Name: Síntesis de bacteriófagos infecciosas en una e. coli -basan sistema de expresión libre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Aprende a sintetizar bacteriófagos infecciosos a partir de su genoma utilizando un sistema de transcripción-traducción libre de células de E. coli. Este método versátil permite estudiar mecanismos de autoensamblaje molecular en biología sintética.

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Este material está basado en trabajo apoyado por el Oficina de investigación Naval Premio número N00014-13-1-0074 (V.N.), el programa de Ciencias humanas de frontera número RGP0037/2015 de la concesión (a V.N.) y la Fundación binacional de ciencia concede 2014400 (a V.N.).

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</ol>

Los autores declaran la interest(s) financiera competencia siguientes: Noireaux laboratorio recibe fondos de investigación de MYcroarray, un distribuidor del kit de expresión de proteína libre de MYtxtl.

Siguiendo la técnica de Chen, et al. 14 para SPMC, un paso crítico se alcanza al determinar las condiciones adecuadas para la sobreinfección. El parámetro que mejor controla la habilidad de una cepa de host para soportar el superinfection con frecuencia es la concentración inicial de la infección phage. Las células hospedadoras deben estar en fase de crecimiento logarítmico antes de la infección inicial con una pequeña cantidad de fagos. Finalmente, los fagos también alcanzará crecimiento...

En la última década, la tecnología de libre expresión ha sido diseñada para aplicaciones novedosas de dirección en biología relacionados con sintético y cuantitativa de áreas emergentes de investigación multidisciplinar. Originalmente utilizado para expresar las proteínas de un organismo vivo, se han desarrollado nuevos sistemas acelulares de TXTL para ambas ciencias básicas y aplicadas1,2, ampliar considerablemente el alcance de esta tecnología. La nueva generación de plataformas TXTL ha sido diseñada para ser fácil de usar, más eficiente (llegar a 2 mg/mL de síntesis de proteínas en modo batch3), más versátil a nivel de transcripción4y modular para integran fácilmente novela natural o funciones sintéticas que amplían las capacidades de los sistemas biológicos5,6. En particular, sistemas TXTL libres de células se han convertido en útiles para la creación rápida de prototipos de programas genéticos, tales como elementos reguladores o pequeños circuitos genéticos7,8,9, mediante la reducción de la prueba de diseño-construcción ciclo a unos pocos días. Sorprendentemente, los nuevos sistemas TXTL también son capaces de procesar grandes programas de ADN como la síntesis completa de colífagos10,11, demostrando fuerte suficientes prestaciones para apoyar la reconstitución del activo genómica DNA codificadas entidades vivientes.
TXTL sistemas presentan muchas ventajas técnicas en comparación con el tradicional en vitro constructivo ensayos bioquímicos. Sin células TXTL vincula el proceso de la expresión génica al producto final en un ambiente reducido y abierto, en comparación con el complejo citoplasma de una célula viva. TXTL usa ADN para reconstruir sistemas bioquímicos en vitro, que, con modernas técnicas de la Asamblea de ADN, es asequible y rápido además de no requerir pasos de purificación de proteína fastidioso. Expresión libre de la célula proporciona acceso directo a la mayoría de los componentes de las reacciones bioquímicas, lo que permite una disección más profunda de las interacciones moleculares12. En una reacción TXTL, uno puede cambiar los ajustes bioquímicos y biofísicos en la voluntad, que es casi imposible en una célula viva. Teniendo en cuenta estas ventajas y mejoras recientes, la tecnología TXTL se está convirtiendo en cada vez más popular como una plataforma alternativa para la biología sintética y cuantitativa. Mientras que la comunidad de investigación usando TXTL está creciendo rápidamente y TXTL se está convirtiendo en una tecnología estándar de la bioingeniería, es esencial para entender cómo utilizar las plataformas para el desarrollo de prácticas apropiadas y relacionadas con la ejecución de reacciones TXTL y a la interpretación de los resultados.
En este artículo se describe cómo utilizar un sistema TXTL todos de e. coli para sintetizar, en una olla reacciones, bacteriófagos de su genoma11, como MS2 (RNA, 3,4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5,4 kb) y el T7 (dsDNA, 40 kb). Nos muestran cómo la cantidad de fagos había sintetizado cambios con respecto a algunos de los valores bioquímicos de las reacciones (concentraciones de magnesio y potasio). Hacinamiento molecular, emulado a través de una gama de PEG 8000 concentraciones, tiene un efecto dramático sobre la síntesis de fago en varios órdenes de magnitud. La realización de estos grandes sistemas bioquímicos en reacciones de simple tubo de ensayo que recapitulan simultáneamente los procesos de transcripción, traducción y uno mismo-Asamblea, es interesante para abordar preguntas básicas relacionadas con la biología y Biofísica 10 (regulación de los genes, uno mismo-Asamblea), así como para el desarrollo de aplicaciones, tales como reasignación de funciones del fago para construir nuevas nanoestructuras13. Además de un práctico en TXTL, ofrecemos métodos de amplificación de fago, extracción de genoma y purificación y cuantificación de fago por el ensayo de placa. Los métodos presentados en este manuscrito son apropiados para los investigadores que usan sistemas de sin células de e. coli extracto basado en y están interesado en bacteriófagos.
Los protocolos presentados en este trabajo se pueden resumir como sigue: amplificación 1) Phage (día 1: inoculación de preparar células, día 2: solo placa múltiple phage y concentración y el crecimiento día 3: purificación de fagos), 2) extracción de ADN de genoma Double-stranded (extracción de fenol/cloroformo) y 3) experimento de título y reacción de fagos libres de células (día 1: placa las células del huésped y hacer las placas de agar, día 2: reacción libre y anfitrión célula precultivo y día 3: título cultura y phage célula del anfitrión).

<table><tbody><tr><td>Tubos de ultracentrifugación</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Creador de gradientes</td><td>BioComp Gradient Master</td><td>ver Anal Biochem. 1985 Jul; 148(1):254-9.</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa y cánula roma</td><td>Monoject</td><td>8881513918 y 888202017</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de diámetro ancho</td><td>Fischerbrand</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>Contador de placas</td><td>Nuevo Brunswik Contador de colonias científicas</td><td>modelo C-110</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo</td><td>Fischerbrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Sistema sin células</td><td>Mycroarray Inc</td><td>Mytxtl</td><td></td></tr><tr><td>Receta</td><td></td><td></td> de placa de agar BioComp Gradient Master BioComp Instruments modelo 105ME <td></td></tr><tr><td>LB</td><td>25 g/L Luria-Bertani medio (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents número de producto BP1426) y 15 g/L Bacto-Agar sólido (Brenton, Dickenson and Company - número de producto 214010).</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

síntesis de bacteriófagos infecciosas en una e. coli -basan sistema de expresión libre

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Una nueva generación de sistemas libres de células transcripción-traducción (TXTL), diseñado para tener una mayor versatilidad y modularidad, proporcionar nuevas capacidades para ciencias básicas y aplicadas en reacciones de tubo de ensayo. En la última década, TXTL libres de células se ha convertido en una técnica poderosa para una amplia gama de la biología relacionados con cuantitativa y sintética de áreas nuevas investigaciones multidisciplinarias. Las nuevas plataformas TXTL son particularmente útiles para construir e interrogar a sistemas bioquímicos a través de la ejecución de circuitos gen sintético o natural. In vitro TXTL ha demostrado conveniente rápidamente elementos reguladores del prototipo y redes biológicas así que recapitulemos molecular autoensamblaje mecanismos encontraron en los sistemas vivos. En este artículo describimos cómo infecciosos bacteriófagos, como el MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) y T7 (dsDNA), son sintetizados totalmente de su genoma en las reacciones de un pote con Escherichia coli, un sistema libre de células TXTL. Síntesis de los tres colífagos se cuantifican utilizando el ensayo de placa. Mostramos cómo la producción de fagos sintetizada depende de los parámetros bioquímicos de las reacciones. Hacinamiento molecular, emulado a través de una concentración controlada de PEG 8000, afecta a la cantidad de fagos sintetizadas por órdenes de magnitud. También describimos cómo amplificar los phages y purificar sus genomas. El conjunto de protocolos y resultados presentados en este trabajo debe ser de interés para los investigadores multidisciplinarios involucrados en Bioingeniería y biología sintética sin células.

Mostramos cuatro resultados representativos. En la figura 1, presentamos un conjunto de controles negativos para asegurar que el sistema TXTL libres de células y las poblaciones de DNA de fago no estén contaminadas con vida las células de e. coli . Verificar que el sistema TXTL libre es libre de intacta e. coli contaminación de la célula por tanto una solución de reacción incubadas y no incubadas de ADN genómico (figura ...

Una nueva generación de plataformas de transcripción-traducción libre de la célula ha sido diseñada para la construcción de sistemas bioquímicos en vitro a través de la ejecución de circuitos de gene. En este artículo describimos cómo bacteriófagos como MS2, ΦΧ174 y T7, son sintetizados a partir de su genoma mediante un todo e. coli sin células TXTL sistema.

Síntesis de bacteriófagos infecciosas en una e. coli -basan sistema de expresión libre

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

El objetivo general de este experimento es describir cómo se sintetizan los bacteriófagos a partir de su genoma utilizando un sistema libre de células de transcripción y traducción completamente basado en E.coli. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología sintética, como esclarecer los mecanismos moleculares de autoensamblaje en sistemas vivos. La principal ventaja de esta técnica es la versatilidad de la plataforma.Se pueden recapitular completamente y ajustar finamente muchos sistemas biológicos para su análisis experimental. Comience este procedimiento con la preparación de placas de fagos según se describe en el protocolo escrito. Utilice el extremo de una pipeta Pasteur estéril para extraer y retirar una placa individual.Soplar la placa hacia las células diluidas. Luego, incubar a 37 grados Celsius durante dos horas. Para comprobar la infección completa, tomar una muestra de 500 microlitros y colocarla en un tubo de 1,5 mililitros y añadir 10 microlitros de cloroformo.Vortex inmediatamente la mezcla a alta velocidad y observe si la solución se aclara, lo que indica infección por fagos. Una vez que las células estén completamente infectadas,

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Construcción de una biblioteca fosmid con el ADN genómico aislado del medio ambiente de la continuidad de profundidad vertical de un fiordo de la temporada hipóxica se describe. La biblioteca clon resultante se recoge en placas de 384 pocillos y se archivan para la secuenciación de aguas abajo y la detección funcional mediante la aplicación de un sistema de recogida automatizada de la colonia.

Inserte grandes Ambiental Genómica Producción Biblioteca

Este artículo describe el procedimiento para la preparación de una versión marcado fluorescentemente de bacteriófago lambda, la infección...

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

Source: Rustad, M. et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the amplification and recovery of infectious bacteriophages from E. coli cultures. It outlines the steps for plaque isolation, phage replication, controlled lysis, and purification.

Amplification and Recovery of Infectious Bacteriophages

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp.(2018)This video demonstrates preparation of a bacteriophage lysate containing transducing particles. A donor strain is infected, plaques form, and the soft agar overlay is processed with chloroform to yield a clarified lysate for downstream analysis.

Preparation of Bacteriophage Lysate for Generalized Transduction

Este protocolo de cinco días se esbozan todos los pasos, el equipo y el software complementario necesario para la creación y ejecución de un eficiente Escherichia coli endógeno basado sistema de expresión libre de células TX-TL a partir de cero. Con los reactivos, el protocolo de toma 8 horas o menos a la configuración de una reacción, recopilar y procesar datos.

Los protocolos para la implementación de un Escherichia coli Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética

Aquí, presentamos los protocolos para la utilización de la célula y baculovirus proteína expresión sistema insecto para producir grandes cantidades de proteínas vegetales segregada para la cristalización de proteínas. Un vector de expresión de baculovirus se ha modificado con GP67 o insectos hemolin péptido señal para la expresión de la secreción de la proteína de planta en células de los insectos.

Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

Este protocolo describe el método, los materiales, el equipo y los pasos para la preparación ascendente de ARN y células sintéticas productoras de proteínas. El compartimento acuoso interno de las células sintéticas contenía el lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de una bicapa lipídica (es decir, liposomas estables), utilizando un método de transferencia de emulsión de agua en aceite.

Preparación de células sintéticas productoras de proteínas mediante extractos bacterianos libres de células, liposomas y transferencia de emulsión

Los bacteriófagos (fagos), virus que infectan a las bacterias, son un componente integral del microbioma intestinal. Aunque estos habitantes simbióticos impulsan la aptitud bacteriana y la dinámica de la población, se sabe poco sobre cómo afectan a la homeostasis intestinal y a la enfermedad. Este protocolo estudia fagos T4 aislados dentro de un modelo de ratón, adaptables a otros pares fago-bacteriano.

Interacción entre bacteriófagos T4 y E. coli en el intestino murino: un modelo prototípico para estudiar la dinámica huésped-bacteriófago in vivo

Este protocolo describe el sistema de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) utilizado en la construcción de células sintéticas. Describe las etapas clave con resultados representativos en diferentes microcompartimentos. El protocolo tiene como objetivo establecer las mejores prácticas para diversos laboratorios en la comunidad de células sintéticas, avanzando en el desarrollo de células sintéticas.

Sistema de síntesis de proteínas libres de células para la construcción de células sintéticas

Este protocolo describe un método para producir y evaluar la actividad antimicrobiana y la citotoxicidad del péptido catiónico Mel4 y el mímico del péptido RK758. Al integrar síntesis química, expresión recombinante y ensayos funcionales estandarizados, proporciona un flujo de trabajo optimizado para la producción y prueba de péptidos y mimetizadores de pequeñas moléculas.

Producción y pruebas de péptidos antimicrobianos y sus imitadores

Aprende a sintetizar bacteriófagos infecciosos a partir de su genoma utilizando un sistema de transcripción-traducción libre de células de E. coli. Este método versátil permite estudiar mecanismos de autoensamblaje molecular en biología sintética.

Síntesis de bacteriófagos infecciosas en una e. coli -basan sistema de expresión libre

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