Integración Derivación Gratuita de Células Madre Pluripotentes Inducidas Humanas Usando Laminin 521 Matrix

El objetivo general de este protocolo es derivar células madre pluripotentes inducidas humanas homogéneas. Este método se puede utilizar para derivar células madre pluripotentes inducidas humanas para muchos propósitos, incluido el modelado de enfermedades, la detección de medicamentos o para derivar células para ensayos preclínicos de terapia celular. La ventaja de este protocolo es que es robusto y genera células homogéneas que se mantienen en un sistema de cultivo fácil de usar, libre de xeno y totalmente definido químicamente.

Dado que las células iPS humanas recapitulan el fondo genético del tejido del donante y pueden diferenciarse potencialmente en cualquier tipo de célula relevante para la enfermedad, proporcionan excelentes herramientas para el modelado de tesis. La biopsia, la disección y la selección de colonias son procedimientos complejos. Verlos realizados con manos experimentadas ayuda a la comprensión de los procedimientos y facilita su repetición.

Harriet RonnHolm y Kelly Day, dos técnicas de laboratorio altamente experimentadas del iPS Core Facility en el Karolinska Institutet, harán una demostración del procedimiento. Las muestras de biopsia de piel se pueden almacenar en PBS más estreptomicina al 1% de penicilina durante un máximo de 48 horas a cuatro grados centígrados, pero deben procesarse lo más rápido posible después de su obtención. Transfiera la biopsia a una placa de 35 milímetros.

Sumerja la biopsia de piel en un plato de 35 milímetros con dos mililitros de etanol al 70% durante 30 segundos. Agregue un mililitro de solución salina equilibrada de Hank's estéril suplementada con estreptomicina al 1% de penicilina a una nueva placa de 35 milímetros y transfiera la biopsia a la nueva placa. Transfiera la biopsia a un plato de cuatro 35 milímetros lleno con un mililitro de solución de dispasa al 0,1% recién preparada.

Con bisturíes y pinzas quirúrgicas estériles, corte la biopsia de piel en trozos de uno o dos milímetros cúbicos. Transfiera las piezas de biopsia con la solución de dispasa a un tubo de 15 mililitros y agregue dos mililitros adicionales de dispasa. Enjuague el plato de 35 milímetros con un mililitro de solución de dispasa y transfiera la solución enjuagada al tubo de 15 mililitros.

Incubar la biopsia a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, añadir cuatro mililitros de colagenasa I al 0,1% al tubo con las piezas de biopsia e incubar a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Treinta minutos antes de sembrar las células, cubra un pocillo en una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos con un mililitro de gelatina al 0,1% en DPBS.

Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de cuatro horas de incubación con colagenasa, centrifugar las células digeridas a 300 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender la digestión en dos mililitros de medio fibroblasto.

Retire la solución de gelatina de la placa de cultivo de tejidos de seis pocillos previamente preparada. Transfiera la suspensión celular, incluidas las piezas de tejido restantes, a la placa de seis pocillos. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en alta humedad.

Los fibroblastos están listos para ser pasados a un matraz de cultivo de tejidos T25 cuando están en un 80% de confluentes. Los fibroblastos en el paso dos a cuatro son óptimos para la reprogramación, ya que la eficiencia de la reprogramación es generalmente mayor para los fibroblastos de paso inferior. Aspirar el medio de cultivo celular del matraz y lavar las células con un mililitro de DPBS.

Aspirar el DPBS y añadir un mililitro de 0,5%Tripsina EDTA. Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos o hasta que se desprendan las células. Agregue dos mililitros de medio fibroblasto, vuelva a suspender las células y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros.

Centrifugar a 300 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en dos mililitros de medio fibroblasto. Después de contar los fibroblastos con un hemacitómetro, siembre cinco veces 10 hasta la cuarta célula en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos.

Incubar las células a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, debido a que se manipulará el virus de Sendai, continúe el procedimiento en un laboratorio BSL-2 designado mientras usa el equipo de protección personal adecuado. Aspirar el medio de cultivo celular y añadir 250 microlitros de solución para el virus de Sendai.

Incubar la placa a 37 grados centígrados. Un día antes de recoger las colonias, prepare placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos recubiertas con LN-521. Pipetee 250 microlitros de solución de LN-521 en un pocillo de una placa de 24 pocillos.

Selle la placa con parafilm e incube a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, aspire la solución LN-521 del pocillo de la placa de 24 pocillos y agregue 500 microlitros de E8 en el pocillo. Se recomienda el uso de una redecilla para el cabello y una máscara de procedimiento mientras se seleccionan colonias bajo el microscopio estereoscópico.

Las colonias están listas para ser recogidas cuando alcanzan un tamaño de más de un milímetro de diámetro, muestran bordes afilados y crecen en monocapas homogéneas. No escoja colonias con bordes borrosos y grandes masas celulares heterogéneas no compactas. Corta cada colonia con un bisturí en pedazos más pequeños en un patrón similar a una cuadrícula.

Utilice una pipeta de 200 microlitros para raspar mecánicamente las láminas de células de la placa y, a continuación, transfiera la lámina a un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos previamente recubierta con LN-521. La selección de colonias es fundamental para el éxito de este protocolo. Elegir algunas colonias adicionales asegurará el apego en cantidades suficientes.

Deje que las celdas se conecten sin cambiar el medio E8 durante 48 horas. Pasan enzimáticamente las células cuando las colonias han alcanzado un tamaño superior a cinco milímetros. Aspirar el medio de cultivo celular de las células y lavar con 250 microlitros de DPBS.

Aspirar el DPBS y añadir 250 microlitros de reactivo de disociación. Incubar a 37 grados centígrados durante tres minutos. Observe que las células han comenzado a redondearse.

Separe las células de la placa enjuagándolas con reactivo de disociación. Agregue 500 microlitros de medio E8 a un tubo de 15 mililitros y transfiera las células y el reactivo de disociación al tubo. Centrifugar a 300 veces g durante tres minutos.

Aspirar el sobrenadante del tubo de 15 mililitros y resuspender el pellet de celda en 500 microlitros de medio E8. Cuente las células con un hematitómetro y siembre de 2,5 a cinco veces 10 hasta la cuarta celda en otro pocillo prerestablecido con LN-521 que contenga 500 microlitros de medio E8 a temperatura ambiente. Añadir inhibidor de ROCK hasta una concentración final de 10 micromolares.

Incubar las células a 37 grados centígrados. Usando este protocolo, las colonias de células madre pluripotentes inducidas humanas emergen de los fibroblastos transducidos aproximadamente el día 12 después de la transducción. Las colonias estaban listas para ser recolectadas alrededor de tres o cuatro semanas después de la transducción.

Las características preferidas incluyen masas celulares compactas aplanadas, crecimiento como monocapas homogéneas y bordes afilados. Estas imágenes de campo claro muestran una línea celular iPS humana homogénea y totalmente reprogramada de paso temprano en comparación con una línea celular altamente heterogénea. La pérdida del vector del virus de Sendai se confirmó por la ausencia de marcadores específicos del vector del virus de Sendai en las células iPS humanas en el pasaje 12, en contraste con las células iPS humanas en el paso tres.

La tinción inmunocitoquímica de células derivadas para los marcadores de pluripotencia OCT4, SSEA-4 y NANOG arrojó un resultado homogéneamente positivo. La expresión de ARNm de genes de pluripotencia endógenos se demostró mediante PCR con transcriptasa inversa. Se descartaron los cultivos celulares que contenían células parcialmente reprogramadas que no expresaban factores de pluripotencia.

El potencial de diferenciación de las células iPS humanas se evaluó mediante la formación de cuerpos embrioides. La PCR en tiempo real después de 21 días de diferenciación del cuerpo embrioide detectó la expresión de ARNm de marcadores específicos del endodermo, el mesodermo y el ectodermo, lo que confirmó que las células iPS humanas derivadas eran capaces de diferenciarse a las tres capas germinales. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar con aproximadamente 22 horas de tiempo práctico durante un período de tiempo de aproximadamente 16 semanas.

Las células madre pluripotentes inducidas humanas derivadas se pueden diferenciar en cualquier tipo de célula del cuerpo humano adulto para responder a cualquier pregunta relevante para su campo de investigación. Después de ver este video, esperamos que tenga una buena comprensión de cómo realizar los pasos necesarios para derivar células madre pluripotentes inducidas a partir de biopsias de piel.