Basado en la transformada de Fourier Análisis difracción de vivir Caenorhabditis elegans
13 de septiembre de 2017
Este manuscrito describe cómo distinguir diferentes nematodos utilizando firmas de difracción del campo lejano. Comparamos la locomoción de 139 tipo salvaje y 108 "Roller" C. elegans promediando las frecuencias asociadas con la firma de difracción de Fraunhofer temporal en un solo lugar usando un láser de onda continua.
El objetivo general de este análisis de difracción basado en Fourier es caracterizar la locomoción de C. elegans en tiempo real a medida que la especie se mueve libremente en un espacio tridimensional. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la neurobiología mediante la descripción de las respuestas de las especies a diferentes densidades de solución o mutantes locomotores. Este método sirve como línea base para el análisis de Fourier de especies microscópicas.
Tiene la ventaja de que cada especie microscópica tendrá su propio espectro de Fourier. Aunque este método puede proporcionar información sobre la locomoción de C. elegans, también se puede aplicar a otros microorganismos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque encontrar el nematodo en la cubeta, bajo el rayo láser, puede ser un desafío.
Primero tuvimos la idea de este método en un intento de aprender sobre el comportamiento de natación a partir de la señal de difracción temporal, en sí misma, una señal ruidosa. Para comenzar, asegure un láser de helio y neón cerca de la esquina trasera izquierda del banco de trabajo óptico y conéctelo a una fuente de alimentación. Coloque un filtro de densidad neutra entre el láser y la ubicación de la muestra, de modo que el rayo láser viaje a través del filtro antes de llegar a la muestra.
Usando dos espejos de dirección de aluminio de la superficie delantera, construya un periscopio asegurando el primer espejo después del filtro de densidad neutra. Luego, asegure el segundo espejo a unos 10 centímetros por debajo del primer espejo para dejar espacio para dirigir el rayo láser. Inserte una cubeta entre los espejos y alinee el rayo láser y la cubeta de modo que el rayo láser viaje verticalmente a través de la cubeta.
A continuación, fije el fotodiodo directamente frente al segundo espejo de modo que su sensor quede orientado hacia el espejo. Luego, coloque una cubeta llena de agua en un soporte. Ajuste la altura del soporte y los ángulos de los espejos uno y dos para que el rayo láser viaje a través de la cubeta y se dirija cerca, pero no directamente, del fotodiodo.
Use una palanca para asegurarse de que el soporte forme una superficie nivelada para la cubeta. Si el soporte no está nivelado, realice los ajustes apropiados hasta que esté nivelado. Por último, conecte el fotodiodo al osciloscopio digital mediante el cable USB suministrado y conéctelo al ordenador.
Cargue el software del osciloscopio y ajuste la frecuencia de muestreo a al menos ocho hercios para resolver el ciclo de eliminación de basura del gusano lo suficiente. Use un pico de alambre de platino delgado y aplanado para transferir cuatro nematodos adultos a una placa de Petri fresca llena de agar NGM. A continuación, retire una cubeta de plástico desechable de su paquete, teniendo cuidado de tocar solo la cubeta por sus lados estriados.
Luego, use una micropipeta para pipetear agua destilada en una cubeta hasta que la cubeta esté aproximadamente 80% llena de agua destilada. Coloque la placa de Petri que contiene C. elegans bajo un telescopio de disección. Luego, use el pico de platino para quitar un C elegans maduro de la placa de Petri y sumerja el pico en la cubeta.
Mueva el pico en círculos para desalojar el nematodo si es necesario. Manipule los nematodos con cuidado y no agite la cubeta. Agitar la cubeta puede hacer que los gusanos no respondan.
Para evitar que se formen burbujas en la cubeta, llénela con agua destilada hasta que se mueva ligeramente sobre la parte superior de la cubeta. Luego, llene la tapa con agua y coloque rápidamente la tapa en la cubeta. Con papel para lentes, retire las gotas de agua que puedan haberse derramado sobre la cubeta.
Además, use papel para lentes para eliminar las pequeñas gotas restantes. Encienda el láser de neón de helio y ajuste la configuración de frecuencia para que produzca un rayo rojo. A continuación, encienda el sensor.
Sostenga la cubeta por sus lados estriados e inclínela suavemente hasta que el nematodo esté aproximadamente en el centro de la cubeta. Luego, coloque la cubeta en el soporte del sistema óptico, centrando el gusano dentro del rayo láser que viaja del espejo uno al espejo dos. A continuación, coloque el fotodiodo en el patrón de difracción de modo que la ubicación del fotodiodo y el máximo central del patrón de difracción no coincidan.
Luego, gire los filtros de densidad neutra para que haya una salida de voltaje notable del fotodiodo. Asegúrese de limitar la luz con el filtro de densidad neutra, para evitar que el fotodiodo se sature. Una línea plana indica sobresaturación o falta de intensidad.
Una vez que el patrón de difracción en movimiento es visible, recopile datos con el fotodiodo haciendo clic en el botón de inicio en el software, controlando el osciloscopio mientras monitorea el movimiento del gusano. Continúe tomando medidas hasta que el gusano se mueva fuera del rayo láser y el patrón de difracción desaparezca. Si la cubeta está rayada, deséchela junto con el gusano y comience de nuevo.
Después de unos 20 segundos, detenga el proceso de recopilación de datos haciendo clic en el botón de parada en el software del osciloscopio. Guarde los datos de cada prueba en formato de texto, valores separados por comas. Recopile al menos 50 conjuntos de datos para cada fenotipo y utilice de ocho a 10 animales por ensayo.
Aquí se muestran ejemplos de movimiento secuencial de gusano modelado y los patrones de difracción correspondientes. Los patrones de difracción modelados se asemejan cualitativamente a los patrones experimentales e indican que la simulación modeló con éxito el nematodo. Además, se puede mostrar cuantitativamente la firma de difracción temporal de los rodillos y los c elegans de tipo salvaje.
Como se ve aquí, cada nematodo se agita a diferentes velocidades y amplitudes. Las transformadas digitales medias de Fourier permiten identificar al nematodo por la amplitud de su espectro de frecuencias de difracción. El espectro de gusano de tipo salvaje está dominado por frecuencias más bajas que el espectro de movimiento de los rodillos.
Aquí hay un ejemplo de la oscilación w que se puede considerar como dos movimientos marinos opuestos. Por el contrario, el rodillo formará principalmente una c hacia un lado y se verá así. Al examinar las frecuencias, el movimiento w es más complejo, revelando más frecuencias bajas secundarias que el movimiento c.
Una vez dominado, se puede recopilar un conjunto de datos en unos dos minutos si la técnica se realiza correctamente. Se tarda entre 20 y 30 minutos en configurar la óptica para una serie de conjuntos de datos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe manipular a los C. elegans con cuidado, para preservar la integridad de su locomoción.
Siguiendo este procedimiento, podemos aplicar otros métodos, como la reconstrucción de un tractor y el análisis no lineal para aprender más sobre el movimiento de C. elegans. Tras su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en neurobiología estudien con mayor profundidad los mutantes locomotores en C. elegans. Después de ver este video, debería tener una comprensión bastante buena de cómo generar patrones de difracción para nematodos vivos y cómo analizarlos.
No olvide que trabajar con láseres puede ser extremadamente peligroso y se deben tomar precauciones, como no hacer que los láseres viajen a la altura de los ojos, mientras se realiza el procedimiento.
Descripción general
Este estudio presenta un método de análisis de difracción basado en Fourier para caracterizar la locomoción de C. elegans en tiempo real. Al analizar las firmas temporales de difracción de Fraunhofer, los investigadores pueden distinguir entre fenotipos de tipo salvaje y fenotipos "Roller" según sus patrones de locomoción.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurobiología
- Biofísica
- Microscopía
Antecedentes
- C. elegans sirve como organismo modelo para estudiar la locomoción y la neurobiología.
- Cada especie microscópica tiene un espectro de Fourier único que puede proporcionar información sobre su comportamiento.
- El análisis de la locomoción puede ayudar a comprender las respuestas de las especies a los cambios ambientales.
- Existen desafíos para localizar nematodos dentro del montaje experimental.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para el análisis en tiempo real de la locomoción de C. elegans.
- Distinguir entre diferentes fenotipos según sus patrones de locomoción.
- Proporcionar una línea base para el análisis de Fourier aplicable a diversas especies microscópicas.
Métodos Utilizados
- Configuración de un láser de helio-neón y sistema óptico para análisis de difracción.
- Uso de un fotodiodo y un osciloscopio digital para recopilar datos sobre el movimiento de nematodos.
- Preparación de muestras de C. elegans en un ambiente controlado.
- Recopilación y análisis de patrones de difracción para identificar características de la locomoción.
Resultados principales
- Se observaron patrones de difracción distintos para el tipo salvaje y C. elegans Roller.
- Las transformadas digitales promedio de Fourier revelaron diferencias en las frecuencias de locomoción.
- El método modeló con éxito el movimiento de nematodos y proporcionó información cuantitativa.
- La recolección de datos fue eficiente, lo que permitió realizar múltiples ensayos en un breve período de tiempo.
Conclusiones
- El análisis de difracción basado en Fourier es efectivo para estudiar la locomoción de C. elegans.
- Este método puede adaptarse para otros organismos microscópicos.
- Comprender los patrones de locomoción puede contribuir a la investigación neurobiológica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la caracterización en tiempo real y sin marcado de la locomoción de microorganismos mediante el análisis de Fourier de las firmas de difracción, proporcionando una lectura fenotípica cuantitativa para aplicaciones en neurobiología y biofísica. Apoya la validación de objetivos al vincular mutaciones genéticas con resultados conductuales medibles, facilitando la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. El enfoque ofrece una plataforma escalable y reutilizable para el cribado de fenotipos locomotores en especies microscópicas, mejorando la confianza predictiva en los sistemas modelo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de hipótesis terapéuticas mediante la correlación de perturbaciones genéticas con espectros distintos de frecuencia de locomoción.
- Valor operativo: Ofrece un cribado fenotípico sin etiquetas y en tiempo real, sin necesidad de etiquetas fluorescentes ni reporteros genéticos.
- Valor predictivo: Distingue fenotipos silvestres y mutantes mediante patrones de difracción transformados por Fourier, apoyando la reducción de riesgos biológicos de los objetivos locomotores.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayos: Genera salidas cuantitativas y reproducibles en el dominio de la frecuencia, adecuadas para cribado fenotípico de alto contenido.
- Escalabilidad: Permite la recopilación de más de 50 conjuntos de datos por fenotipo utilizando entre 8 y 10 animales por ensayo, lo que posibilita una solidez estadística.
- Reutilización de la plataforma: Sirve como base para el análisis de Fourier aplicable a cualquier especie microscópica con firmas espectrales únicas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Relaciona fenotipos neuroconductuales en C. elegans con posibles déficits locomotores relevantes para enfermedades en modelos superiores.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Utiliza espectros de Fourier promediados para validar modelos computacionales de la dinámica de la forma del gusano, aumentando la confianza en las asociaciones fenotipo-genotipo.
- Ayuda para la Toma de Decisiones: Permite tomar decisiones de avance o interrupción basadas en la divergencia espectral entre cepas, reduciendo la ambigüedad en la validación funcional.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano, posicionando la caracterización fenotípica tras la manipulación genética y antes de la identificación del fármaco líder, al proporcionar puntos finales locomotores cuantificables para la validación de rutas metabólicas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la conversión de comportamientos complejos de nado en patrones de frecuencia analizables mediante transformación de Fourier.
- Tamizaje: Proporciona lecturas estandarizadas basadas en difracción que permiten comparar la actividad locomotora entre diferentes fondos genéticos o tratamientos con compuestos.
- Análisis: Genera espectros de frecuencia y amplitud que permiten distinguir entre cepas fenotípicas según sus modos de oscilación dominantes.
- Investigación Traducional: Conecta métricas microscópicas de locomoción con la función neurobiológica, facilitando la extrapolación a modelos preclínicos de trastornos del movimiento.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma óptica transferible para el tamizaje fenotípico basado en Fourier en diversos modelos de microorganismos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del objetivo mediante la fenotipificación objetiva en el dominio de la frecuencia de la locomoción.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante un montaje óptico estandarizado y la normalización de la señal (dividiendo por la intensidad máxima).
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir una fenotipificación rápida (2 minutos por conjunto de datos) tras una configuración inicial de 20 a 30 minutos.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo al cuantificar la divergencia fenotípica entre cepas silvestres y mutantes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en alineación óptica y seguridad láser para evitar la saturación y garantizar la formación adecuada del patrón de difracción.
- Depende de un láser de helio-neón estable, un fotodiodo y un osciloscopio digital con una frecuencia de muestreo ≥8 Hz para resolver las frecuencias de locomoción.
- Necesita un manejo cuidadoso de la muestra para prevenir la formación de burbujas o estrés en los nematodos, lo cual podría distorsionar las firmas temporales.
- Implica la transferencia manual de nematodos utilizando una aguja de platino, lo que representa un cuello de botella para la adaptación de alto rendimiento.
- Se limita a organismos lo suficientemente pequeños como para permanecer suspendidos en el trayecto del láser sin sedimentación ni efectos de las paredes durante la medición.
