Name: Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprende a evaluar la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor mediante inmunofluorescencia. Este método semicuantitativo permite comparar sinapsis excitatorias e inhibitorias en estudios de neurodegeneración.

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Este trabajo fue apoyado por el MRC, UE FP7, ARUK, Wellcome Trust y Parkinson UK. También nos gustaría agradecer a la Sra. Johanna Buchler por su aportación de imágenes confocales y los miembros del laboratorio por su aportación constructiva en el manuscrito y la metodología de.

todos los experimentos con ratones y ratas fueron aprobados y llevó a cabo utilizando procedimientos Anexo 1 cubiertos bajo la ley de domicilio animales (procedimientos científicos) de 1986. La receta de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) se puede encontrar en la tabla 1.
 1. aguda Hippocampal rodaja preparación <ol><li>quitar el cerebro del ratón tan rápido como sea posible, con una espátula y afiladas tijeras para cortar el cráneo y se coloca en helada, oxigenada (95% O 2, 5% CO 2), alta sacarosa ACSF (~ 100 mL).</li>
	<li>Poner el cerebro de ratón en una caja Petri y quite el cerebelo y una pequeña sección de la corteza frontal con un bisturí antes de hemisecting hacia abajo de la línea media del cerebro.</li>
	<li>Colocar los dos hemisferios en la parte que era solo corte y pegue cada hemisferio en el escenario de un vibratome.</li>
	<li>Corte secciones de 200-300 μm de espesor de la región de información de interés. En el caso del hipocampo, se deben obtener aproximadamente 3 a 4 rebanadas por hemisferio.</li>
	<li>Con una pipeta Pasteur plástica, transferir las rebanadas a una cámara sumergida en oxigenada (95% O 2, 5% CO 2) ACSF. Mantener a 34 ° C durante 30 minutos 
	Nota: El tratamiento de las rebanadas con agentes farmacológicos activos, tales como proteínas recombinantes de Dkk1, puede realizarse en esta etapa mediante la adición de los agentes a la cámara slice.</li>
	<li>Retire las rebanadas de la cámara con un pincel, colocar en una placa de 24 pocillos y arreglar por 20 min a 1 h en paraformaldehído al 4% (sacarosa PFA)/4% a temperatura ambiente (RT). 
	PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico, usar protección adecuada.</li>
	<li>Lavar las rodajas de tres veces en 1 X PBS (10 min). 
	Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí por 1-2 días, como las rodajas se mantienen a 4 ° C en 1 X PBS.</li>
</ol> 2. Inmunofluorescencia para marcadores sinápticos Nota: las recetas de todos los búferes utilizados pueden encontrarse en la tabla 2.
<ol><li>Reemplazar el PBS con tampón de bloqueo/permeabilizing (tabla 2) en los pozos de la rebanada e incube a TA por 4-6 h.</li>
	<li>Diluir el anticuerpo policlonal conejillo de Indias contra vGlut1 en una dilución de 1:2,000 en buffer de bloqueo/permeabilización. 
	Nota: vGlut1 es un marcador pre sináptica excitatoria visualización terminal. Para la identificación de sinapsis excitatoria postsináptica, utiliza un anticuerpo policlonal contra el PSD-95 y diluido 1: 500 en la misma solución. Utilizar un volumen mínimo de 300 μL en cada pocillo. Para identificar la localización anatómica del hipocampo, utilizan un anticuerpo que también puede identificar la estructura neuronal, como MAP2 o tubulina. Trabajar la correcta concentración de los anticuerpos primarios para los marcadores sinápticos de elección (pre y postsinápticos) y diluido en buffer de bloqueo/permeabilizing fresco.</li>
	<li>Incubar las rebanadas en la solución de anticuerpo primario durante la noche (o por 1-2 días) a 4 ° C. Utilice una plataforma de agitación con el vigoroso movimiento.</li>
	<li>Lavar las rodajas de tres veces en PBS (10 min).</li>
	<li>Diluir los correspondientes anticuerpos secundarios 1: 500 en solución amortiguadora de bloqueo. Por ejemplo, cuando se utiliza el anticuerpo de conejillo de Indias vGlut1, aplicar un anticuerpo secundario que reconoce el componente de conejillo de Indias (p. ej., burro anti-guinea-pig) conjugado con un fluoróforo específico. Cuando se utiliza el anticuerpo de conejo PSD-95, aplique un anticuerpo secundario que reconoce el componente de conejo (por ejemplo, burro anti-conejo) conjugado con un fluoróforo específico diferentes.</li>
	<li>Incubar las láminas en esta solución durante 2-3 h a RT. Asegúrese que las rebanadas están protegidas de la luz, como los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz.</li>
	<li>Lavar las rodajas de tres veces en PBS (10 min).</li>
	<li>Cuidadosamente retire las rebanadas de la placa de 24 pozos con un pincel y colóquelos uniformemente en portaobjetos de vidrio etiquetadas. Añada una gota de medio de montaje encima de cada rebanada y luego colocar suavemente un cubreobjetos de vidrio encima de las rebanadas. Evitar la formación de burbujas de aire. Tenga cuidado de usar suficiente medio de montaje (300-400 μL), como una cantidad insuficiente puede llevar a secar rodajas de.</li>
	<li>Dejar secar por un mínimo de 1-2 días a temperatura ambiente y guardar las diapositivas de la luz.</li>
	<li>Guardar las diapositivas a 4 ° C en el corto plazo, pero para el almacenamiento a largo plazo, mantener a -20 ° C.</li>
</ol> 3. Análisis y adquisición de la imagen confocal <ol><li>proyección de imagen usando microscopía de láser confocal.
	<ol><li>Identificar la región del hipocampo al ser fotografiada (por ejemplo, el cornu ammonis 1 y 3 (CA1, CA3) o el giro dentado (DG)) por medio de un objetivo de 20 x o 10 x.</li>
		<li>Cambio a 40 x o x 63 objetivo de inmersión en aceite para asegurarse de que la anatomía de la rebanada intacta identificando neurites continuados y organizada estructura. Use un marcador neuronal, como la MAP2, como referencia ( figura 1A).</li>
		<li>Posteriormente, cambie una 60 x objetivo de inmersión en aceite (NA = ~1.3 - 1.4) y ajustar la configuración para cada canal para obtener óptima de la señal y el contraste. Ajustar la intensidad de cada láser para evitar la saturación de los píxeles mediante una opción de alto y bajo contraste. 
		Nota: Estos se dependen del microscopio utilizado, pero se refieren a la Tabla de materiales para la configuración de energía de láser utilizado en la figura 2, figura 3, y Figura 4. Para mejores resultados, utilice una resolución de 1024 x 1024 píxeles. La configuración debe permanecer constante a lo largo de las diferentes condiciones del experimento mismo. Puede aplicar zoom adicional si es necesario.</li>
		<li>Evaluar la profundidad donde la coloración es uniforme y adquirir pilas de imagen de por lo menos 8 equidistante (250 nm) planos. Luego tomar 3 pilas adyacentes imágenes representativas de la misma área de interés por rebanada. 
		Nota: La profundidad puede variar de un sector a otro, pero siempre debe ser aproximadamente 2-5 μm de la superficie de la rodaja.</li>
		<li>Repetir la adquisición de al menos 3 rebanadas por condición y de 6-8 animales por grupo de tratamiento.</li>
	</ol></li> <li>Análisis de imagen. 
	Nota: Utilice un software de análisis de imagen automatizado (véase la Tabla de materiales). Tenga en cuenta que algunos sistemas requieren una licencia, mientras que otros son gratis, como el ImageJ. El software utilizado debe analizar las imágenes en 3D, teniendo en cuenta todos los planos de la pila de imágenes. Consulte la Tabla de materiales para los detalles de los programas utilizados en el análisis de la imagen ( figura 1).
	<ol><li>Uso un protocolo de umbral de intensidad basado en el costumbre para identificar todos los puncta sináptica y marcadores neuronales, que son manualmente optimizados y seleccionados dentro del software [véase Tabla de materiales para el software específico utilizado en este Protocolo]. 
		Nota: El software identifica una intensidad mínima y máxima para cada fluoróforo y asocia un porcentaje de intensidad para cada objeto reconocido. Tenga en cuenta que el porcentaje de intensidad variará de acuerdo al fluoróforo que se utiliza y el anticuerpo contra el marcador sináptico.</li>
		<li>Para marcadores sinápticos, asegúrese de que tamaño filtros (&#62; 0.1µm 3 y &#60; 0.8µm 3) seleccionados dentro del software y aplicar a la imagen. Ajustar los parámetros para asegurar que los objetos seleccionados no se solapan. Para excluir cualquier objeto que es demasiado grande o demasiado pequeño para ser considerado puncta sináptica (ver figura 2B). 
		Nota: Una vez optimizado, los mismos valores de umbral luego son aplicados en todas las imágenes dentro de un experimento dado.</li>
		<li>Cuantificar el número, intensidad y volumen de puncta sináptica individual (pre- o postsináptica) utilizando los protocolos optimizados umbral seleccionados dentro del software. Normalizar el número de orificio para el volumen del campo imagen (más o menos 16.928 μm 3 en el sistema de aquí). Normalizar la intensidad sináptica puncta a la intensidad del marcador neuronal referencia. 
		Nota: Las sinapsis son definidas como la colocalización entre marcadores previos y postsinápticos. Una vez que los protocolos de umbral h orificio pre y postsinápticaAve sido establecido, el software debe identificar la co-localización de puncta sináptica como la superposición de 1 píxel o más en un solo plano. 
		Nota: Para el análisis estadístico, confirmar que todos los conjuntos de muestras de seguir la normalidad y homogeneidad de la varianza, según Lilliefords y pruebas de χ2, respectivamente. Mostrando una distribución normal y homogeneidad de la varianza de las muestras deben analizarse con pruebas paramétricas, como se describe a continuación. Por ejemplo, análisis de puncta sináptica excitatoria deben realizarse utilizando un ANOVA unidireccional con la replicación y el bloqueo. Cada experimento individual debe considerarse como un bloque; por lo general, existen tres experimentos independientes, cada uno con 1-3 ratones de cada Estado.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> figura 1: Análisis de puncta sináptica mediante el análisis de imagen software (A) captura de pantalla de la personalización de protocolo de intensidad umbral. El ejemplo es para PSD-95, en el cual el orificio seleccionado tienen un tamaño definido de &#62; 0.1 μm 3 y &#60; 0,8 μm 3 y objetos superpuestos al mínimo actual. Tenga en cuenta que la imagen que se muestra es para que un plano confocal permitir la mejor visualización de puncta sináptica y selección de parámetro exacto. (B) captura de pantalla del análisis de la salida desde el software (después de la selección del protocolo optimizado). Un ejemplo de medidas número crudo puncta sináptica basado en el volumen. Estos valores luego son exportados a un software de hoja de cálculo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> figura 2: control de calidad de la rebanada y parámetro de configuración de puncta sináptica. (A) imágenes representativas de confocal (objetivo 40 x) de la región de interés: la CA1 estrato radiatum (sr) y estrato oriens (tan) de un segmento hippocampal se identifican por la coloración de la MAP2. Barra de escala = 2 μm. (B) las imágenes confocales (60 x objetivo y un 1.3 adicional X aumento en el software de adquisición) de la CA1 estrato radiatum, con los marcadores-vGlut1 (verde) y PSD-95 (rojo)-de rebanadas hippocampal. Tenga en cuenta la identificación de los puncta claro pre y postsinápticos. Orificio mayor a 0.8 μm 3 quedan excluidos de la cuantificación (flechas blancas). Barra de escala = 2 μm (C) Confocal imágenes (60 x objetivo y un 1.3 adicional X aumento en el software de adquisición) de la CA1 estrato radiatum, con los marcadores-vGlut1 (verde)-de criostato de corte secciones hipocampales del cerebro entero fija en PFA. Tenga en cuenta la presencia de orificios grandes y coloración irregular, agrupada vGlut1. Barra de escala = 2 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La evaluación precisa del número de sinapsis es fundamental en el campo de la neurociencia. Aquí, mostramos cómo evaluar la densidad de sinapsis en la región CA1 estrato radiatum rebanadas hippocampal como sistema modelo. La importancia con respecto a los métodos existentes se demuestra en nuestro reciente artículo de investigación sobre el efecto de la deficiencia de Wnt en el hipocampo y donde también se evaluó el número de sinapsis por la solo-sección EM10. La magnitud de la pérdida de sinapsis son similares entre la solo-sección EM y la rebanada de cerebro método descrito aquí10. Por lo tanto, este hallazgo demuestra la exactitud y fiabilidad de la técnica.
Lo importante, una limitación de la solo-sección EM y sinapsis de inmunotinción, tal como se presenta aquí, es la incapacidad para estimar con precisión el número de sinapsis absoluta para una región específica del cerebro. De hecho, es importante identificar cualquier cambio morfológico global, como cambios en el volumen total podrían tener un impacto número sináptica. Otra limitación es que ciertos anticuerpos son menos eficientes en la coloración de las regiones del cerebro intacto, parcialmente debido a la extrema densidad de conexiones sinápticas. Experimentamos mayor calidad coloración de vGlut1 y gephyrin usando esta rodaja preparación y subsiguiente fijación de PFA para un máximo de 1 h, en comparación con la fijación inmediata de todo el cerebro en PFA (figura 2). El último conducido a tinción sináptica agrupada, con agujeros en el tejido. Sin embargo, la penetración de anticuerpos vGlut1 todavía está restringida en ambos métodos (un par de decenas de micras). No superar esta limitación, incluso con el anticuerpo de mayor incubación, pero proporcionando la penetración de anticuerpos es mayor que la profundidad total que es reflejada, no debe ser influencia en el resultado final. Además, se debe tener especial cuidado para asegurarse de que la tinción es incluso a lo largo de toda la pila adquirida.
En nuestro estudio, hemos querido distinguir excitatorio de la sinapsis inhibitorias. Por lo tanto, elegimos vGlut1/PSD-95 y vGAT/gephyrin, respectivamente, como estas proteínas son altamente expresadas en el hipocampo del ratón adulto y son específicas de cada sinapsis subtipo4,5. Otros marcadores sinápticos inhibitorias y excitatorias podrían se han utilizado para identificar cada sinapsis respectivos, tales como enriquecido en cada sinapsis, incluyendo receptores NMDA y de AMPA para los receptores excitatorios y GABAA Receptores de las sinapsis inhibitorias. Otros neurotransmisores o neuromoduladores pueden también identificarse con nuestro protocolo, garantizar que los anticuerpos específicos están disponibles, como se muestra para las sinapsis dopaminérgicas en el estriado22. Además, reduce el grosor de cada loncha a 120 μm puede superar parcialmente la baja cantidad de muestras obtenidas con láminas agudas, que es imprescindible para los estudios de las estructuras pequeñas del cerebro como la amígdala.
Futuras aplicaciones de nuestro protocolo podrían aplicarse en el estudio de diversas áreas del cerebro y trastornos. Por ejemplo, en el cuerpo estriado (una región del cerebro asociada con la enfermedad de Parkinson), una combinación de vGlut2/PSD-95 o vGlut1/PSD-95 se puede usar para diferenciar entre las sinapsis excitatorias de aferentes procedentes de la corteza o tálamo, y22.
En conclusión, hemos demostrado un método fiable para examinar el número de sinapsis en los tejidos del cerebro usando marcadores previos y postsinápticos para definir una sinapsis. Pasos críticos incluyen la preparación de buenas rebanadas hippocampal, un tiempo de fijación de hasta 1 hora en PFA, la aplicación suficiente de medio de montaje, el uso de anticuerpos confiables, ajustes de imagen apropiado de adquisición y detección rigurosas puncta sináptica. En última instancia, este método es relativamente rápido y es fácilmente reproducible por cualquier laboratorio que tienen acceso a un microscopio confocal.

El cerebro humano está compuesto por aproximadamente 1014 sinapsis. Número de sinapsis es estrictamente regulado durante el desarrollo y la maduración del sistema nervioso central (SNC). En todo el desarrollo, el número de sinapsis es modulada por la sinaptogénesis y la poda para formar redes neuronales funcionales. Aprendizaje y la memoria son compatibles con la regulación del número de sinapsis y la fuerza, un proceso conocido como potenciación sináptica y depresión1. Lo importante es la estabilización de la sinapsis Maduritas es esencial para mantener las conexiones de red neuronal. Además, se han reportado déficits en la densidad de sinapsis en las primeras etapas de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA)2. Por lo tanto, la capacidad de identificar con precisión y evaluar el número de sinapsis es fundamental para la evaluación de la patología y fisiología cerebral.
La extrema densidad y naturaleza compacta de sinapsis hacen difícil estimar su número preciso en áreas del cerebro intacto. Sinapsis químicas del sistema nervioso están hechas de dos neuronas en aposición estrecha, separados por una hendidura sináptica3. La terminal presináptica o bouton sináptico, surge de un axón y consiste en vesículas acumuladas, que contienen neurotransmisores que definen la especificidad de una sinapsis, es decir, glutamato y ácido gamma - aminobutírico (GABA) para excitatorios y inhibitorio sinapsis, respectivamente. Las membranas de las vesículas contienen vesiculares transportadores específicos para cada neurotransmisor: glutamato vesicular transportador (vGlut) para el glutamato y el transportador vesicular de GABA (vGAT) para GABA. La terminal postsináptica es una estructura muy densa compuesta por varias proteínas, incluyendo proteínas andamio, receptores y moléculas de adhesión. En las sinapsis excitatorias, proteína 95 densidad postsináptica (PSD-95) es el más abundante andamio proteína4, modulación excitatoria N-methyl-D-aspartate(NMDA-) y receptor del ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionico (AMPA) funcionar, mientras que gephyrin anclas receptores inhibitorios a la terminal postsináptica inhibitoria5. En general, la especificidad de las proteínas en compartimientos de pre- y postsinápticos ayuda en la diferenciación y la identificación de subtipos de sinapsis.
La evaluación del número de sinapsis se puede realizar con diferentes técnicas. El más común es el uso de la microscopia electrónica (EM), que permite el análisis de la sinapsis en áreas del cerebro intacto y compacto con alta magnificación y resolución. Sin embargo, esta técnica es muy costosa, requiere preparación de muestras complicadas y es muy lento. Otras técnicas incluyen el uso de la matriz tomografía6, que tiene una gran desventaja en que requiere equipo especializado y costoso realizar el análisis. Además, líneas transgénicas expresando marcadores sinápticos específicos son útiles en evaluar la sinapsis número7, pero la generación de nuevas líneas puede ser restrictivo y costoso, y la sobreexpresión de proteínas puede resultar en no deseado fuera del objetivo fenotipos.
Debido a estas limitaciones y para simplificar, muchos investigadores evaluación número de sinapsis por examinar los niveles de la proteína sináptica total. Sin embargo, puede observarse pérdida de sinapsis antes de cambios sustanciales en la proteína, como estructural remodelación sináptica en la dispersión de aposición pre o postsináptica, con la no degradación de proteínas sinápticas. Además, en AD, los niveles de proteínas sinápticas son reducidas siguientes sinapsis degeneración o muerte neuronal8,9. La cuantificación de los niveles totales no permite esta distinción. Por lo tanto, es necesario desarrollar un método confiable, accesible y preciso para la evaluación del número de sinapsis en el cerebro.
En este artículo describimos cómo bien identificar y determinar el número de sinapsis usando microscopia de la inmunofluorescencia en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor. Las sinapsis son definidas por la colocalización de marcadores previos y post sinápticos que aparecen en una distribución de punteado. Demostramos la validez de esta técnica a través del estudio de Wnt de señalización en el cerebro. Wnts son proteínas de secreción importantes para la formación, eliminación y mantenimiento de las sinapsis. La inducción en vivo de un antagonista de la secretada de la cascada de Wnt, Dickkopf-1 (Dkk1), conduce a la pérdida sináptica excitatoria conservando las sinapsis inhibitorias en el hipocampo10. Ilustramos la identificación y conteo de sinapsis inhibitorias y excitatorias en rebanadas de hipocampales de un ratón adulto expresando Dkk1 y resaltar la transferencia de esta técnica a otros tipos de preparaciones de cultivo de tejidos.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario</td><td>Millipore</td><td>AB5905</td><td>vGlut1 (1:2000)</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA1-046</td><td>PSD-95 (1:500)</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario</td><td>Synaptic Systems</td><td>131 004</td><td>vGAT (1:500)</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario</td><td>Synaptic Systems</td><td>147011</td><td>Gephyrin (1:500)</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td>MAP2 (1:10000)</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario</td><td>Jackson Laboratories</td><td>706-545-148</td><td>Burro Anti-Conejillo de Indias Alexa Fluor 488 (1:600)</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario</td><td>Abcam</td><td>ab175470</td><td>Burro Anti-Conejo Alexa Fluor 568 (1:600)</td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>SouthernBiotech</td><td>00-4958-02</td><td>Fluoromount-G</td></tr><tr><td>Confocal Microscopio</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>FV1000 Microscopio confocal con un objetivo de aceite de apertura numérica (NA) de 60x 1,35. Para vGlut1, utilice un láser 488 con una potencia porcentual del 14%. Para PSD-95 utilice un láser 559 con una potencia porcentual del 20%.</td></tr><tr><td>Software de análisis</td><td>PerkinElmer</td><td>NA</td><td>Volocity</td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>Swann-Morton</td><td>203</td><td>No 11</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Loctite</td><td>1446875</td><td></td></tr><tr><td>95% O2, 5% CO2</sub</td><td>>BOC</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro Placa de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Thermo</td><td>7107</td><td>Placa de Petri de 08-1,0 mm de espesor</td></tr><tr><td>Corning</td><td></td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>ratones iDkk1</td><td>N/A</td> Los ratones N<td>/A</td> se <td>obtuvieron cruzando ratones transgénicos tetO Dkk1 con ratones transgénicos CaMKII&alpha; rtTA2. Ratones transgénicos TetO Dkk1 y CaMKII&alpha; rtTA2 se cruzaron en estado heterocigótico. Ambas líneas de ratones se criaron con un fondo C57BL/6J. Se utilizaron como controles un solo transgénico y un compañero de camada WT.</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Reactivos para soluciones:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Ca2Cl</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Mg2Cl</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Ácido quinurénico</td><td>Sigma</td><td>K3375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Ácido pirúvico</td><td>Sigma</td><td>107360</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Sérum</td><td>Burro Millipore</td><td>S30-100ml</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

En el cerebro, las sinapsis son uniones especializadas entre neuronas, determinando la fuerza y la extensión de la señalización neuronal. El número de sinapsis es estrictamente regulado durante el desarrollo y maduración neuronal. Lo importante, déficit en el número de sinapsis puede conducir a la disfunción cognitiva. Por lo tanto, la evaluación del número de sinapsis es parte integral de la neurobiología. Sin embargo, como las sinapsis son pequeñas y muy compactas en el cerebro intacto, la evaluación del número absoluto es un reto. Este protocolo describe un método para fácilmente identificar y evaluar la sinapsis en el hipocampales rebanadas roedores usando microscopia de la inmunofluorescencia. Incluye un procedimiento de tres pasos para evaluar las sinapsis en imágenes de microscopía confocal de alta calidad mediante el análisis de colocalización de proteínas pre- y postsinápticas en rebanadas hippocampal. También explica cómo el análisis se realiza y da ejemplos representativos de sinapsis tanto excitatorias como inhibitorias. Este protocolo proporciona una base sólida para el análisis de las sinapsis y se puede aplicar a cualquier investigación investigar la estructura y función del cerebro.

Pérdida de sinapsis ocurre en enfermedades neurodegenerativas como el anuncio y la enfermedad de Parkinson2,11,12. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a estos déficits siguen siendo mal entendidos. Deficiencias en la señalización de Wnt se han asociado con AD13,14,15,16,17. Wnts son glucoproteínas secretadas y juegan un papel esencial en la formación de sinapsis y la modulación de la transmisión sináptica18,19,20,21. Recientemente, se identificaron Wnts como reguladores claves de mantenimiento sináptica en el sistema nervioso maduro10,22. Para estudiar con precisión el impacto de Wnt de señalización en las sinapsis en el hipocampo de ratones modificados genéticamente, aprovechó de una preparación de corte de cerebro y microscopía confocal para evaluar los cambios en el número de sinapsis. Se identificaron rebanadas sanos en el que la estructura estaba bien conservada (figura 2A). Por otra parte, la selección de puncta sináptica se definió cuidadosamente, con la exclusión de grandes objetos manchados que probablemente representan agregadas proteínas (figura 2B). Este criterio se aplicó a todas las imágenes, con los mismos parámetros de análisis estricto.
Se utilizó un sistema del modelo transgénico que induce la expresión de la antagonista de Wnt secretada Dkk1 en adulto controlan de ratones (iDkk1) debajo de tetraciclina (véase la Tabla de materiales)10,22. Hemos demostrado que el bloqueo de la señalización de Wnt en el hipocampo adulto provoca pérdida de sinapsis excitatorias específicamente en la región CA1 de radiatum estrato (figura 3). Figura 3A muestra representativas imágenes confocales de marcadores previos y postsinápticos excitatorios (vGlut1 y PSD-95, respectivamente) de rebanadas de hipocampales de ratones iDkk1 expresando Dkk1 por dos semanas, así como sus respectivos controles. Analizamos estas imágenes utilizando el software de Volocity y demostró una reducción significativa en el número de sinapsis excitatorias, cuantificada por la co-localización de puncta vGlut1 y PSD-95-marcado en la región CA1 del hipocampo de ratones de iDkk1 siguiendo la inducción de Dkk1 durante dos semanas (figura 3B, * p &#60; 0.05; Prueba de Kruskal-Wallis; 6 ratones por genotipo). En el CA1 estrato radiatum, el número de sinapsis excitatorias puncta por 1.000 μm3 se redujo de 500 en ratones control a 300 en ratones iDkk1. Por el contrario, expresión de Dkk1 inducida no afectó el número de las sinapsis inhibitorias (identificado por la colocalización entre los marcadores pre y postsinápticos vGAT y gephyrin, respectivamente), como se muestra en la Figura 4A-B (p &#62; 0.05; Prueba de Kruskal-Wallis; 3 ratones por genotipo).
Lo importante, se realizó un análisis de poder estadístico para estimar la cantidad de rebanadas y animales necesarios para generar estos resultados robustos. Con R, se calculó que se necesitaban aproximadamente 35 rebanadas por condición (animales de rebanadas x 6 3 imagenes x 3 = 36) para detectar un tamaño del efecto grande (f = 0.4) con 80% de confianza (energía = 0,8) en un ANOVA unidireccional con la replicación y el bloqueo, como se describe en el paso 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
Figura 3: pérdida de sinapsis excitatorias en rebanadas de hipocampales de ratones iDkk1. (A) representante de imágenes confocales de la CA1 estrato radiatum Mostrar excitatoria sinapsis, identificada por la co-localización de vGlut1 y PSD-95 (flechas blancas). La parte inferior representa un aumento mayor del rectángulo resaltado. Barras de escala = 2 μm. (B) el porcentaje de sinapsis excitatorias entre control y iDkk1 se cuantificó utilizando el software mencionado en la Tabla de materiales (* p &#60; 0.05; Prueba de Kruskal-Wallis; 6 ratones por genotipo). Los datos son ± mentionada aquí SEM. Esta figura se ha modificado de la referencia10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
Figura 4: las sinapsis inhibitorias son sin cambios en rebanadas de hipocampales de ratones iDkk1. (A) representante de imágenes confocales de la CA1 estrato radiatum de las sinapsis inhibitorias por la colocalización entre vGAT y gephyrin (flechas blancas). La parte inferior representa un aumento mayor del rectángulo resaltado. Barras de escala = 2 μm. (B) porcentaje de las sinapsis inhibitorias entre ratones control y iDkk1, como cuantificado utilizando software Volocity (p &#62; 0.05; Prueba de Kruskal-Wallis; 3 ratones por genotipo). Los datos son ± mentionada aquí SEM. Esta figura se ha modificado de la referencia10. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alta sacarosa ACSF componentes</td>
			<td>Concentración</td>
			<td>Notas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido quinurénico</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido pirúvico</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Añadir después la oxigenación de la solución</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 mM</td>
			<td>Añadir después la oxigenación de la solución</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucosa</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarosa</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cámara sumergida ACSF componentes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Añadir después la oxigenación de la solución</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 mM</td>
			<td>Añadir después la oxigenación de la solución</td>
		
		<tr>
			<td>D-glucosa</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	

Tabla 1: Composición de ACSF.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tampón de bloqueo/permeabilizing</td>
			<td>Concentración</td>
			<td>Notas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suero de burro</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>0.50%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x PBS</td>
			<td></td>
			<td>pH a 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1.37 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>27 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>18 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA/4% sacarosa</td>
			<td></td>
			<td>pH a 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>Diluir de 10 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>1.33 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarosa</td>
			<td>117 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: Buffers utilizados para la tinción inmunofluorescente.

Un protocolo para identificar con precisión y analizar sinapsis en rebanadas hippocampal mediante inmunofluorescencia se describe en este artículo.

Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

El objetivo general de este protocolo de inmunotinción es evaluar la densidad sináptica en cortes cerebrales ex vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia y resulta útil al estudiar los cambios en la densidad sináptica, como los observados en enfermedades neurodegenerativas. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una estimación semicuantitativa de la densidad sináptica, que puede compararse entre condiciones experimentales preparadas al mismo tiempo.Comience colocando el cerebro de ratón en una placa de Petri. A continuación, retire el cerebelo y una pequeña sección de la corteza frontal con un escalpelo, antes de realizar una hemiseción a lo largo de la línea media del cerebro. Gire un hemisferio sobre el lado que acaba de cortarse y péguelo sobre la plataforma de un vibrátomo.Vierta ACSF frío con hielo en la cámara del micrótomo y oxide la solución. Corte secciones de 200 a 300 micrones de espesor que incluyan toda la región de interés. Para el hipocampo, se deben obtener aproximadamente de tres a cuatro secciones por hemisferio.Utilice una pipeta Pasteur de plástico para transferir las secciones a una cámara controlada por temperatura sumergida en ACSF oxigenado. Mantenga a 34 grados Celsius durante 30 minutos. Una vez transcurridos los 30 minutos, transfiera las secciones a una placa de 24 pocillos que contenga paraformaldehído al 4% con sacarosa al 4%, y fije durante 20 minutos a una hora a temperatura ambiente.Después de la fijación, lave las secciones tres veces con PBS 1x durante 10 minutos cada vez. Para comenzar la tinción por inmunofluorescencia, reemplace el PBS en los pocillos de las secciones con tampón de bloqueo y permeabilización, e incube a temperatura ambiente durante cuatro a seis horas en agitación. Hacia el final del paso de bloqueo, diluya el anticuerpo contra vGlut1 1:2.000 en el tampón de bloqueo y permeabilización.Tenga en cuenta que esta dilución puede variar según la empresa y el lote del anticuerpo utilizado. Incube las secciones en la solución de anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados Celsius. Utilice una plataforma agitadora con movimiento vigoroso.La distribución uniforme de los anticuerpos primarios y secundarios es importante para una tinción óptima. Según nuestra experiencia, una agitación enérgica permite la mejor penetración de los anticuerpos. Después de la incubación con el anticuerpo primario, lave las secciones tres veces en PBS durante 10 minutos cada vez, como antes.Durante el último lavado, diluya los anticuerpos secundarios apropiados uno a 500 en el tampón de bloqueo. Luego, incube las secciones en esta solución durante dos a tres horas a temperatura ambiente. Asegúrese de que las secciones estén protegidas de la luz, ya que los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz.Después de lavar los cortes, como antes, utilice un pincel para retirar cuidadosamente los cortes de la placa de 24 pocillos y colóquelos uniformemente sobre portaobjetos de vidrio previamente etiquetados. Añada una gota de medio de montaje encima de cada corte. Luego, coloque suavemente una cubierta de vidrio encima de los cortes, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas de aire.Protéjalos de la luz y deje secar las laminillas durante un mínimo de tres a cuatro días a temperatura ambiente. Almacene las laminillas a cuatro grados Celsius a corto plazo. Pero para almacenamiento a largo plazo, guárdelas a menos 20 grados Celsius.Comience utilizando un objetivo de 10x o 20x para identificar la región del hipocampo que se va a imaginar, en este caso, las sinapsis entre las neuronas piramidales del CA1 y los axones colaterales de Schaffer. Cambie a un objetivo de inmersión en aceite de 40x o 63x, y asegúrese de que la anatomía del corte esté intacta identificando neuritas continuas y una estructura organizada. Utilice un marcador neuronal, como MAP2, como referencia.Ajuste la configuración de cada canal para obtener una señal y contraste óptimos con una resolución de 1.024 por 1.024 píxeles. Establezca la intensidad de cada láser para evitar la saturación de cualquier píxel. Evalúe la profundidad en la que la tinción es uniforme y luego configure el software para adquirir pilas de imágenes de al menos ocho planos equidistantes de 250 nanómetros.Luego, tome tres pilas de imágenes representativas adyacentes del mismo área de interés por corte. Repita la adquisición en al menos tres cortes por condición y de seis a ocho animales por grupo de tratamiento. Las sinapsis excitadoras pueden identificarse por la colocalización entre vGlut1 y PSD95, como indican las flechas blancas en la imagen de mayor magnificación.El bloqueo de la señalización de Wnt en el hipocampo adulto mediante la inducción del antagonista de Wnt Dkk1 provoca la pérdida de sinapsis excitadoras, específicamente en la capa radiada del CA1. Se cuantificó el porcentaje de sinapsis excitadoras entre ratones control y ratones iDkk1, observándose que era significativamente menor en los animales transgénicos iDkk1. Las sinapsis inhibitorias pueden identificarse mediante la colocalización entre vGat y Gephyrin.Se cuantificó el porcentaje de sinapsis inhibitorias entre ratones control y ratones iDkk1, y no se detectó ninguna diferencia significativa. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener el máximo cuidado posible con las secciones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la densidad sináptica en secciones cerebrales ex vivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

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