Name: Reconstrucción tridimensional de la arquitectura Vascular del ovario de ratón pasivo claridad-despejado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Aprende a visualizar la arquitectura vascular tridimensional del ovario de ratón mediante el método pasivo CLARITY. Esta técnica permite mapear la distribución capilar en folículos ovaricos intactos.

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Este estudio fue apoyado por subvenciones del fondo especial de China para posdoctorados (Nº 2014T70392 a YF), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (no. 81673766 a YF), el nuevo profesor cebado de fondo, la Fundación Zuoxue de la Universidad Fudan y el desarrollo Proyecto de medicina integradora de disciplinas Shanghai pico (20150407).

Todos los procedimientos con animales sujetos siguieron las directrices del Comité de ética Animal en Universidad médica de Shanghai, la Universidad de Fudan (número de autorización 20160225-013).
1. preparación del ovario de ratón transparente
<ol><li>
Preparación de las soluciones
	<ol>
<li>Preparar la solución de tampón fosfato salino (PBS) (1 M, pH 7,6) con 0,1% Tritón X-100 (SAFT). Para hacer 1 L de solución stock de 10 x PBS, mezcla de 87 g de NaCl, 3,1 g de NaH2PO4 · 2H2O y 28,7 g de Na2HPO4 ·12H2O. Añadir dH2O a 1 L y mezclar ~ 2 h. ajuste a pH 7,4 con 1 N NaOH y almacenan a temperatura ambiente. Diluir esta solución stock 10 x 1/10 con dH2O y luego realizar 0,1% Tritón X-100 en PBS.</li>
		<li>Preparar la solución de hidrogel (pH 7,5) por solución de paraformaldehido (PFA) de 4% (peso/vol) de mezclas, 4% (peso/vol) acrilamida, bisacrilamida 0.05% (peso/vol) y 0.25% (peso/vol) VA-044 iniciador en doble y agua destilada en el hielo.</li>
		<li>Preparar la solución de limpieza (pH 8.5) mezclando 200 mM de tampón de borato de sodio que contiene 4% (peso/vol) sodio dodecil sulfato (SDS) en agua destilada doble.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la perfusión y el ovario Transcardial
	<ol>
<li>Mantenga todas las soluciones en hielo durante todos los procedimientos.</li>
		<li>Anestesiar el tipo salvaje hembra adulto del ratón C57BL/6 con una inyección intraperitoneal de pentobarbital (0,35 mg/kg) de solución. Una vez que no muestre ninguna respuesta del pellizco del dedo del pie, el ratón correctamente está anestesiado.</li>
		<li>Uso de cinta adhesiva para fijar el ratón con extremidades estiró hacia fuera en un tablero de espuma plana.</li>
		<li>Exponer el corazón por una incisión en el proceso xifoide con el pecho, piel y huesos con las tijeras.</li>
		<li>Hacer una incisión en la aurícula derecha del animal y luego inundar el ventrículo izquierdo con 20 mL de helado de 1 x PBS a 10 mL/min.</li>
		<li>Inundar el animal con menos de 20 mL de solución de hidrogel en 10 mL/min.</li>
		<li>Haga una incisión en la piel sobre el abdomen a lo largo de la línea medioventral con tijeras, que expone la enterocoelia toda, y quitar los intestinos. Recoger tanto los ovarios como el útero para mantener la integridad de la morfología ovárica.</li>
		<li>Eliminar el tejido graso alrededor del ovario bajo un microscopio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Desgasificación
	<ol>
<li>Coloque los ovarios en 10 mL de solución de hidrogel a 4 ° C para la fijación por 3 días.</li>
		<li>Transfiera el ovario en un tubo de 5 mL y llenar el tubo con solución de hidrogel. Parafilm se extienden sobre la parte superior del tubo y luego envolver parafilm alrededor del cuello del tubo. PRECAUCIÓN: Asegúrese de que no hay ningunas burbujas entre el parafilm y la solución de hidrogel.</li>
		<li>Coloque el tubo en un agitador en la incubadora a 37 ° C por un máximo de 3 h para permitir que el hidrogel polimerizar.</li>
		<li>Quitar el ovario del gel con una espátula y cuidadosamente retirar el gel sobrante de alrededor del ovario por papel de seda. Lave el ovario cuatro veces con PBS 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Claro pasivo
	<ol>
<li>Sumerja el ovario en 10 mL de la solución de limpieza. Sacuda suavemente a 80 rpm a 37 ° C para iniciar el proceso de compensación.</li>
		<li>En la primera semana, cambie la solución cada 3 días. Después de una semana, actualizar la solución de limpieza una vez a la semana hasta el ovario se convierte en claro. Este proceso toma generalmente cerca de 2-3 semanas. Nota: El ovario puede ser directamente immunostained o puede guardarse en azida de sodio (0,02%) en PBS a 4 ° C durante varias semanas antes de la inmunotinción.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. inmunotinción
<ol><li>Lave el ovario dos veces en SAFT el día 1 a 37 ° C en un agitador.</li>
	<li>Incubar el ovario en un agitador en la solución de anticuerpos primarios/SAFT (tabla 1) el día 2-3 a 37 ° C. En el trabajo presentado aquí, los anticuerpos primarios fueron la molécula de adhesión celular plaquetaria endotelial 1 (CD31) y tirosina hidroxilasa diluido al 1:10 y 1:50 en SAFT, respectivamente. PRECAUCIÓN: Si se usan dos o más tipos de anticuerpo primario, asegúrese de que hay diferentes fuentes animales.</li>
	<li>Lave los anticuerpos primarios con tampón de SAFT a 37 ° C en el día 4 en una coctelera Boston.</li>
	<li>Incubar el ovario con los anticuerpos secundarios deseados en SAFT el día 5-6 a 37 ° C en un agitador. En el trabajo presentado aquí, los anticuerpos secundarios fueron harina de Alexa 488 para tirosina hidroxilasa y Alexa harina 594 para CD31 diluido al 1:50 en SAFT.</li>
	<li>Lave los anticuerpos secundarios con tampón de SAFT a 37 ° C en el día 7 en una coctelera Boston.</li>
	<li>Transferir el tejido a la solución de correspondencia para índice de refracción de homogeneización de índice de refracción el día 8. Poner el tejido en un papel con las líneas de división para verificar su claridad visual comprobando si se observan las líneas de cuadrícula. Una vez que el tejido ha sido completamente aclarado, puede ser reflejada.</li>
	<li>Hacer un cilindro de masilla que podría simplemente rodea el tejido, moldear en forma de herradura y presiona el canto exterior firmemente sobre un portaobjetos de vidrio para hacer un espacio sellado. La altura de la masilla debe ser un poco más alta que el ovario.</li>
	<li>Coloque cuidadosamente el ovario clarificado en el centro de la masilla y añadir el índice de refracción que solución. Poner un plato de fondo de cristal sobre la masilla bien y usar masilla para fijar el plato.</li>
</ol>3. confocal microscopio
<ol><li>Para la proyección de imagen con un microscopio confocal, en el panel de "Ni-E" Elija la lente (en este caso agua inmersión 25 X objetivo, 1.1-NA, 2 mm-WD) con la distancia de trabajo adecuada (en este caso 2,0 mm).</li>
	<li>
En el panel de "Adquisición", seleccione el número de canales. Aquí, utiliza tres canales.
	<ol>
<li>En primer lugar, utilice la ficha de "Puerto de ojo" y la palanca de mando del regulador XY para mover el tejido hacia el centro del campo comprobando a través de los oculares del microscopio.</li>
		<li>Después de apagar la luz de la persiana, haga clic en la pestaña "en vivo" para ajustar la "energía del laser", "HV (ganancia)", y "offset" para cada canal por separado. Mayor potencia del láser y HV pueden conducir a mayores señales y offset mayor puede reducir el ruido de fondo.</li>
		<li>Seleccione el tamaño adecuado de exploración del"" y "Count". Utilice un análisis de tamaño de 1024 x 1024 μm2 y una cuenta de 4 a 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Después de ajustar la calidad de imagen para definir la profundidad del tejido en el panel de "corrección de la intensidad de la Z del y después de localizar la lente de la capa de la parte superior del ovario (en el centro del tejido) y ajustar la adquisición para la capa superior, haga clic en el"plus" botón para definir la capa superior.
	<ol>
<li>Mover la lente hacia abajo y establecer el alto voltaje apropiado y energía del laser para la parte inferior del tejido y añadir la información de capa más bajo en la tabla de corrección de la intensidad de la Z. Haga clic en la"a" para sincronizar la configuración con el panel de "Adquisición de ND".</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Panel en la "adquisición de ND", primera serie, el número de análisis de los pasos. Luego, marcar las pestañas de "Z" y "Gran imagen".
	<ol>
<li>Vaya a la ventana de "Ampliación de análisis de imagen" para definir el tamaño del campo según la frontera del tejido con la ayuda de la visualización de tejido a través de los oculares. Volver al panel de "Adquisición de ND" para el tamaño de la zona de exploración ("campos") de entrada y elija el traslapo entre el 10% y 15%.</li>
		<li>Haga clic en "Run Z corrección", no "ejecutar ahora", automáticamente establece el HV adecuada, energía del laser y el desplazamiento de cada capa, y esperar a que la imagen a procesar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 3D reconstrucción de folículos individuales y sus Vasculatures
<ol><li>En primer lugar, utilizar ImageJ5 para abrir el archivo original de NIS. Haga clic en el botón "Imagen" y elegir el "Color" y los "canales de Split". A continuación, haga clic en "Archivo" y guardar por separado los canales como serie de archivo tiff utilizando la opción "Secuencias de imágenes" en "Guardar como".</li>
	<li>Utilice Imaris para abrir una de las series de archivo tiff. Haga clic en el botón "Editar" y seleccione "Añadir canales" para añadir el resto de los canales. Pueden cambiarse el nombre y el color del canal en las pestañas de "Ajuste". El espesor del tejido deba corregirse en el panel de "Propiedades de imagen" en la lista desplegable "Edición".</li>
	<li>Para el cultivo de 3D de las imágenes finales y retiro de piezas de exceso, haga clic en el botón "Editar" y seleccione "Cultivo 3D". El tamaño del campo puede ajustarse arrastrando la frontera.</li>
	<li>
Para reconstruir las señales de la embarcación con el algoritmo de filamentos en el panel de Surpass, haga clic en el botón de "Filamentos" para crear un filamento nuevo y haga clic en siguiente.
	<ol>
<li>Para definir el mayor y el diámetro más fino, vaya al panel de "Slice" y encontrar el barco de seguimiento. La distancia automáticamente aparecerá en el panel de "Medida" seleccionando dos puntos en la anchura máxima del buque.</li>
		<li>Volver al panel de "Surpass" y el ancho medido de entrada y haga clic en siguiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajustar el umbral de punto de partida y semilla. En el panel de "Cámara", elija "Seleccionar". Si algunas de las esferas automáticamente producidas necesitan ser quitado, presione Mayús y haga clic sobre el punto. "Navegar" y moviendo el ratón, se puede girar la estructura para asegurar que todos los puntos correctos han sido retenidos y haga clic en siguiente.</li>
	<li>Elegir el umbral más alto para el contraste local y haga clic en siguiente. No seleccione "Detectar espinas" y continuar finalizar la reconstrucción del cilindro vascular. El color se puede editar haciendo clic en la ficha "Color". Los datos estadísticos se pueden extraer en el panel de "Estadística" del filamento reconstruido. Piezas de exceso se pueden quitar en el panel de "Editar". Nota: Otros algoritmos pueden utilizarse para medir el volumen de los folículos total o paredes foliculares. En el trabajo presentado aquí, los ovocitos fueron marcados por el autofluorescence de ambos anticuerpos secundarios. Debido a la gran cantidad de datos, un servidor de sitio de trabajo se utilizó para el análisis de datos.</li>
</ol>5. estadístico análisis
Nota: Datos de análisis de imagen se presentan como medios ± error de estándar.
<ol><li>Realizar comparaciones entre los folículos mediante la prueba t de muestras independientes y utilizar la prueba de correlación de Pearson para comparar los coeficientes de correlación de la pared folicular y la longitud del tubo capilar. Establecer un valor de P < 0,05 como límite de significación estadística.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En el presente estudio, presentamos proyección de imagen para evaluar las relaciones entre los capilares y los folículos en crecimiento individuales 3D. En nuestro trabajo anterior utilizando el mismo protocolo 9, estudiamos las funciones de la vasculatura grandes, las interacciones entre los folículos y la ubicación de los folículos en ovarios de ratón intacto. El enfoque pasivo de la claridad nos permitió estudiar micro y macro vasculatures, folliculogenesis y las interrelaciones entre los cuerp...

El folículo es la unidad fundamental estructural y funcional del ovario, y su desarrollo está muy relacionado con la vasculatura dentro del ovario. Los vasos sanguíneos suministrar nutrición y hormonas a los folículos y así desempeñar un papel importante en el crecimiento y maduración de los folículos1.
Una combinación de tecnologías, incluyendo marcadores selectivos vasculares, modelos de ratón transgénico y desarrollo farmacéutico, han aumentado nuestro conocimiento sobre redes vasculares ováricas, angiogénesis y la función de los vasos sanguíneos folliculogenesis. El ovario se conoce como un órgano activo porque remodela varias redes vasculares y tejidos durante la Foliculogénesis y la ovulación. Dicha remodelación activa en el tamaño y la estructura de los vasos es necesaria para la función biológica de desarrollo y reclutamiento de los folículos.
Los métodos histológicos e histomorfométricos tradicionales usando secciones ováricas y la inmunomarcación de los vasos sanguíneos se limitan a imágenes bidimensionales (2D)2. Con el desarrollo de las tecnologías de reconstrucción tridimensional (3D), se pueden superponer imágenes 2D de rebanadas de tejido para hacer una estructura 3D, pero esta modalidad todavía tiene algunas limitaciones, seccionamiento del tejido puede destruir las microestructuras, algunas partes de la tejido faltan a menudo, y trabajo importante está involucrado en hacer reconstrucciones 3D de imágenes de rebanadas. Conjunto tisular 3D con microscopia confocal puede superar muchas de estas limitaciones, pero estos métodos se limitan a la evaluación de la angiogénesis en el ovario embrionario3. Utilizando tejido entero claro métodos tales como la claridad4 puede aumentar el volumen visualizado con el fin de resolver estos problemas en los ovarios postnatales y adulto, y tales métodos proporcionan separación óptica del ovario sin deformaciones estructurales. La proyección de imagen de la arquitectura 3D de ovario intacto proporciona una base de datos de imagen precisa para software de análisis de imagen, como el paquete de software Imaris utilizado en este trabajo.
Remodelación del ovario a lo largo de la edad adulta es parte de un sistema dinámico de fisiológico, y esto hace que el ovario un excelente modelo para investigaciones sobre la regulación de la angiogénesis. Además, evaluar el papel de los vasos ováricos en condiciones patológicas del sistema reproductor femenino como el síndrome de ovario poliquístico o cáncer de ovario puede ser estudiada a través de la proyección de imagen de tejido ovárico todo. El desarrollo del método pasivo de claridad y el uso de software de análisis avanzado de imágenes han proporcionado información espacial detallada sobre las relaciones entre los vasos sanguíneos y estructuras ováricas tales como folículos.

<table><tbody><tr><td>Acrilamida</td><td>Vetec</td><td>v900845</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845</td></tr><tr><td>Alexa Harina 488 (Dilución 1:50)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11039</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039</td></tr><tr><td>Alexa Harina 594 (Dilución 1:50)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>Bisacrilamida</td><td>Amresco</td><td>172</td><td>http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx</td></tr><tr><td>Plato con fondo de vidrio de pared negra (Willco-Dish)</td><td>Ted Pella</td><td>14032</td><td>http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Reactivo químico Sinopharm</td><td></td><td>10004818 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818</td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato disódico dodecahidrato (Na2HPO4 12H2O)</td><td>Reactivo químico Sinopharm</td><td>10020318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318</td></tr><tr><td>FocusClear</td><td>Celexplorer</td><td>FC-102</td><td></td></tr><tr><td>http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>http://www.parafilm.com/products</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sinopharm Químico Reactivo</td><td>80096618</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618</td></tr><tr><td>PECAM1/CD31, molécula de adhesión plaqueta-célula endotelial 1 (Dilución 1:10)</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html</td></tr><tr><td>Fotoiniciador VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma</td><td>S2002 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US</td><td>Cloruro</td></tr><tr><td>de sodio (NaCl)</td><td>Reactivo químico Sinopharm</td><td>10019318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318</td></tr><tr><td>Dihidrógeno fosfato de sodio dihidratado (NaH2PO4 2H2O)</td><td>Reactivo químico Sinopharm</td><td>20040718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Reactivo químico Sinopharm 30166428</td><td></td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Reactivo químico Sinopharm</td><td>10019718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reactivo químico Sinopharm 30188928</td><td></td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928</td></tr><tr><td>Tirosina hidroxilasa (TH, dilución 1:50)</td><td>Abcam</td><td>ab76442</td><td>http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html</td></tr></tbody></table>

reconstrucción tridimensional de la arquitectura vascular del ovario de ratón pasivo claridad-despejado

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

El ovario es el órgano principal del sistema reproductivo femenino y es esencial para la producción de gametos femeninos y para el control del sistema endocrino, pero las complejas relaciones estructurales y las arquitecturas de la vasculatura (3D) tridimensional de la ovario no están bien descritas. Para poder visualizar las conexiones de 3D y arquitectura de los vasos sanguíneos en el ovario intacto, el primer paso importante es hacer que el ovario ópticamente claro. Para evitar la contracción del tejido, se utilizó el hidrogel pasiva basada en la fijación de la claridad (intercambian lípidos claro cruzado por hibridación acrilamida rígido imágenes / Immunostaining/In situ hibridación-compatible con tejido Hydrogel) protocolo método para borrar un ovario intacto . Immunostaining, microscopía confocal multifotón avanzada y reconstrucciones 3D de imagen entonces fueron utilizadas para la visualización de los vasos ováricos y tubos capilares foliculares. Usando este acercamiento, hemos demostrado una correlación positiva significativa (P < 0,01) entre la duración de la foliculares capilares y el volumen de la pared folicular.

Adaptamos el método pasivo de claridad en un método rápido y simple de ovario pasivo claro preservando la arquitectura folicular y vascular y obtener la mayor señal fluorescente de los marcadores etiquetados de los vasos y folículos. La arquitectura 3D de la vascularización folicular fue determinada por inmunotinción para CD31, un marcador para las células endoteliales6. CD31 tinción en los ovarios de ratones adultos se trazó mediante el algoritmo de filamento y de...

Aquí presentamos una adaptación de la pasivo claridad y método de la reconstrucción 3D para la visualización de la vasculatura ovárica y foliculares capilares en ovarios de ratón intacto.

Reconstrucción tridimensional de la arquitectura Vascular del ovario de ratón pasivo claridad-despejado

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

El objetivo general de este protocolo es proporcionar una vista tridimensional completa de la distribución capilar en los folículos ováricos de ratón y mostrar sus relaciones. El ovario es un órgano esencial en la reproducción y en la endocrinología. Cuente cada estadio de desarrollo diferente del folículo y de las células somáticas.Además, a diferencia de otros órganos, el ovario no presenta la ramificación repetida de la unidad funcional. El sistema vascular local, junto con el sistema nervioso, también es capaz de experimentar cambios importantes en cada ciclo menstrual en mujeres adultas. La aplicación de la claridad pasiva en el ovario nos permite observar la distribución general y la conexión entre esas células y folículos en el ovario.La mayor ventaja de esta clave de la medida es que tiene el menor efecto sobre el ovario y explica la clarificación de diversos marcadores. A través de la reconstrucción de la imagen microscópica, proporcionamos un mapa del ovario. Algunos detalles de los vasos sanguíneos, neuronas y folículos pueden observarse claramente.Para el análisis de imágenes, se utilizaron algunas opciones de Imaris para evaluar las relaciones entre el ovario y las estructuras. Prepare soluciones de perfusión según las instrucciones del artículo y manténgalas sobre hielo. Anestesie los ratones y asegúrese de que el ratón no tenga respuesta al pellizco en los dedos del pie.Rocíe etanol, realice una incisión en la aurícula derecha y, de inmediato, perfunda el ventrículo izquierdo con 20 ml de PBS frío a una velocidad de 10 ml por minuto para eliminar la sangre. Luego, perfunda el animal con Solución de Hidrogel fría a la misma velocidad. Recolecte los ovarios así como el útero para mantener la integridad de la morfología ovárica.Transfiera los ovarios separados a la Solución de Hidrogel fría. Bajo un microscopio estereoscópico, elimine los tejidos grasos alrededor del ovario. Para obtener mejores resultados en la fijación del tejido, recomendamos retirar la bolsa ovárica.Mantenga los ovarios en la Solución de hidrogel durante tres días. Después de tres días, transfiera los ovarios a un tubo de vidrio y llene el tubo con Solución de hidrogel fresca. Estire una película de parafina sobre la parte superior del tubo y luego envuelva otra capa de parafina alrededor del cuello del tubo.Asegúrese de que no haya burbujas entre el parafilm y la solución de hidrogel. Coloque el tubo de vidrio en un incubador agitador a 37 grados centígrados durante dos horas hasta que se forme el gel. Retire cuidadosamente el exceso de gel alrededor de los ovarios con un filtro de papel.Coloque los ovarios en un tubo de 15 ml y llene el tubo con 10 ml de solución de clarificación. Incube el tubo en un agitador a 37 grados centígrados durante al menos dos meses. Cambie la solución de clarificación cada día durante los primeros tres días y luego semanalmente hasta que el ovario se vuelva transparente.Todos los procedimientos de inmunomarcado se realizan a 37 grados centígrados en un agitador. Primero, lave el ovario con PBST durante 24 horas. Segundo, incube el ovario en anticuerpo primario diluido en PBST durante dos días.Tercero, elimine los anticuerpos primarios con tampón PBST. Cuarto, incube el ovario con el anticuerpo secundario deseado en PBST durante dos días. Quinto, elimine los anticuerpos secundarios con PBST.Sexto, transfiera el ovario a una solución de adaptación de índice de refracción para la homogenización del IR. Compruebe la transparencia visual; cuando el ovario se haya clarificado completamente, ya se puede obtener la imagen. Primero, prepare un recipiente limpio con fondo de vidrio.Forme un cilindro de masilla y dale forma de herradura. Presione firmemente el borde exterior sobre un portaobjetos de vidrio para crear un espacio sellado. La altura de la masilla debe ser un poco mayor que la del ovario.Mueva cuidadosamente el ovario al centro y agregue la solución de montaje. Coloque un portaobjetos sobre la masilla y utilice dos trozos de masilla para fijarlo. Cuando el ovario esté listo para ser observado, se puede seleccionar un microscopio confocal Nikon con lente de 16X para obtener la imagen.Para la imagenología con microscopio confocal, primero elija el objetivo en el panel Ni-E. En la adquisición del panel, seleccione el número de canales. Primero, utilice la pestaña Eye Port y el joystick controlador XY para mover el tejido al centro del campo mediante la verificación a través de los oculares del microscopio.En segundo lugar, después de apagar la luz del obturador, haga clic en la pestaña live para ajustar la potencia del láser, el HV y el desplazamiento para cada canal. En el panel Corrección de Intensidad Z, ajuste la adquisición para la capa superior; haga clic en el botón más para definir la parte superior, baje la lente y establezca el HV y la potencia del láser adecuados en la parte inferior del tejido, luego agregue la información de la capa más baja. Haga clic en To ND para sincronizar la configuración con el panel y la adquisición. Y en la adquisición, primero establezca el número de pasos de escaneo.Haga clic en las pestañas de Z y de la imagen grande. En segundo lugar, vaya a la ventana de escaneo de imagen grande para definir el tamaño del campo según el borde del tejido. En tercer lugar, regrese a la adquisición ND para ingresar el tamaño de los campos de escaneo y elija un solapamiento entre el 10 y el 50%. A continuación, haga clic en ejecutar la corrección de Z y espere a que finalice el proceso de adquisición de imágenes.Primero, use imagic para abrir el archivo NIS original. Haga clic en el botón de imagen, elija los canales de color y visualización, luego haga clic en archivo, seleccione secuencias de imágenes y guárdelas por separado como archivos tiff. En segundo lugar, use Imaris para abrir uno de los archivos tiff.Haga clic en el botón de edición y elija agregar canales para añadir los restantes. El nombre y el color se pueden cambiar en el ajuste de visualización. El grosor del tejido también debe corregirse en las propiedades de la imagen.En tercer lugar, haga clic en el botón de edición y elija Recortar 3D para eliminar la parte extra. Primero, haga clic en el botón de filamento y luego en siguiente. Vaya al panel de corte, encuentre un vaso trazado y la distancia, luego regrese al Entorno Avanzado, ingrese el valor estático y haga clic en siguiente.En segundo lugar, ajuste el umbral de punto inicial y punto establecido. En el panel de la cámara, seleccione, presione Mayús y haga clic en el punto para eliminar la parte adicional. En tercer lugar, elija el umbral más alto y haga clic en siguiente.No seleccione los puntos detectados y continúe. Alguna parte excesiva puede eliminarse en el panel de edición. El color puede editarse haciendo clic en el color.Se investigó la arquitectura tridimensional de la vasculatura ovárica tras la inmunotinción de CD31. La estructura 3D puede observarse ya sea mediante cortes a través de otros cortes o en su totalidad mediante renderizado volumétrico. Se realizó la tinción de CD31 en la vasculatura folicular de ratón adulto.Mediante la reconstrucción de los capilares por los filamentos, pudimos mostrar la relación entre los folículos individuales y sus capilares. El ovario, al igual que una mujer, está siempre activo e intercambiable. Sin embargo, debido a la limitación del análisis histológico tradicional, es muy difícil describir las relaciones entre tales componentes complejos.El método recién desarrollado, claridad pasiva, podría ayudarnos a superar el obstáculo óptico, mantener la integridad de los tejidos completos y proporcionar pistas funcionales.

three-dimensional-reconstruction-vascular-architecture-passive

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este estudio presenta un protocolo para el tejido reversible claro, immunostaining, renderizado 3D y análisis de redes vasculares en las muestras de vellosidades de la placenta humana del orden de 1-2 mm3.

Representación tridimensional y análisis de Immunolabeled, aclaró redes vasculares vellosas placentarias humanas

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Todo Monte inmunofluorescencia y cuantificación del folículo de los ovarios de ratón cultivadas

Cultivos de tejido ováricos se puede utilizar como modelos de la atresia de desarrollo, la ovulación y el folículo folículo e indicar mecanismos reguladores de procesos dinámicos de ovarianos.

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Inmunofluorescencia de ovario completo, limpieza y microscopía multifotónica para el análisis cuantitativo en 3D de la reserva ovárica en desarrollo en ratones

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Los cambios en el flujo sanguíneo ovárico durante el período preovulatorio son esenciales para la ovulación. La ecografía Doppler se ha utilizado en humanos y animales grandes para evaluar la hemodinámica y la perfusión ovárica. Se presenta un protocolo para la aplicación de la ecografía Doppler para evaluar la hemodinámica ovárica durante las fases preovulatoria y periovulatoria en ratones.

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El método de Hi-C permite la identificación imparcial de todo el genoma de las interacciones entre la cromatina (1). Hi-C parejas ligadura de proximidad y de secuenciación masiva en paralelo. Los datos resultantes se pueden utilizar para estudiar arquitectura genómica a diferentes escalas, los resultados iniciales identificaron características tales como los territorios de cromosomas, la segregación de la cromatina abierta y cerrada, y la estructura de la cromatina en la escala de megabase.

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

Generación de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) Líneas produce líneas con diferente potencial de desarrollo aún cuando pasan las pruebas estándar de pluripotencia. Aquí se describe un protocolo para producir ratones totalmente derivadas de iPS, que define las líneas de IPSC como poseedor completo...

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Una herramienta de análisis que cuantifica los cambios celulares Morfología de imágenes tridimensionales de fluorescencia

Aprende a visualizar la arquitectura vascular tridimensional del ovario de ratón mediante el método pasivo CLARITY. Esta técnica permite mapear la distribución capilar en folículos ovaricos intactos.

Reconstrucción tridimensional de la arquitectura Vascular del ovario de ratón pasivo claridad-despejado

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