Reconstrucción tridimensional de la arquitectura Vascular del ovario de ratón pasivo claridad-despejado

El objetivo general de este protocolo es proporcionar una vista tridimensional completa de la distribución capilar en los folículos ováricos de ratón y mostrar sus relaciones. El ovario es un órgano esencial en la reproducción y en la endocrinología. Cuente cada etapa de desarrollo diferente del folículo y las células somáticas.

Además, a diferencia de otros órganos, el ovario no muestra la ramificación repetida de la unidad funcional. El sistema vascular local, junto con el sistema nervioso, también son capaces de sufrir cambios importantes en cada ciclo menstrual en las mujeres adultas. La aplicación de la claridad pasiva en el ovario nos permite ver la distribución general y la conexión entre esas células y folículos en el ovario.

La mayor parte de la clave de esta medida es que tiene el menor efecto en el ovario y representa la eliminación de varios marcadores. A través de la reconstrucción de la imagen microscópica proporcionamos un mapa del ovario. Se pueden observar claramente algunos detalles de los vasos, las neuronas y los folículos.

Para el análisis de imágenes se utilizaron algunas opciones de Imaris para evaluar las relaciones entre el ovario y las estructuras. Prepare las soluciones de profusión de acuerdo con las instrucciones del artículo y manténgalas en hielo. Anestesia a los ratones y asegúrese de que el ratón no tenga una respuesta de pellizco en los dedos de los pies.

Rocíe etanol, haga una incisión en la aurícula derecha y luego profúrelo instantáneamente el ventrículo izquierdo con 20 ml de PBS helado a una velocidad de 10 ml por minuto para eliminar la sangre. A continuación, profusar el animal con una solución de hidrogel fría a la misma velocidad. Recolectar los ovarios, así como el útero para mantener la integridad de la morfología ovárica.

Transfiera los ovarios separados a la solución fría de hidrogel. Bajo un microscopio estereoscópico, extrae los tejidos grasos alrededor del ovario. Para obtener un mejor resultado de la fijación del tejido, recomendamos la extirpación de la bolsa ovárica.

Mantenga los ovarios en solución de hidrogel durante tres días. Después de tres días, transfiera los ovarios a un tubo de vidrio y llene el tubo con una solución de hidrogel fresca. Estire el parafilm sobre la parte superior del tubo y luego envuelva otro parafilm alrededor del cuello del tubo.

Asegúrese de que no haya burbujas entre el parafilm y la solución de hidrogel. Coloque el tubo de vidrio en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados durante dos horas hasta que se forme gel. Retire con cuidado el exceso de gel alrededor de los ovarios con un filtro de papel.

Coloque los ovarios en un tubo de 15 ml y llene el tubo con 10 ml de solución de limpieza. Coloque el tubo en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados durante al menos dos meses. Cambie la solución de aclaración todos los días durante los primeros tres días y luego semanalmente hasta que el ovario se aclare.

Todos los procedimientos de inmunotinción se realizan a 37 grados centígrados en un agitador. Primero, lave el ovario en PBST durante 24 horas. Segunda incubación del ovario en anticuerpo primario diluido por PBST durante dos días.

En tercer lugar, lave los anticuerpos primarios con tampón PBST. En cuarto lugar, incubar el ovario con el anticuerpo secundario deseado en PBST durante dos días. Quinto, lavar los anticuerpos secundarios con PBST.

En sexto lugar, transfiera el ovario a una solución compatible con el índice de refracción para la homogeneización de la IR. Compruebe la transparencia visual, cuando el ovario se ha aclarado completamente se puede obtener una imagen. Primero, prepare un plato limpio con fondo de vidrio.

Haz un cilindro de masilla y dale forma de herradura. Presione el borde exterior firmemente sobre la corredera de vidrio para hacer un espacio sellado. La altura de la masilla debe ser un poco más alta que el ovario.

Mueva el ovario con cuidado hacia el centro y agregue solución de montaje. Empuje un plato sobre la masilla y use dos piezas de masilla para fijarla. Cuando el ovario está listo para la obtención de imágenes, se puede seleccionar el microscopio confocal Nikon con lente 16X para obtener imágenes de él.

Para obtener imágenes con microscopio confocal, primero elija la lente en el panel Ni-E. En el panel de adquisición, seleccione el número de canales. En primer lugar, utilice la pestaña Eye Port y el joystick del controlador XY para mover el tejido al centro de campo mediante la comprobación con oculares de microscopio.

En segundo lugar, después de apagar la luz del obturador, haga clic en la pestaña en vivo para ajustar la potencia del láser, el HV y el desplazamiento para cada canal. En el panel Corrección de intensidad Z ajuste la adquisición para la capa superior, haga clic en el botón más para definir la parte superior, mueva la lente hacia abajo y establezca la potencia adecuada del láser y el HV en la parte inferior del tejido y agregue la información de la capa más baja, haga clic en A ND para sincronizar la configuración con el panel y la adquisición. Y en la adquisición, primero establezca el número de pasos de escaneo.

Haga clic en las pestañas de Z y la imagen grande. En segundo lugar, vaya a la ventana de escaneo de imagen grande para definir el tamaño del campo de acuerdo con el borde del tejido. En tercer lugar, regrese a la adquisición ND para ingresar el tamaño de los campos de escaneo y elija la superposición entre 10 y 50%Luego haga clic en ejecutar la corrección Z y espere el proceso de imagen.

Primero use imagic para abrir el archivo NIS original. Haga clic en el botón de imagen, elija el color y los canales de visualización, luego haga clic en archivo, elija secuencias de imágenes y guárdelas por separado como archivos tiff. En segundo lugar, use Imaris para abrir uno de los archivos tiff.

Haga clic en el botón Editar y elija agregar canales para agregar el resto. El nombre y el color se pueden cambiar en el ajuste de la pantalla. El grosor del tejido también debe corregirse en las propiedades de la imagen.

En tercer lugar, haga clic en el botón editar y elija Recortar 3D para cortar la parte adicional. Primero, haga clic en el botón del filamento y haga clic en siguiente. Vaya al panel de corte, busque un recipiente de rastreo y una distancia, luego regrese al Sobrepaso, ingrese el estático y haga clic en siguiente.

En segundo lugar, ajuste el umbral de inicio y punto de ajuste. En el panel de la cámara, elija la selección, presione shift y haga clic en el punto para eliminar la parte adicional. En tercer lugar, elija el umbral más alto y haga clic en siguiente.

No seleccione detecta puntos y vaya a siguiente. Parte de la parte sobrante se puede eliminar en el panel de edición. El color se puede editar haciendo clic en el color.

Se investigó la arquitectura 3D de la vasculatura ovárica tras la inmunotinción con CD31. La estructura 3D se puede observar por cortes a través de otros cortes o por la totalidad a través de la representación de volumen. Se realizó la tinción de CD 31 de la vasculatura folicular de ratones adultos.

A través de la reconstrucción de los capilares por los filamentos, pudimos mostrar la relación entre los folículos individuales y sus capilares. El ovario, al igual que una mujer, está siempre activo e intercambiable. Sin embargo, debido a la limitación del análisis histológico tradicional, es muy difícil describir las relaciones entre componentes tan complejos.

El método recientemente desarrollado, la claridad pasiva, puede ayudarnos a superar el obstáculo óptico, mantener la integridad de todos los tejidos y proporcionar las pistas funcionales.