas de análisis aguas abajo, como qRT-PCR o RNA-seq, revelan perfiles de expresión específicos del tejido y del tipo de célula.

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para investigar el desarrollo de la raíz de Arabidopsis thaliana a una escala específica de tipo de célula

Este protocolo presenta un resumen detallado de las estrategias para inocular las raíces de las plantas con microbios transmitidos por el suelo. Ejemplificado para los hongos Verticillium longisporum y Verticillium dahliae, se describen tres sistemas diferentes de infección radicular. Se destacan las aplicaciones potenciales y los posibles análisis posteriores, y se discuten las ventajas o desventajas para cada sistema.

Estrategias de inoculación para infectar las raíces de las plantas con microorganismos transmitidos por el suelo

Aquí, presentamos un protocolo para la producción de alta eficiencia de raíces peludas de soja transgénica.

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Aquí, proporcionamos el protocolo detallado de un método de transformación de un solo paso mediado por Agrobacterium tumefaciens para producir plantas compuestas.

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Aprende a inducir raíces pilosas en frijol común con Agrobacterium rhizogenes para caracterizar promotores específicos de nódulo. Este protocolo permite estudiar patrones de expresión génica en simbiosis.

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