Síntesis de bacteriófagos infecciosas en una e. coli -basan sistema de expresión libre

El objetivo general de este experimento es describir cómo se sintetizan los bacteriófagos a partir de su genoma utilizando un sistema de traducción de transcripción libre de células de E. coli. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología sintética, como dilucidar los mecanismos de autoensamblaje molecular en sistemas vivos. La principal ventaja de esta técnica es la versatilidad de la plataforma.

Muchos sistemas biológicos pueden ser completamente recapitulados y ajustados finamente para el análisis experimental. Comience este procedimiento con la preparación de las placas de fagos como se describe en el protocolo de texto. Utilice el extremo de una pipeta Pasteur estéril para extraer el corazón y una sola placa.

Sopla la placa en las células diluidas. Luego incubar a 37 grados centígrados durante dos horas. Para probar la infección completa, tome una muestra de 500 microlitros en un tubo de 1,5 mililitros y agregue 10 microlitros de cloroformo.

Inmediatamente agite la mezcla a alta velocidad y observe si la solución se aclara, lo que indica una infección por fagos. Una vez que las células estén completamente infectadas, incube durante otras dos horas. A continuación, agregue DNasa antes de centrifugar las células a 8.000 veces g y cuatro grados Celsius.

Deseche el sobrenadante, luego vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de cloruro de magnesio 1X Tris. Añadir 500 microlitros de cloroformo y vórtice a alta velocidad para lisar las células. Clarificar por centrifugación a 12.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

A continuación, desmonte el sobrenadante en un tubo cónico de 15 mililitros y guárdelo a cuatro grados centígrados. Prepare cuatro gradientes de sacarosa de cinco a 45% pipeteando 2,5 mililitros de sacarosa al 45% en cuatro tubos de ultracentrífuga. Cubra la capa con aproximadamente 2,6 mililitros de sacarosa al 5%, deteniéndose cuando el líquido llega a dos milímetros del borde del tubo.

Mezcle los gradientes mediante la rotación del tubo de inclinación utilizando un instrumento formador de gradientes durante 43 segundos a 86 grados y 23 RPM. Con una pipeta de un mililitro, agregue 500 microlitros de la suspensión de fagos agrupada poniendo la punta en contacto con la superficie líquida y dispensando muy lentamente el volumen en la parte superior del gradiente de sacarosa, teniendo cuidado de no mezclar a través del pipeteo rápido. Centrifugar a 70.000 veces g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.

Sumerja una cánula roma en la solución hasta que la punta se centre en el borde superior de la banda del fago. Retire la banda tirando del émbolo de la jeringa hasta que se haya eliminado la mayor parte de la banda del fago. A continuación, añada el volumen de sacarosa con el fago en suspensión a tres o cuatro tubos de ultracentrífuga.

Llene los tubos entre tres y cuatro milímetros desde la parte superior del tubo con 1XTM frío. Cubra los tubos con una película de parafina e invierta para mezclar. Vuelva a colocar los tubos en una ultracentrífuga y gaste a 145.000 veces g durante una hora a cuatro grados centígrados.

Vierta rápidamente el sobrenadante y escúrralo boca abajo sobre toallitas desechables. Divida de 200 a 400 microlitros de 1XTM frío en todos los pellets y vuelva a suspender durante la noche a cuatro grados centígrados. No es necesario agitar.

El día antes de hacer los títulos, prepare un cultivo de células huésped de E. coli en 10 mililitros de medio de crecimiento LB y deje el cultivo en una incubadora agitadora a 250 RPM y 37 grados Celsius durante la noche. A continuación, prepare una mezcla maestra pipeteando 5,25 mililitros de agar superior, 220 microlitros de muestras de fagos diluidos y 50 microlitros de células bacterianas huésped en un tubo de cultivo de 14 mililitros. Tape el tubo de cultivo y el vórtice a alta velocidad.

Recupere dos placas de cultivo de la incubadora a 37 grados centígrados. A continuación, añade 2,5 mililitros de mezcla maestra lentamente hasta el centro del primer plato. Gire suavemente la placa con la mano para distribuir la mezcla maestra de manera uniforme de modo que abarque toda la placa de cultivo.

Espere 20 minutos para asegurar la solidificación del agar superior. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante cuatro a siete horas. Cuente las placas y determine la concentración de fagos para cada muestra de reacción.

Diluya una porción del stock de fagos a 400 microlitros con tampón 1XTM en un tubo nuevo de 1,5 mililitros. Agregue un volumen igual de cloroformo de fenol Tris a la dilución. Agite la mezcla suavemente sobre un balancín de laboratorio o con la mano durante cinco minutos.

A continuación, centrifugar la emulsión resultante a 17.000 veces g en una centrífuga de sobremesa durante cinco a 10 minutos. Retire la fase acuosa superior a un nuevo tubo, teniendo cuidado de no alterar el límite de la interfase. Repita estos pasos dos veces más para un total de tres extracciones de fenol.

Transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo y agregue un volumen igual de cloroformo. Agite y centrifugue antes de transferir la muestra acuosa de ADN a un tubo limpio. A continuación, agregue 0,4 volúmenes de acetato de sodio tres molares y tres volúmenes de etanol al 95%.

Coloque el tubo en un congelador de menos 20 grados centígrados para la precipitación durante la noche. Centrifugar a 17.000 veces g en una centrífuga de sobremesa durante 10 a 15 minutos. Retire y deseche el sobrenadante, ya sea por decantación o pipeteo.

A continuación, añada 500 microlitros de etanol al 70% y agite suavemente el tubo hasta que el pellet flote libremente desde el fondo del tubo. Después de la centrifugación, retire y deseche el etanol, teniendo cuidado de no alterar el pellet. Después de agregar etanol y centrifugar como antes, retire y deseche el etanol por segunda vez, una vez más teniendo cuidado de no alterar el pellet.

Seque al aire el pellet en la mesa de trabajo durante 30 a 60 minutos. Una vez seco, agregue 50 microlitros de agua bidestilada al pellet e incube durante una hora a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados para volver a suspender. Determine la concentración de ADN utilizando mediciones de absorción a 280 nanómetros.

Para realizar la reacción libre de células, alícuota el volumen indicado de extracto crudo, 33% del volumen final de la reacción, en un tubo de microcentrífuga. Prepare la mezcla maestra como se indica en el protocolo de texto. Agregue el volumen apropiado de cada componente al extracto crudo.

Después de agregar el último componente, homogeneice la reacción por vórtice. A continuación, divida la mezcla maestra en n tubos de microcentrífuga. A continuación, agregue los volúmenes indicados de los componentes variables a la matriz de mezcla maestra.

Agregue agua a cada reacción para alcanzar el volumen de reacción final deseado antes del vórtice. A continuación, incubar los tubos de microcentrífuga a 29 grados centígrados durante al menos ocho horas o toda la noche. Después de preparar las células para el título de fagos como se describe en el protocolo de texto, titule la solución LB de reacción libre de células final como se demostró anteriormente en este video.

Aquí se muestran los resultados representativos de una reacción libre de células que sintetiza el fago phi X 174. Esta placa de fagos muestra una reacción exitosa del fago que se tituló con una dilución adecuada, evidente por el número contable de placas. Sin embargo, una reacción exitosa puede resultar mal si el factor de dilución es demasiado bajo para el rendimiento de fagos de la reacción.

Esta placa muestra un número incontable de placas. Aquí se muestra una placa con una distribución no homogénea de las placas de fagos debido a un preequilibrio insuficiente de la temperatura de la placa de cultivo. Durante el título del fago, la placa de cultivo solidificó la reacción en la parte inferior derecha de la placa.

Las condiciones de aglomeración molecular tienen un fuerte efecto en la síntesis de fagos para phi X 174 y, T7.In particular, el rendimiento de fagos para T7 disminuye en tres órdenes de magnitud cuando las concentraciones de PEG caen del cuatro al 2% en peso por volumen. Una vez dominado, la purificación de fagos y la extracción de ADN se pueden realizar en dos días si se realiza correctamente. La reacción sin células tarda solo unas horas cuando no hay problemas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar fagos, extraer y purificar su ADN, y usar el resultado para reconstituir fagos completamente infecciosos utilizando el sistema de reacción libre de células. Trabajar con fenol puede ser extremadamente peligroso, y se deben usar precauciones como bata de laboratorio, protección para los ojos y guantes mientras se realiza este procedimiento. Todos los trabajos con recipientes abiertos de fenol deben realizarse en una campana extractora.