Name: Basado en la transformada de Fourier Análisis difracción de vivir Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprende a analizar la locomoción de Caenorhabditis elegans en tiempo real mediante difracción basada en transformada de Fourier. Este método permite distinguir fenotipos silvestres y mutantes en neurobiología.

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Agradecemos a Juan Vásquez por sus contribuciones computacionales con este proyecto. Estamos agradecidos por el apoyo de la Vassar College licenciatura investigación verano Instituto (URSI), el fondo de investigación de salmón de Maynard de Lucy y la NSF award no. 1058385.

1. crecimiento de C. elegans y mantenimiento <ol><li>Prepare platos de cultura nematodos.
	<ol><li>Llenar los platos de Petri con una solución de agar y dejar que se solidifique, luego semilla con una cultura de e. coli de la OP50 cepa 9 , 10.</li>
	</ol></li> <li>Preparar una población a partir de nematodos adultos en cada plato poniendo varios gusanos adultos en fresco lleno de agar placas de Petri con un parche de e. coli. Mantener las culturas NEMATODAS a 20 ° C en una incubadora. 
	Nota: Cepas de nematodos pueden obtenerse desde el centro de genoma de Caenorhabditis elegans. Para este estudio, el tipo salvaje, N2, la tensión y la OH7547 (otls199 [cat-2::GFP + rgel-1 (F25B3.3):: dsRed + cepa rol-6(su1006)]), que exhibe un fenotipo de rodillo, utilizaron.</li>
	<li>Propagar gusanos para futuros cultivos.
	<ol><li>Quitar el Petri dish con C. elegans y un hábitat sin usar placa de Petri de la incubadora con control de temperatura. Coloque sobre la platina de un microscopio de disección.</li>
		<li>Luz del mechero de Bunsen y esterilizar el platino selección Nematoda colocando el metal en la llama hasta que brilla intensamente rojo. Permita que la hoja se enfríe a temperatura ambiente. No establece la selección o que la hoja entra en contacto con contaminantes.</li>
		<li>Toque suavemente la punta de la selección hasta el borde del círculo de las bacterias. Esta sustancia pegajosa y hará recoger los nematodos adultos fácil.</li>
		<li>Transferir hasta 4 nematodos grávidos a una placa de Petri llenas de agar medio de crecimiento de nematodos (NGM) e incubar a 20 ° C. Los gusanos ponen huevos que se maduran en cuatro días.</li>
		<li>Vuelva los nematodos restantes a la incubadora después de mover cuatro nematodos adultos.</li>
	</ol></li></ol> 2. Configuración óptica ( figura 1) <ol><li>Secure helium-neon del laser cerca de la esquina trasera izquierda de la mesa de trabajo óptico y conéctelo a una fuente de energía. 
	Nota: El láser &#39; viga s debe cumplir con los requisitos para el sobremuestreo. El C. elegans son aproximadamente de 1 mm de largo, por lo tanto, el rayo láser debe tener un diámetro superior a 2 mm durante incidentes en el nematodo, pero no más de 5 mm para que el patrón de difracción no es difícil localizar.</li>
	<li>Colocar un filtro de densidad neutra entre el láser de helio-neón y la muestra tal que el haz láser viaja a través del filtro antes de llegar a la muestra.</li>
	<li>Manejo de aluminio superficie frontal dos usando espejos, construir un periscopio asegurando el primer espejo después del filtro de densidad neutra. Fije el segundo espejo de 10 cm por debajo del primer espejo a dar espacio para dirigir el rayo láser e insertar la cubeta entre los espejos. Alinee el rayo láser y la cubeta de manera que el rayo láser que recorre verticalmente la cubeta. 
	Nota: La distancia entre el organismo diffracting y el fotodiodo debe ser mucho más grande que el organismo sí mismo para lograr la difracción del campo lejano. En este experimento, la distancia entre la cubeta y el fotodiodo es de 20 cm.</li>
	<li>Garantizar el fotodiodo frente al segundo espejo con su sensor mirando hacia el espejo. 
	Nota: La cubeta que contiene el nematodo se colocará entre los dos espejos con abrazaderas de química. Consulte las secciones 4 y 5.</li>
	<li>Colocar una cubeta llena de agua en el soporte. Ajuste la altura del soporte. Ajustar las alturas y los ángulos de mirror 1 y mirror 2 para que el haz láser viaja a través de la cubeta dirigida cerca pero no directamente en el fotodiodo.</li>
	<li>Utilice un nivel para soportes forma una superficie nivelada para la cubeta. Ajustar los espejos más si es necesario.</li>
	<li>Conectar el fotodiodo al osciloscopio digital mediante el cable USB suministrado con el osciloscopio digital. Conecte el osciloscopio digital a la computadora que se utilizará para registrar y guardar los datos.</li>
</ol> 3. Configuración del osciloscopio <ol><li>usando el software para el osciloscopio en la computadora, establece la frecuencia de muestreo en menos de 8 Hz a resolver el ciclo de la paliza del gusano suficientemente. 
	Nota: La frecuencia de muestreo debe ser más de dos veces la de las frecuencias esperada paliza de las especies para que se cumpla el teorema de Nyquist 11.</li>
</ol> 4. Preparando el gusano y la cubeta de recogida de datos <ol><li>transferir cuatro nematodos adultos a una fresco NGM 10 lleno de agar placa de Petri con un pico aplanado, delgado alambre de platino (ver sección 1.3).</li>
	<li>Eliminar una cubeta desechable de plástico de su envase, teniendo cuidado de tocar sólo la cubeta en sus caras surcadas.</li>
	<li>Uso una micropipeta para pipetear agua destilada en la cubeta hasta que la cubeta es aproximadamente el 80% lleno de agua destilada. 
	Nota: Es importante solamente agua destilada o ionizadas buffers como M9 10 o tampón fosfato salino (PBS) al manejo de los nematodos, como agua del grifo contiene compuestos de microorganismos-asesinato.</li>
	<li>Coloque la placa de Petri que contiene el C. elegans para ser utilizado en un ámbito disección.</li>
	<li>Con la selección platino, saque una madura C. elegans de la caja Petri y sumerge el pico en la cubeta, mueve la selección en círculos, si es necesario desplazar nematodo.</li>
	<li>Para prevenir burbujas en la cubeta, llene la cubeta con agua hasta que abulta ligeramente sobre la cubeta de &#39; superior de s. Llene la cubeta &#39; cap s completamente con agua luego rápidamente, ponga la tapa sobre la cubeta de.</li>
	<li>Utilizar un trapo de limpieza óptico para quitar las gotas de agua que pueden haber derramado sobre y óptico limpieza papel para limpiar cualquier pequeñas gotitas restantes.</li>
</ol> 5. Tiempo real de adquisición de datos de difracción patrón de intensidad de cambios <ol><li>vuelta en el helio-neon del laser y ajustar la configuración de frecuencia/color que produce un haz rojo. Encienda el sensor de. 
	PRECAUCIÓN: Usar un haz de baja energía a 632 nm, como C. elegans evitar luz de alta frecuencia (azul) 12.</li>
	<li>Localizar el gusano en la cubeta. Manteniendo la cubeta en sus caras surcadas, incline suavemente la cubeta hasta que el nematodo es aproximadamente en el centro de la parte de la cubeta de. 
	Nota: Sacudiendo o inclinando la cubeta violentamente hace el gusano a chocar con las paredes de la cubeta. Esto puede dañar el nematodo.
	<ol><li>Lugar la cubeta en el soporte en el sistema óptico, el gusano en el láser de centrado &#39; s rayo reflejado de espejo de 1 a 2 de espejo. Asegúrese de eliminar luz.</li>
	</ol></li> <li>El gusano en el rayo láser del centro.
	<ol><li>Poner el fotodiodo en el patrón de difracción que no coinciden la ubicación del fotodiodo y lo máximo central del patrón de difracción.</li>
		<li>Ajustar el filtro de densidad neutra para evitar la saturación del fotodiodo. Girando la rueda de filtros de densidad neutra regula la intensidad de la luz.
		<ol><li>Gire la densidad neutra filtro de forma que aumenta el voltaje de salida del fotodiodo. 
			Nota: La tensión de salida se observa usando el software para el fotodiodo digital. El fotodiodo está saturado si el voltaje no cambia. En ese caso, gire el filtro de densidad neutra hasta que la tensión se reduce sin aplanar hacia fuera en una mínima lectura. Asegúrese de que la señal de voltaje no aplaste a los valores máximos, lo que indica saturación del fotodiodo. Reducir la intensidad de luz girando la rueda de filtros de densidad neutra si se observa saturación.</li>
		</ol></li> <li>Una vez que el patrón de difracción móviles es visibles, recolectar datos con el fotodiodo haciendo clic en el botón de inicio en el software de control del osciloscopio mientras el gusano &#39; movimiento s. Seguir tomando medidas hasta que el gusano se mueve el rayo láser y el diffracción patrón desaparece, que generalmente toma alrededor de 20 s.
		Proceso de <ol><li>parada la recogida de datos haciendo clic en el botón de stop en el software para el osciloscopio. Guardar cada ensayo &#39; datos en formato .csv o .txt.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Repita los pasos 5.2-5.3 hasta por lo menos 50 conjuntos de datos han sido recopilados para cada fenotipo. Ocho a diez animales por juicio.</li>
	<li>Si la cubeta es había rayada tire y el gusano y repita el paso 4. Si el gusano se perjudica en la transferencia, deséchelo y enjuagar la cubeta con agua destilada antes de repetir el paso 4 con la misma cubeta.</li>
	<li>Repita el paso 5 con el OH7547 &#34; rodillos &#34; cepa, teniendo cuidado de etiquetar los datos para indicar que la cepa gusano.</li>
</ol> 6. Espectro de Fourier de datos <ol><li>importar los datos adquiridos en un programa de análisis de datos capaz de realizar Fourier discreto transforma 3.</li>
	<li>Realizar Fourier transforma en cada conjunto de datos mediante la rápida Fourier transform (FFT) opción del software.</li>
	<li>Promedio de las frecuencias de los resultados de la FFT de cada amplitud para el tipo de salvaje N2 gusanos.</li>
	<li>Repetir paso 6.3 usando el FFTs de la OH7547 &#34; rodillos &#34; gusanos.</li>
</ol> 7. Modelización del espectro de Fourier <ol><li>programa un modelo binario del nematodo de la locomoción (ver programa incluido en los materiales suplementales). 
	Nota: Este modelo es una aproximación áspera, que en el primero muestra las características prominentes del movimiento del gusano. El modelo puede ser refinado como los resultados se comparan con los gusanos reales. Formas de gusano son aproximaciones usando microscopio imágenes 13.
	<ol><li>Crear fotogramas secuenciales del modelo binario a través de al menos dos ciclos de gusano ( Figura 2a). Ver los vídeos en los materiales complementarios; C gusano (CWorm.avi) y vídeo de gusano W (WWorm.avi).</li>
	</ol></li> <li>Producir patrones de difracción secuencial. Ver los vídeos en los materiales complementarios. C difracción de gusano (CWormDiff.avi) y gusano W vídeo (WWormDiff.avi).
	<ol><li>De Fourier cada marco binario de la imagen del gusano. Cuanto mayor sea el relleno del marco alrededor del gusano, mejor será la resolución de la imagen de difracción será. 
		Nota: El valor absoluto de cada marco transformada de Fourier es proporcional al correspondiente patrón de difracción ( figura 2b).</li>
		<li>Ajustar el contraste del patrón de difracción mediante la asignación de la intensidad del patrón de difracción a una escala logarítmica. 
		Nota: Las cámaras y los ojos tienden a funcionar en una escala no lineal. Una escala logarítmica puede simular cómo un patrón de difracción por lo general es percibido por el ojo humano.</li>
	</ol></li> <li>Extraer la señal de difracción modelados.
	<ol><li>Elegir un lugar fuera del centro que corresponde a la ubicación del fotodiodo en el patrón de difracción.</li>
		<li>Agregar los elementos de matriz vecinos que rodean la ubicación del fotodiodo para simular el tamaño del fotodiodo. El tamaño del fotodiodo es típicamente 0.1% de la pauta de difracción modelados.</li>
		<li>Registro y trama de la secuencia de la magnitud de la difracción de las señales. Compruebe que la señal es físicamente razonable (es decir, en el caso de periódicos paliza, la señal del fotodiodo debe ser periódica también).</li>
	</ol></li> <li>Fourier transforman la señal de difracción obtenida en 7.3 y comparar resultados con los datos experimentales.</li>
	<li>Repita para varias cepas de gusano y comparar.</li>
</ol>

<ol><li>Magnes, J., et al. <a target="_blank" href="http://file.scirp.org/Html/6-1850026_21423.htm">Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction.</a> Open J. Biophys. 2, 101-107 (2012).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Locomotion+Study+of+Freely+Swimming+Micro-organisms+Using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction.</a> J. Vis. Exp. (68), (2012).</li>
<li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+JF+%22A+Student%27s+Guide+to+Fourier+Transforms+with+Applications+in+Physics+and+Engineering%22">A Student's Guide to Fourier Transforms with Applications in Physics and Engineering</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1995).</li>
<li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li>
<li>Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography%3A+A+revolution+in+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology.</a> Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).</li>
<li>Thibault, P., Rankenburg, I. C. <a target="_blank" href="http://aapt.scitation.org/doi/10.1119/1.2750378">Optical diffraction microscopy in a teaching laboratory.</a> Amer. J. Phys. 75 (9), 827-832 (2007).</li>
<li>Miao, J., Ishikawa, T., Anderson, E. H., Hodgson, K. O. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/233743787_Phase_retrieval_of_diffraction_patterns_from_noncrystalline_samples_using_the_oversampling_method">Phase retrieval of diffraction patterns from non crystalline samples using the oversampling method.</a> Phys. Rev. B. 67, 174104(2003).</li>
<li>Zhang, Y. P., Zhang, J. Q., Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0030402613003215">Method for eliminating zero-order diffraction in lensless Fourier transform digital holography.</a> Optik - International Journal for Light and Electron Optics. 124 (21), 4873-4875 (2013).</li>
<li>Brody, A. H., Chou, E., Gray, J. M., Pokrywka, N. J., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mancozeb-induced+behavioral+deficits+precede+structural+neural+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroToxicology%22%5BJournal%5D)">Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration.</a> NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html">WormBook</a>. , (2006).</li>
<li>Dasalukunte, D., Öwall, V., Rusek, F., Anderson, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDasalukunte%2C+D+%22Faster+than+Nyquist+Signaling.+Algorithms+to+Silicon%22">Faster than Nyquist Signaling. Algorithms to Silicon</a>. , Springer International Publishing. Switzerland. (2014).</li>
<li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6 (8), e198(2008).</li>
<li>Bilbao, A., Wajnryb, E., Vanapalli, S. A., Blawzdziewicz, J. <a target="_blank" href="https://arxiv.org/pdf/1306.4423.pdf">Nematode Locomotion in Confined and Unconfined Fluids.</a> Phys. Fluids. 25, 081902(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con tramos de datos de inactividad se sesgan los resultados desde frecuencias bajas artificiales se promediaron los resultados. Saturar el fotodiodo puede ser reconocido por planos cumbres o picos de "corte" en los datos en bruto. Dividiendo cada conjunto de datos de raw de intensidades de pico ayuda a contabilidad las fluctuaciones en la intensidad del láser.
Las frecuencias de pico son un indicador de la general golpear frecuencia; sin embargo, complicado el movimiento causa interferencia a frecuencias beats en el patrón de difracción y deben ser examinados cuidadosamente.
Este método puede utilizarse para investigar la locomoción de otros nematodos. El medio ambiente se puede cambiar a otro medio. Se pueden cambiar las longitudes de onda. Trabajando en la gama visible del espectro electromagnético es más fácil y más segura.
Un modelo más refinado simulará los espectros de difracción más realista en el futuro. Un futuro modelo puede incluir un gusano que puede cambiar orientaciones, que no afectaría a localizaciones de frecuencia pero alturas máxima relativa. Un modelo más realista permitiría una distribución probabilística de las frecuencias de la paliza, que ampliaría los picos como en los datos experimentales. Las variaciones en las frecuencias de golpear representaría una propagación en frecuencias.
La actual forma de gusano es cruda, especialmente en la región de cabeza y la cola, que debería ser más afilada que en el modelo actual. Puede ser interesante realizar un análisis detallado de la serie de tiempo de la señal ya que podría dar pistas sobre la complejidad de la locomoción en mutantes diferentes.
Merece la pena teniendo en cuenta la practicidad de la expansión de esta técnica en caracterización de nematodos múltiples simultáneamente. Este método debe ser entendido como un método complementario a los métodos existentes usando los microscopios tradicionales. Este método tiene la ventaja de no requerir un microscopio durante la adquisición de datos para que el gusano puede moverse fuera del plano focal. Los espectros de frecuencia promedio muestran claras diferencias en el movimiento del gusano y pueden ser cuantificados por los picos de frecuencia prevalecen, que es un método novedoso en la cuantificación de locomoción de gusano. Análisis de los datos de las firmas de la difracción es en el desarrollo y que dará lugar a un proceso de identificación automatizada de múltiples mutantes y de los individuos.

Este método compara espectros de frecuencia experimental y modelado de la locomoción de C. elegans con dos variedades muy diferentes patrones de locomoción. Los resultados muestran que el espectro de frecuencia depende de cambios temporales como el nematodo de la nada en una columna de agua para que imágenes microscópicas claro no son necesarios para el análisis. Este método permite el análisis cuantitativo en tiempo real y proporciona información complementaria a imágenes y vídeos obtenidos con los microscopios tradicionales. Difracción de Fraunhofer, llamado también difracción del campo lejano, proporciona la base para la obtención de datos de difracción en1,2. La intensidad de la luz en cualquier punto en el patrón de difracción es el resultado de la superposición de luz desde todos los puntos del contorno de los nematodos3. Como resultado, la intensidad de la luz más tiempo lleva información sobre la locomoción de los nematodos. Análisis de la señal dependiente del tiempo de difracción pueden identificar el movimiento característico del mutante correspondiente puesto que analizar todas las frecuencias que intervienen en la locomoción complementa el tradicional análisis de vídeo. En este caso, las diferencias características entre la locomoción del "rodillo" y tipo salvaje C. elegans se confirman mediante la comparación de los espectros de frecuencia de las dos cepas diferentes de nematodos.
Algunas de las características anteriores han sido confirmados mediante el análisis de frecuencia de las señales de difracción como natación de2,de frecuencias4. Más importante aún, este método puede utilizarse como un método complementario a la microscopía tradicional para locomoción en tiempo real en una pantalla de ordenador, observando los datos se están recopilando. El espectro de frecuencia de gusanos con diferentes patrones de locomoción puede cuantificarse teniendo en cuenta que el Fourier transforma la señal de la señal de difracción.
El carácter multidisciplinar de la difracción basada en la transformada de Fourier en este trabajo consiste en los campos de la biología y la física. Difracción por debajo de muestreo ha sido utilizada para investigar las estructuras cristalinas en biología5 y otros campos. En este experimento, sin embargo, oversampling6,7 crea el patrón de difracción del campo lejano para que el organismo se centra en el rayo láser. Sobremuestreo se utiliza normalmente para la proyección de imagen de lente menos8 junto con un algoritmo de recuperación de fase que reconstruye una imagen del objeto original. Fase de recuperación es difícil de lograr cuando los difusores están presentes como es el caso de un nematodo. La firma de difracción temporal es suficiente para evaluar las frecuencias fundamentales del movimiento del gusano. Este método es menos cómputo gravar y proporciona una forma óptica para cuantificar la locomoción. Esta técnica podría ser fácilmente adaptada para el análisis de las mutaciones o las condiciones ambientales que alteran el comportamiento.

<table><tbody><tr><td>Láser de helio-neón sintonizable</td><td>Electroóptica de investigación</td><td>30602</td> Se <td>pueden seleccionar cuatro longitudes de onda entre 543 nm y 633 nm.</td></tr><tr><td>2 Espejos de aluminio de superficie frontal</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>Fotodiodo: Detector amplificado SI</td><td>Thorlabs</td><td>PDA 100A</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de cuarzo</td><td>Celdas Starna</td><td>21/G/5</td><td>También se pueden utilizar celdas de plástico.</td></tr><tr><td>MatLab (Software)</td><td>MathWorks</td><td>R2016b (9.1.0.441655)</td><td>Utilice el comando fft para simular la difracción</td></tr><tr><td></td><td>Excel Microsoft</td><td>14.7.1</td><td>Utilizado para el análisis de datos de la Figura 4</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans Roller</td><td>University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC)</td><td>Cepa: OH7547 Genotipo: otIs199.</td><td>https://cbs.umn.edu/cgc/home</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans Tipo salvaje</td><td>Centro de Caenorhabditis elegans de la Universidad de Minnesota (CGC)</td><td>Cepa:N2 Genotipo: C. elegans silvestre aislado</td><td>https://cbs.umn.edu/cgc/home</td></tr></tbody></table>

basado en la transformada de fourier análisis difracción de vivir caenorhabditis elegans

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

Este manuscrito describe cómo clasificar nematodos usando firmas temporal difracción del campo lejano. Una sola C. elegans se suspende en una columna de agua dentro de una cubeta óptica. Un láser de HeNe onda continua 632 nm se dirige a través de la cubeta utilizando espejos de superficie frontales. Una gran distancia de por lo menos 20-30 cm viajado después la luz pasa a través de la cubeta asegura un patrón de difracción útil de campo lejano (Fraunhofer). Los cambios del patrón de difracción en tiempo real como el nematodo nada dentro del rayo láser. El fotodiodo se coloca fuera del centro en el patrón de difracción. La señal de voltaje desde el fotodiodo se observa en tiempo real y grabado con un osciloscopio digital. Este proceso se repite para 139 tipo de salvaje y 108 "rodillo" de C. elegans. Tipo salvaje gusanos exhiben un patrón de oscilación rápida en solución. Los gusanos "roller" tienen una mutación en un componente clave de la cutícula que interfiere con la locomoción suave. Intervalos de tiempo que no están libres de saturación y la inactividad son descartados. Es práctico dividir cada media por su máximo comparar intensidades relativas. La señal de cada gusano es para que el patrón de frecuencia para cada gusano emerge de la transformada de Fourier. Es un promedio de la señal para cada tipo de gusano. Los espectros de Fourier promedio para el tipo salvaje y el "rodillo" C. elegans son claramente diferentes y revelan que las formas de gusano dinámico de las dos cepas diferentes del gusano se pueden distinguir mediante el análisis de Fourier. Los espectros de Fourier de cada cepa de gusano coincide con un modelo aproximado usando dos formas de gusano binarios diferentes que corresponden a momentos de locomoción. La envolvente de la distribución de frecuencia media para gusanos reales y modelados confirma el modelo coincide con los datos. Este método puede servir como base para el análisis de Fourier para muchas especies microscópicas, como cada microorganismo tiene su espectro de Fourier único.

La óptica configuración experimental que se muestra en la figura 1 permite el estudio de los microorganismos sin estar atado a un plano focal. La señal de golpear desde el fotodiodo puede observarse en tiempo real en la pantalla del ordenador como se recogen los datos. Patrones inusuales serán visibles inmediatamente sin tener que analizar un video en detalle.
Ejemplos de movimiento de gusano secuenciales modelados y correspondiente difracción patrones se muestran en la figura 2. Los patrones de difracción modelado cualitativo se asemejan a patrones experimentales1 y son una indicación inicial que las simulaciones del modelo con éxito el nematodo.
Una firma de temporal difracción de muestra de los dos tipos de C. elegans estudiadas aquí se muestra en la figura 3. Se observa cualitativamente que cada nematodo golpea a diferentes tasas y amplitudes. Algunas de las diferencias pueden cuantificarse a través de la curva de ajuste como se hizo en una anterior publicación1. El Fourier discreto transforma, sin embargo, revela más detalles acerca de frecuencias integradas:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56154/56154eq1.jpg">, (1)
donde Fk es la digital de Fourier (FT) y fn es la señal de difracción crudo dependiente del tiempo con el tiempo discreto variable n y la variable de frecuencia discreta k. N es el número total de puntos de datos. El medio digital de Fourier permite el nematodo a identificarse por la amplitud de su espectro de frecuencia de difracción (figura 4). El espectro de tipo salvaje está dominado por frecuencias más bajas que el espectro de movimiento del rodillo.
Un modelo que se aproxima el tipo salvaje versus las notas de C. elegans de rodillo el tipo salvaje tiende a thrash en un movimiento ondulado de (forma de W o S) (Figura 2a) mientras que el rodillo tiende a favorecer un lado más o menos parecido a una forma de C oscilante ( Figura 5). Esto ofrece una explicación de los espectros diferentes. El rodillo sobre todo forman un C a un lado mientras que la oscilación W puede ser considerada como dos opuestos C movimientos. Por esta razón, el movimiento de W es más complejo revelando graves secundarios más que el movimiento de C. Este resultado se confirma en el modelo computacional. La forma de W tiene una densidad de frecuencia mucho más alta que la forma de C (figura 6). Esto es confirmado en la FFT en la figura 4 donde las frecuencias de rodillo se aglutinan más mientras que no completamente discreto. Las estadísticas del rodillo son sesgadas ya que el rodillo puede volver temporalmente a la locomoción de tipo salvaje.
Los espectros de potencia suavizada de roller tipo C. elegans muestra un amplio pico en ~1.5 Hz, mientras que el tipo salvaje de natación C. elegans exhibe un espectro multimodal (incluyendo picos ~1.0 Hz y 1,75 Hz). El fotodiodo (EP) tiene un tamaño finito propagación sobre varios elementos de la matriz. Elementos individuales de la matriz o puntos en el patrón de difracción varían en intensidad ya que varía de interferencia constructiva y destructiva; sin embargo, las frecuencias en que varían las intensidades son las mismas para todos los elementos de matriz, como puede verse en la figura 7. Considerando el derivado del tiempo ecuación 1, se observa que las fluctuaciones de frecuencia depende de la matriz de fase sino solamente en las fluctuaciones del objeto original:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56154/56154eq2.jpg">, (2).
Como el PD se extiende sobre varios elementos de la matriz, las ubicaciones de pico promedio a un perfil de frecuencia constante. Alguna variación puede esperar y puede dar pistas sobre la orientación del gusano. La distribución de frecuencia cambiará como la marcha de los cambios de gusano. El modelo actual es un modelo simple que sólo permite la evaluación de localizaciones de pico en lugar de alturas del pico relativo. Diferentes patrones de locomoción se promediarán a ubicaciones diferentes de pico.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig1.jpg"> 
Figura 1. Disposición experimental. Los recorridos de haz láser de baja potencia a través del filtro de densidad neutra, se refleja en el espejo M1 hacia abajo a través de la cubeta que contiene el gusano sobre el espejo M2 y viaja hacia el fotodiodo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig2.jpg"> 
Figura 2. Formas de gusano secuencial y patrones de difracción correspondientes. (a) algunos seleccione secuenciales imágenes binarias de nematodos de forma W modelados y los patrones de difracción secuencial correspondientes (b). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig3.jpg"> 
Figura 3. Muestra experimental difracción firmas. Difracción de firmas recogidas para (una) OH7547 "roller" y (b) N2 tipo salvaje C. elegans mediante un solo fotodiodo en el patrón de difracción. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig4.jpg"> 
Figura 4. Experimental promedio de espectros de potencia de rodillos y tipo salvaje serie de difracción de Fraunhofer. Los espectros las frecuencias presentan en media transformada de Fourier de la serie grabada con el fotodiodo. Un filtro gaussiano de desviación estándar Hz 0,075, truncado en 3 desviaciones estándar, se utiliza para alisar. Tenga en cuenta el amplio pico espectral en ~1.5 Hz en el espectro de rodillo alisado, en comparación con el espectro de tipo alisado multimodal (incluyendo a ~1.0 y 1.75 Hz). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig5.jpg"> 
Figura 5. Ilustración de difracción formación. Patrones de difracción se pueden modelar por el pensamiento de cada segmento de línea como una línea recta infinitamente pequeño (izquierda). Superposición de estas líneas (derecha) muestra la construcción de patrones de difracción del lejos-campo generado por una C en forma de nematodo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig6.jpg"> 
Figura 6. Simulación de espectros de potencia de rodillos y tipo salvaje serie de difracción de Fraunhofer. (a) C gusanos forma y (b) de forma de W con el fotodiodo centran en los elementos de matriz 200 (vertical) y 175 (horizontal). La forma de W muestra una mayor densidad de frecuencias debido a la locomoción más compleja. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig7.jpg"> 
Figura 7. Simulación de espectros de potencia de rodillos y tipo salvaje serie de difracción Fraunhofer en lugares diferentes del fotodiodo. (a) W forma gusano y el gusano de forma (b) C para elementos individuales de la matriz en varias localizaciones, simulando varias localizaciones del fotodiodo. Alturas de pico varían para diversos lugares; sin embargo, ubicaciones de pico siguen siendo los mismos de formas específicas. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este manuscrito describe cómo distinguir diferentes nematodos utilizando firmas de difracción del campo lejano. Comparamos la locomoción de 139 tipo salvaje y 108 "Roller" C. elegans promediando las frecuencias asociadas con la firma de difracción de Fraunhofer temporal en un solo lugar usando un láser de onda continua.

Basado en la transformada de Fourier Análisis difracción de vivir Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column ...

El objetivo general de este análisis de difracción basado en Fourier es caracterizar la locomoción de C elegans en tiempo real mientras la especie se mueve libremente en un espacio tridimensional. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la neurobiología al describir las respuestas de la especie a diferentes densidades de solución o a mutantes locomotores. Este método sirve como línea base para el análisis de Fourier de especies microscópicas.Tiene la ventaja de que cada especie microscópica tendrá su propio espectro de Fourier. Aunque este método puede proporcionar información sobre la locomoción de C elegans, también puede aplicarse a otros microorganismos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque encontrar el nematodo en la cubeta, bajo el haz láser, puede ser un reto.La idea de este método surgió al intentar obtener información sobre el comportamiento de nado a partir de la señal de difracción temporal, una señal en sí misma ruidosa. Para comenzar, fije un láser de helio-neón cerca de la esquina trasera izquierda de la mesa óptica y conéctelo a una fuente de alimentación. Coloque un filtro de densidad neutra entre el láser y la ubicación de la muestra, de modo que el haz del láser atraviese el filtro antes de llegar a la muestra.Utilizando dos espejos frontales de aluminio para dirección, construya un periscopio fijando el primer espejo tras el filtro de densidad neutra. Luego, fije el segundo espejo aproximadamente 10 centímetros por debajo del primer espejo para dejar espacio y poder dirigir el haz láser. Inserte una cubeta entre los espejos y alinee el haz láser y la cubeta de manera que el haz láser atraviese verticalmente la cubeta.A continuación, coloque el fotodiodo directamente frente al segundo espejo de manera que su sensor esté orientado hacia el espejo. Luego, coloque una cubeta llena de agua sobre un soporte. Ajuste la altura del soporte y los ángulos de los espejos uno y dos para que el haz láser atraviese la cubeta y se dirija cerca del fotodiodo, pero sin incidir directamente sobre él.Utilice una palanca para asegurar que el soporte forme una superficie nivelada para la cubeta. Si el soporte no está nivelado, realice los ajustes apropiados hasta nivelarlo. Finalmente, conecte el fotodiodo al osciloscopio digital utilizando el cable USB proporcionado y conéctelo a la computadora.Cargue el software del osciloscopio y configure la frecuencia de muestreo a al menos ocho hercios para resolver suficientemente el ciclo de movimiento errático del gusano. Utilice una aguja delgada de platino aplanada para transferir cuatro nematodos adultos a una placa de Petri fresca con agar NGM. A continuación, retire una cubeta de plástico desechable de su envase, teniendo cuidado de tocar la cubeta solo por sus lados acanalados.Luego, utilice una micropipeta para transferir agua destilada a una cubeta hasta que la cubeta esté aproximadamente llena en un 80 % con agua destilada. Coloque la placa de Petri que contiene los C elegans bajo un microscopio estereoscópico. A continuación, use la espátula de platino para retirar un C elegans maduro de la placa de Petri y sumerja la espátula en la cubeta.Mueva la aguja en círculos para desprender el nematodo si es necesario. Manipule los nematodos con cuidado y no agite la cubeta. Agitar la cubeta puede hacer que los gusanos no respondan.Para evitar que se formen burbujas en la cubeta, llene la cubeta con agua destilada hasta que sobresalga ligeramente por la parte superior de la cubeta. Luego, llene la tapa con agua y coloque rápidamente la tapa sobre la cubeta. Utilizando papel para lentes, retire cualquier gota de agua que pueda haberse derramado sobre la cubeta.Además, utilice papel para lentes para eliminar cualquier pequeña gota residual. Encienda el láser de helio-neón y ajuste la configuración de frecuencia para que produzca un haz rojo. Luego, encienda el sensor.Sujete la cubeta por sus lados acanalados e inclínela suavemente hasta que el nematodo esté aproximadamente en el centro de la cubeta. Luego, coloque la cubeta sobre el soporte del sistema óptico, centrando el gusano dentro del haz láser que viaja desde el espejo uno hasta el espejo dos. A continuación, coloque el fotodiodo en el patrón de difracción de manera que la posición del fotodiodo y el máximo central del patrón de difracción no coincidan.Luego, gire los filtros de densidad neutra de modo que haya una salida de voltaje notable desde el fotodiodo. Asegúrese de limitar la luz utilizando el filtro de densidad neutra, para evitar la saturación del fotodiodo. Una línea plana indica sobresaturación o falta de intensidad.Una vez que el patrón de difracción en movimiento sea visible, recopile los datos con el fotodiodo haciendo clic en el botón de inicio del software, controlando el osciloscopio mientras monitorea el movimiento del gusano. Continúe tomando mediciones hasta que el gusano salga del haz láser y el patrón de difracción desaparezca. Si la cubeta está rayada, deseche la cubeta y el gusano y comience de nuevo.Después de aproximadamente 20 segundos, detenga el proceso de recolección de datos haciendo clic en el botón de detención del software del osciloscopio. Guarde los datos de cada ensayo en formato de valores separados por comas o en formato de texto. Recolecte al menos 50 conjuntos de datos para cada fenotipo y utilice de ocho a diez animales por ensayo.Se muestran aquí ejemplos de movimientos secuenciales modelados de gusanos y sus patrones de difracción correspondientes. Los patrones de difracción modelados se asemejan cualitativamente a los patrones experimentales e indican que la simulación modeló con éxito el nematodo. Además, se puede mostrar cuantitativamente la firma temporal de difracción del mutante roller y del tipo salvaje de C. elegans.Como se observa aquí, cada nematodo se agita a diferentes tasas y amplitudes. Las transformadas digitales promedio de Fourier permiten identificar al nematodo mediante la amplitud de su espectro de frecuencia de difracción. El espectro del gusano de tipo silvestre está dominado por frecuencias más bajas que el espectro del movimiento de rodillo.Aquí hay un ejemplo de la oscilación w, que puede considerarse como dos movimientos marinos opuestos. En contraste, el rodillo formará principalmente una c hacia un lado y aparece así. Al examinar las frecuencias, el movimiento w es más complejo, revelando más frecuencias bajas secundarias que el movimiento c.Una vez dominada, se puede obtener un conjunto de datos en aproximadamente dos minutos si la técnica se realiza correctamente. Se necesitan unos 20 a 30 minutos para configurar la óptica para una serie de conjuntos de datos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular los C elegans con cuidado, a fin de preservar la integridad de su locomoción.Tras seguir este procedimiento, podemos aplicar otros métodos, como la reconstrucción del tractor y el análisis no lineal, para obtener más información sobre el movimiento de C elegans. Desde su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en neurobiología estudien con mayor profundidad mutantes locomotores en C elegans. Después de ver este video, deberías tener una comprensión bastante clara de cómo generar patrones de difracción para nematodos vivos y cómo analizarlos.No olvide que trabajar con láseres puede ser extremadamente peligroso y que se deben tomar precauciones, como evitar que los haces láser viajen a la altura de los ojos, durante la realización del procedimiento.

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