Name: Establecimiento de un imitador valiosa de la enfermedad de Alzheimer en modelo Animal de rata por la inyección Intracerebroventricular de proteína Beta amiloide compuesta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprende a establecer un modelo de enfermedad de Alzheimer en ratas mediante inyección intracerebroventricular de Aβ25-35, cloruro de aluminio y factor de crecimiento transformante beta. Este método permite evaluar alteraciones de memoria espacial y cambios neuronales patológicos de forma reproducible.

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El proyecto fue apoyado por la Fundación de Ciencias naturales Provincial de Hebei (no. C2009001007, H2014406048), la Administración Provincial de Hebei de la medicina tradicional China (Nº 05027) y el proyecto de construcción del tema clave de la Universidad Provincial de Hebei, China.

Este procedimiento fue conforme a las regulaciones de administración de Animal Experimental emitida por el Comité Estatal de ciencia y tecnología de China el 31 de octubre de 198811. Los científicos deben seguir las directrices establecidas y aprobadas por los organismos reguladores del animal institucionales y nacionales.
Nota: Animal y regentes: ratas de Sprague-Dawley macho de cuatro meses (300-350 g) fueron suministradas para este experimento. Todas las ratas fueron alojadas en grupos (cuatro o cinco por jaula) a una temperatura de 23 ± 1 ° C con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. Agua y los alimentos estaban disponibles ad libitum. Las ratas fueron aclimatadas a las condiciones de la vivienda por 7 días antes de que el procedimiento fue realizado. Aβ25-35 fue disuelto en solución salina al DMSO 1% a 1 mg/mL y ultrasonicada durante 5 minutos en un oscilador ultrasónico hasta que se disuelva completamente. AlCl3 y RHTGF-β1 se disolvieron en solución salina al 1% y 0.1 mg/mL, respectivamente. Rojo Congo, nitrato de plata y otros productos químicos fueron de grado analítico y fueron adquiridas de fuentes comerciales ordinarias.
1. quirúrgico
Nota: 20 ratas Sprague-Dawley macho fueron microinyectadas con Aβ composited en el ventrículo lateral y núcleo talámico anterodorsal y señaladas como el grupo tratado con Aβ composited. Otro 20 ratas fueron sometidos a la misma operación pero recibieron solución salina microinyección de 0.1% DMSO y señalan como el grupo sham operado.
<ol><li>Anestesiar las ratas con isoflurano 100% por inhalación y luego frenar en un aparato estereotáctica cerebral.</li>
	<li>Afeitarse la piel en el vértice de la cabeza con tijeras quirúrgicas y desinfectar con yodoforo. Luego, cubre toallas desechables quirúrgicos en la cabeza.</li>
	<li>Hacer una incisión en la piel de la cabeza a lo largo de la calvaria longitudinal mediana con bisturís quirúrgicos y tijeras.</li>
	<li>Separar el tejido subcutáneo y fascia, limpie la bóveda craneal con un algodón seco estéril para detener el sangrado y marca el vértice con un rotulador.</li>
	<li>Se refieren a la rata cerebral estereotáctica mapa12; teniendo en cuenta el vértice como punto de origen, marque los tres puntos, el núcleo talámico anterodorsal (ad) (posterior (P): 2,0 mm para el bregma, lateral (L): 1,4 mm a la línea media) para la inyección de RHTGF-β1 y la fijación de un tornillo, el ventrículo lateral (LV) área ( posterior (P): 0.8m m a bregma; lateral (L): 2,0 mm a la línea media) para la inyección de Aβ25-35 y AlCl3 y el segundo tornillo de fijación de lugar (frontal (F): 2,0 mm para el bregma, lateral (L): 1,5 mm a la línea media).</li>
	<li>Suavemente Taladre tres orificios de 1 mm de diámetro con un taladro del hueso flexible, señalado en los anteriores tres puntos del cráneo (1.5. paso). No atornille más profundo que es necesario para evitar apuñalar el tejido cerebral.</li>
	<li>Detener el sangrado y limpiar la superficie del cráneo repetidamente con algodón seco estéril.</li>
	<li>Inserte una aguja vinculada a la bomba de inyección de micro, para el cerebro a 4.6 mm de profundidad y suavemente inyectar 1 μL RHTGF β1 (10 ng) en el área de anuncio. Estancia la aguja 2 min después de la inyección y lentamente tire de la aguja (1 archivo suplementario).</li>
	<li>Fije los dos tornillos en el cráneo, señalado en los puntos de anuncio y el segundo tornillo de fijación de lugar de calavera (que fueron señalados en 1.5. paso) con un destornillador pequeño. No atornille más profundo que es necesario para evitar apuñalar el tejido cerebral.</li>
	<li>Montar el sistema de implantación de cánula (2 archivo suplementario), inserte la cánula simulada en la cánula guía después de la desinfección por alta presión.</li>
	<li>Inserte la cánula de acero inoxidable tubo guía al cerebro a 4,6 mm área de LV a través del agujero del cráneo (archivo suplementario 3), con la ayuda del titular de la cánula del aparato estereotáxicas de ratas.</li>
	<li>Mezcle el material base de la dentadura con agua base de la dentadura en proporción de 1,5 g por 1 mL, poner la pasta para cubrir el pedestal plástico de la cánula guía y dos tornillos para inmovilizar la cánula guía y hasta la cubierta de la incisión de la piel entera para evitar la infección de la piel.</li>
	<li>En el día 2 de la operación, anestesiar las ratas con inhalación isoflurano con la máquina de anestesia de pequeños animales. Extraer la cánula dummy, inserte la cánula interna en la cánula guía y atornille el tornillo de fijación para inmovilizar la cánula interna.</li>
	<li>Fijar la tubería de polietileno que une la bomba de microinyección a la cánula interna y regular la velocidad de la inyección de 1 μL/min Microinject la Aβ25-35 o AlCl3 a VI.</li>
	<li>Microinject 4 μg (1 μL) Aβ25-35 diariamente durante 14 días en la mañana y 3 μL AlCl3 (1%) diario durante 5 días por la tarde bajo anestesia isoflurano.</li>
	<li>Espere 5 minutos después de finalizar la inyección, suavemente sacar la cánula interna y vuelva a insertar la cánula simulada en la cánula de la guía.</li>
	<li>El día 15 después de la cirugía (que corresponde al último día de la inyección de Aβ25-35) desmantelar el sistema de implantación de la cánula. Suavemente retirar el sólido material base de la dentadura con tijeras quirúrgicas y pinzas, destornille los dos tornillos, sacar la cánula guía y desinfectar la herida con betadine. Rellene el agujero del cráneo con cemento óseo y sutura la piel con un método de sutura interrumpida simple.</li>
	<li>Realizar la misma operación con el grupo sham operado y microinject 0.1% solución salina de DMSO.</li>
	<li>
Enfermería posoperatoria
	<ol>
<li>2 ratas por jaula de la casa después de la operación y proporcionar comida para 30 días. Nota: 18 ratas en el grupo sham operado sobrevivió (90% tasa de éxito de operación) y 19 ratas en el composited Aβ grupo tratado sobrevivió (tasa de éxito de 95% de la operación).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. detección de ratas modelo de éxito y evaluación de la memoria espacial con laberinto acuático de Morris
<ol><li>
Laberinto acuático de Morris Nota: El laberinto acuático de Morris se utilizó para evaluar la memoria espacial de rat13. El laberinto acuático de Morris es un tanque circular de acero inoxidable con diámetro de 120 cm y 50 cm de profundidad. Se realizó la prueba del laberinto de agua, basado en el paradigma de "estándares de oro", en Behavioral Neuroscience, según J. Nunez14.<ol>
<li>Ennegrecer el agua de la piscina con unas gotas de colorante de alimento.</li>
		<li>Mantener la profundidad del agua en 31,5 cm y la temperatura de 23 ± 1 ° C.</li>
		<li>Establecer una plataforma de plexiglás transparente circular de 1,5 cm por debajo de la superficie del agua.</li>
		<li>Mantienen que todas las señales espaciales por el laberinto de agua son invariables durante las pruebas del laberinto de agua.</li>
		<li>Dividir la piscina en 4 cuadrantes iguales por líneas imaginarias para la recogida de datos descriptivos.</li>
		<li>Colocar la plataforma en el primer cuadrante (Q1) del laberinto de agua.</li>
		<li>Captura de la rata nadando comportamientos (medidos por la latencia, la trayectoria o el número de cruce) a través de una cámara de video, sobre el laberinto de agua vinculado a un software analítico de gráficos computarizados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Proyección para las ratas modelo de éxito para el grupo tratado con Aβ composited
	<ol>
<li>En el día 45 de la cirugía, realizar el laberinto acuático de Morris formación durante 4 días consecutivos para las ratas del exitoso modelo con deterioro de la memoria y recoge la relación de proyección (SR). Nota: El SR se define como la latencia promedio de cada rata tratada con Aβ mezclado y el grupo sham-operado de ratas para encontrar la plataforma oculta bajo el agua superficial en el día 4 de agua formación de laberinto. "A" es la latencia media de cada rata tratada con Aβ composited para encontrar la plataforma y "B" es la latencia promedio del grupo operado simulada de las ratas para encontrar la plataforma, el día 4 del laberinto de agua de formación, en la siguiente ecuación: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56157/56157eq1.jpg"> Cuando SR era más grande que 0.2 para una rata composited tratados de Aß, la rata fue mirada como una rata de éxito del modelo con memoria deteriorada de rata tratada con Aβ composited15. Se calculó el rendimiento de memoria intradía a los datos de 2 ensayos por el valor medio de las ratas para encontrar la plataforma. El proceso de la prueba de laberinto de agua de Morris fue diseñado de modo que las ratas podían nadar en el tanque de laberinto y buscar la plataforma dentro de 60 s. Si una rata no se encontró la plataforma oculta dentro de 60 s, entonces la rata se puso en la plataforma con la mano del experimentador. Cuando llegó a una rata en la plataforma (independientemente o asistida), la rata se dejó permanecer allí durante 20 s. Luego, la rata fue quitada del tanque y permite una recuperación física 10 s entre los 2 ensayos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. examen neurona
<ol><li>En 86 post cirugía, bajo anestesia isoflurano, eutanasia a las ratas por decapitación (figura 1).</li>
	<li>Pon el cerebro en hielo y suavemente separar los dos hemisferios en el rafe. Tome el hemisferio izquierdo del quiasma óptico y fijar en formaldehído al 4% para la observación de la luz Microcopia de hematoxilina de neurona y eosina (HE), rojo Congo o nitrato de plata mancha (ver las secciones 4-6). Fijar la zona de hipocampo CA1 del hemisferio derecho en glutaraldehído 2.5% para la observación de Microcopia electrónica (sección 7).</li>
	<li>Proceso del cerebro para la preparación de la muestra de luz/electrón Microcopia, como se describió anteriormente16,17.</li>
</ol>4. neurona manchas
<ol><li>Desparafinizar cada diapositiva (20 min) con gradiente alcohol (alcohol 100%, 95%, 90%, 80% y 70%) a agua destilada en una campana de humos.</li>
	<li>Mancha durante 3 minutos con hematoxilina (0.5% w/v) y luego enjuague con agua del grifo para quitar el tinte independiente de toboganes.</li>
	<li>Enjuague con 0,1% de ácido clorhídrico en alcohol durante 1 s para quitar el color de los núcleos sin manchas.</li>
	<li>Sumergir en solución de amoníaco 0,5% por 2 min hasta el fondo azul se convierte.</li>
	<li>Mancha durante 1 min con eosina 1%.</li>
	<li>Deshidratar durante 5 minutos con gradiente alcohol (alcohol 70%, 80%, 90%, 95% y 100%).</li>
	<li>Claro en el xileno y montar con medio de montaje resinosas.</li>
	<li>Observar y contar las neuronas vivas de la tinción de por 0,125 mm en el medio CA1 del hipocampo y 0,0352 mm2 en la corteza cerebral en un aumento de 400 x con un microscopio óptico por una persona cegada al diseño experimental.</li>
</ol>5. rojo Congo para ensayo de carga de Aß de neurona
<ol><li>Desparafinizar cada diapositiva (20 min) con gradiente alcohol (alcohol 100%, 95%, 90%, 80% y 70%) a agua destilada en una campana de humos.</li>
	<li>De la mancha por 20 min con rojo Congo (rojo de Congo 0.5 g, 80 mL de alcohol de metilo, trinitricum de 20 mL) de solución.</li>
	<li>Enjuague en agua destilada durante 5 minutos.</li>
	<li>Diferenciar rápidamente con solución de alcohol al 80% alcalina (0,2 g alcohol 100 mL hidróxido de potasio) para 3 s.</li>
	<li>Enjuague dos veces, cada uno por 5 min con agua destilada.</li>
	<li>Contratinción en hematoxilina de Gill durante 3 minutos.</li>
	<li>Enjuague en agua corriente durante 2 minutos.</li>
	<li>Inmersión en agua de amoníaco (añadir unas gotas de hidróxido de amonio al agua y mezcle bien) durante 30 s o hasta que las secciones se vuelven azules.</li>
	<li>Enjuague en agua corriente durante 5 minutos.</li>
	<li>Deshidratar con alcohol degradado (alcohol 70%, 80%, 90%, 95% y 100%).</li>
	<li>Claro en el xileno y montar con medio de montaje resinosas.</li>
	<li>Observar y contar las células teñidas con rojo Congo en un aumento de 400 x, con un microscopio óptico por una persona cegada al diseño experimental.</li>
</ol>6. nitrato de plata coloración para el análisis de la formación de NFT de neurona
<ol><li>Desparafinizar cada diapositiva (20 min) con gradiente alcohol (alcohol 100%, 95%, 90%, 80% y 70%) a agua destilada en una campana de humos.</li>
	<li>Sumergir en solución de nitrato de plata al 20% y el agente tapado por 20 min en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar en agua destilada dos veces, 5 minutos cada vez.</li>
	<li>Sumergir en solución amoniacal de plata. Gota solución de amoníaco en solución de nitrato de plata al 20% y añadir hasta que la solución va de turbidez a la aclaración. Al mismo tiempo, agitar la solución con una varilla de vidrio durante 15 min y luego en el hidróxido de amonio diluido de 1% por 2 min.</li>
	<li>Colocar el portaobjetos en la solución de trabajo en desarrollo de 3-7 minutos hasta que el bloque negro en el axón puede ser observado.</li>
	<li>Sumerja en la solución de amoníaco 0,1% diluido durante 1 minuto y luego enjuague con agua durante 1 minuto.</li>
	<li>Disponer con tiosulfato de sodio 5% por 2 min y luego enjuagar con agua durante 5 minutos.</li>
	<li>Deshidratar con alcohol degradado (alcohol 70%, 80%, 90%, 95% y 100%).</li>
	<li>Claro en el xileno y montar con medio de montaje resinosas.</li>
	<li>Observar y registrar la celda para la mancha de nitrato de plata en un aumento de 400 x con un microscopio óptico por una persona cegada al diseño experimental.</li>
</ol>7. hippocampal Neuron ultraestructura medición
<ol><li>Corte del hipocampo de rata CA1 en varios cubos de hielo (1 x 1 x 1 m3) y colocar en glutaraldehído al 2.5% durante 2 h a 4 ° C.</li>
	<li>Enjuague los cubos con PBS tres veces (pH 7.2, 10 minutos cada vez).</li>
	<li>Arreglar los cubos en 1% ácido ósmico durante 2 h a 4 ° C.</li>
	<li>Enjuague los cubos en agua bidestilada 3 x (10 min cada vez).</li>
	<li>Deshidratar con alcohol degradado 50%, 70% y 90% (10 min cada uno), 100% dos veces (15 min cada vez).</li>
	<li>Reemplazar por el óxido de propileno propileno óxido: resina de dos veces (15 min cada vez), 1:1 (60 min cada vez a temperatura ambiente) y óxido de propileno: resina 1:4 (60 min. cada vez a temperatura ambiente). Remoje en resina (120 min, a temperatura ambiente).</li>
	<li>Incrustar en EPON 812 y polimerizar (5 h/35 ° C, 5 h/60 ° C, 5 h/80 ° C).</li>
	<li>Corte las secciones Semifinos (1 μm), tinción por azul de metileno y localizar al microscopio.</li>
	<li>Mancha las secciones ultra delgadas (50 nm) con plomo y de acetato de uranilo o citrato.</li>
	<li>Examinar bajo un microscopio JEM-1400 y recolectar imágenes.</li>
</ol>

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<li>Puzzo, D., Gulisano, W., Palmeri, A., Arancio, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+Alzheimer%27s+disease+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 10, 703-711 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Es bien conocido que la pérdida de memoria y el aprendizaje son importantes síntomas clínicos en pacientes de AD2. El procedimiento descrito aquí es un método en vivo para el estudio de AD; hemos adaptado un protocolo publicado anteriormente que probaron un medicamento para aliviar el déficits de memoria y lesiones neuronales en un modelo de rata4. Nuestro protocolo proporciona información importante para obtener datos valiosos, así como una tasa de supervivencia alta de animales que modelo con éxito operación, déficits de memoria, lesiones de la neurona, carga de Aß y deposición de NFT, para imitar el anuncio (en el presente experimento, la tasa de supervivencia y tasa de éxito del modelo de operación son más del 90%). Estas ratas de éxito del modelo se utilizaron para medir su memoria espacial con el test de laberinto de agua de Morris. El ensayo de navegación posicionamiento halló que la Aβ composited puede causar deterioro de adquisición de la memoria de rata; el ensayo de sondeo halló que la Aβ composited puede disminuir la retención de la memoria de rata; y la revocación de la prueba que la Aβ composited puede resultar en reaprender la debilitación de la rata. Estos datos de prueba del laberinto de agua Morris muestran que la Aβ composited puede inducir memoria espacial de la rata. En general, inyectando las ratas intracerebroventricularly con Aβ25-35 en combinación con AlCl3 y TGF-β1 creó un viable y creíble en vivo AD-como modelo para el laboratorio.
Estudios previos han demostrado que el volumen del cerebro en pacientes con EA es 10% menor que la de individuos sanos. Diferentes atrofias pueden encontrarse en el hemisferio cerebral por observación visual. El grado de atrofia cortical está relacionado positivamente con el deterioro de memoria19. En la histología, la gran cantidad de pérdida de neuronas y grave patología morfológica alterar directamente la función de memoria en pacientes de AD20. En el presente estudio, observación microscópica de luz/electrón encontró que las ratas microinyectadas con Aβ composited muestran dramáticos cambios neuropatológicos, incluyendo pérdida de la neurona y la interrupción de la estructura neuronal y subcelular. Este resultado corrobora el trastorno de memoria espacial de la rata inducido por Aß composited y es similar al estado de pacientes con EA.
Es bien sabido que la carga Aβ cerebral y agregación de NFT se consideran las características más importantes de histopathogenic en AD. Puede destruir la estructura neuronal, alterar la señalización neuronal, interrumpir la función neuronal y causar demencia avanzada17. El presente modelo animal encontrado carga de Aß y agregación de NFT en cerebro, que de acuerdo con el estado del paciente de AD. Por lo tanto, las lesiones de la neurona presente en ratas inducidas por Aβ composited pueden utilizarse como un modelo para estudiar la patología neuronal y estrategia de tratamiento de la EA.
Los siguientes son ejemplos de la investigación efectos de la droga en modelos de rata de AD: Zhao et al., informado que ambos flavonoides de escutelaria tallos y hojas (SSF) y Scutellaria barbata (SBF) puede atenuar el deterioro de la memoria de rata y apoptosis inducida por composited Aβ8,9. Guo et al., también informó de que SBF puede inhibir la agregación de NFT y tau proteína excesiva fosforilación en el lado Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 y Thr231 y disminuir la expresión de proteína y de mRNA GSK-3β, CDK5 y PKA en ratas tratados con Aβ composited21 . Al mismo tiempo, Shang et al., también han informado de que SBF puede suprimir la proliferación astrositos y microglia y menor Aβ1-40, Aβ1-42, y β-sitio APP unirse enzima 1 (BACE1) expresión del mRNA en el cerebro de Aβ composited ratas22. Basado en los resultados anteriores, nuestro modelo animal es ventajosa sobre otros modelo de AD-como, que implican más la función neuronal y desorden de la estructura.
Con respecto a otro modelo de AD-como inyección intracerebroventricular solo de Aß a las ratas puede causar déficits de memoria ratas, pérdida neuronal y proliferación de neurogliocyte, pero puede o no tener depósito de Aß y NFT23. Ratas expuestas a dosis altas Al parecen tener un alto índice de éxito, mimic AD y un modelo animal rentable, con deterioro de la memoria, pérdida neuronal, proliferación de neurogliocyte y placa senil (SP) y agregación de NFT en el cerebro. Sin embargo, la dosis alta de Al puede causar lesiones de hígado de rata y anorexia, acompañado de disminución de peso24. La de rata es otro modelo de AD-como. Las ratas envejecidas muestran déficits de memoria, cambios patológicos de la estructura neuronal/subestructura, deposición de lipofuscina, pero sin carga de Aß y agregación de NFT. Las ratas de más de 24 meses de edad son consideradas de edad para este modelo y por lo tanto requiere un período más largo de alimentación y así el costo es mayor de17,25. Ratones transgénicos SAMP8 y aplicación son el imitador más cercano a AD y más modelos ideales para la investigación de AD. Pero ambos modelos animales tienen un precio más alto y se limitan a utilizar en el laboratorio26,27. En comparación con los modelos animales anteriores, nuestro modelo de composited modelo animal tratada con Aβ tiene un menor costo y alto rendimiento, lo que es una herramienta ideal para el estudio de AD.
En conclusión, la inyección intracerebroventricular de Aβ25-35 combinado con AlCl3 y TGF-β1 a ratas ofrece un modelo animal valioso en vivo para entender mejor el deterioro de la memoria espacial, lesiones neuronales, carga de Aß y deposición de NFT AD subyacente. Este modelo proporciona un rápido y relativamente simple protocolo experimental con un animal de alta sobrevive tarifa y tasa de éxito alta modelo de operación, así como una alta tasa de duplicación, que demostró para ser más económico. El presente modelo animal es un modelo eficaz para imitar el anuncio y puede validar aún más por ser utilizado para imitar varias otras enfermedades.

Es bien sabido que el anuncio es una enfermedad neurodegenerativa crónica y progresiva, con pérdida de memoria gradual como el síndrome clínico principal. En la patología general, hay atrofia del tejido nervioso, neuronas y sinapsis pérdida, así como neuronales trastornos función y estructura subcelulares, que todos participan en el desarrollo y la manifestación clínica de AD1,2. Se informa que cuando los animales fueron intracerebroventricularly inyectado con Aβ, algunos neurotóxicos se producen eventos en el cerebro que implican pérdida de neuronas, alteración de la homeostasis del calcio, apoptosis de la neurona y de sobreproducción de especies reactivas de oxígeno3. Sin embargo, múltiples factores intervienen en la patogenia de la EA y por lo tanto es indispensable establecer un mejor modelo de anuncio.
Aquí se describe un protocolo detallado para el establecimiento de un en vivo imitador AD modelo a través de la inyección intracerebroventricular de Aβ25-35 y AlCl3, combinado con la inyección de núcleo talámico anterodorsal de RHTGF-β1 a las ratas. Esta rata modelhighly imita la función neuronal humana y histopathogenesis de la EA, incluyendo deterioro de la memoria, pérdida de neuronas y daños a la estructura, apoptosis, carga intracelular de Aß y NFT agregación4,5,6 , 7 , 8 , 9. el Aβ depositado el AlCl3 impide formación de Aß soluble, y RHTGF-β1 puede promover la producción de Aß depositado y facilitar AD ocurrencia10. Este ataque de varios factores a la neurona está de acuerdo con la patogenia múltiple de AD.
Todo el experimento abarcó 86 días: la figura 1 muestra una línea de tiempo del diseño experimental, con el momento de cirugía animal, proyección del modelo animal, la prueba de memoria espacial animales y preparación de la muestra. En el primer día de operación, RHTGF-β1 se microinyectados en el núcleo talámico anterodorsal. En el segundo día de operación, Aβ25-35 y AlCl3 fueron microinyectados en el ventrículo lateral diariamente por 14 días consecutivos por la mañana y 5 días consecutivos en la tarde, respectivamente. Todas las ratas podían recuperar para 45 días después de la operación. El laberinto acuático de Morris fue utilizado para las ratas del exitoso modelo con deterioro de la memoria y para evaluar la memoria espacial de ratas. Las ratas experimentaron 4 días consecutivos de laberinto de agua de formación con 2 ensayos por día y el día 4 de entrenamiento, las ratas se evaluaron con el funcionamiento de laberinto de agua de Morris para el deterioro de la memoria. Todas las ratas continúan alimentar 37 días después de la proyección del modelo animal. La memoria espacial de ratas fue probada en el laberinto acuático de Morris en 7 días consecutivos, desde el día 79 a 85 días después de la operación. Todas las ratas fueron sacrificadas por decapitación en día 86 para preparación de muestras de cerebro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56157/56157fig1.jpg"> Figura 1. Timeline del diseño experimental. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56157/56157fig1large.jpg">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Rata Sprague-Dawley</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China</td><td>SCXK (Jing) 2012-0001</td><td>300– Laberinto de agua Morris de 350 g</td></tr><tr><td></td><td>Academia China de Ciencias Médicas e Instituto de Investigación Médica de la Unión de Pekín, China</td><td>No</td><td></td></tr><tr><td>Anestesia móvil para animales pequeños</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>R580</td><td></td></tr><tr><td>Aparato estereotáxico cerebral</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>68001</td><td></td></tr><tr><td>Taladro de hueso flexible</td><td>Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China</td><td>BW-sD908</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>Japan Co., Ltd. Japón</td><td>JEM-1400</td><td></td>Bomba de</tr><tr><td>microinyección de dos canales</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>RWD202</td><td></td></tr><tr><td>EM micrótomo</td><td>Hitachi Co., Ltd. China</td><td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td>Cánula ficticia</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>62001</td><td>0.D.0.64 veces; I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html</td></tr><tr><td>cánula guía</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>62101</td><td>0.D.0.40mm/M3.5</td></tr><tr><td>Cánula interna</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>62201</td><td>0.D.0.41× I.D.0.25mm/<img alt="Especial" src="/files/ftp_upload/56157/special01.jpg">M3.5</td></tr><tr><td>Apriete la tuerca</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>62501</td><td>0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5</td></tr><tr><td>Tornillo de fijación</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>62514</td><td>M1.2× L2.0mm (100BAO)</td></tr><tr><td>El destornillador</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>62999</td><td>45 * 1mm</td></tr><tr><td>PE Tubing</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>62302</td><td></td></tr><tr><td>Beta amiloide 25-35</td><td>Sigma Aldrich Co. EE. UU.</td><td>SCP0002-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento transformante humano recombinante-β 1</td><td>PeproTech Inc. EE. UU.</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Tricloruro de aluminio</td><td>Tianjin Kemiou Reactivo químico Co., Ltd. China</td><td>3011080</td><td></td></tr><tr><td>Congo rojo</td><td>Tianjin Kemiou Reactivo químico Co., Ltd. China</td><td>3010016</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de plata</td><td>Sinopharm Reactivo Chcmical Co., Ltd. China</td><td>20150720</td><td></td></tr><tr><td>Material base para dentaduras postizas</td><td>Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. China 20170609</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de un imitador valiosa de la enfermedad de alzheimer en modelo animal de rata por la inyección intracerebroventricular de proteína beta amiloide compuesta

Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer's Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein

Enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad irreversible y progresiva del cerebro que lentamente destruye la memoria y se acompaña por el cambio de pérdida y estructura de la neurona. Con el aumento de pacientes con EA en todo el mundo, la patología y el tratamiento de la enfermedad se ha convertido en un foco en la industria farmacéutica internacional. Así, el establecimiento del modelo animal para imitar el anuncio en el laboratorio es de gran importancia.
Aquí, describimos un protocolo detallado para el establecimiento de un imitador de AD en un animal de rata modelo aunque la inyección intracerebroventricular de amiloide beta proteína 25-35 (Aβ25-35) combinado con tricloruro de aluminio (AlCl3) y núcleo talámico anterodorsal inyección de recombinantes humanos transformar el factor de crecimiento β1 (RHTGF-β1) a las ratas. Se midieron los marcadores relacionados de AD, incluyendo: memoria espacial, estructura neuronal y subestructura, Aβ neuronal y la producción de ovillos neurofibrilares (NFT). Este modelo de rata muestra deterioro de la memoria espacial, estructura neuronal y cambios patológicos de la subestructura, carga Aβ intracelular neuronal y agregación de NFT y proporciona a un imitador cerca del desorden neuronal de la estructura y función del clínico Pacientes con EA. Así, la actual AD rata modelprovides una herramienta valiosa en vivo para explorar la función neuronal, patología neuronal y screening de drogas de AD.

Se trata de un protocolo para imitar la enfermedad de Alzheimer en ratas mediante la evaluación de deterioro de la memoria espacial, cambios patológicos neuronales, neuronal amiloide beta proteína (Aβ) carga y combinado de la agregación de los enredos de neurofibrillary, inducida por la inyección de Aβ25-35 con tricloruro de aluminio y recombinantes humanos transformar el factor de crecimiento β1.

Establecimiento de un imitador valiosa de la enfermedad de Alzheimer en modelo Animal de rata por la inyección Intracerebroventricular de proteína Beta amiloide compuesta

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer. La principal ventaja de esta técnica es que imita la enfermedad de Alzheimer en el modelo animal de rata mediante la inyección intracerebroventricular de A-beta 25 a 35, combinada con tricloruro de aluminio y factor de crecimiento transformante beta uno humano recombinante. También proporciona un protocolo experimental rápido y relativamente sencillo con una alta tasa de supervivencia de los animales, una alta tasa de éxito del modelo, así como una elevada tasa de duplicación, lo que ha demostrado ser más económico.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la evaluación de la eficacia de fármacos contra la AD, ya que este modelo animal presenta alteraciones de la memoria y trastornos neuronales similares a los estados de los pacientes con AD. El procedimiento será demostrado por Cheng Jianjun, un técnico de mi laboratorio. En una rata anestesiada, comience cortando el pelo en el vértice de la cabeza con tijeras quirúrgicas y desinfecte con yodóforo.A continuación, realice una incisión en la piel de la cabeza a lo largo de la calota longitudinal media con bisturíes y tijeras quirúrgicas. Separe el tejido subcutáneo y la fascia, limpie la calota craneal con peróxido de hidrógeno al 0,3 % y marque el bregma con un rotulador. A continuación, marque tres puntos: el núcleo talámico anterodorsal para inyectar RHTGF beta uno y fijar un tornillo, la zona del ventrículo lateral, o VL, para inyectar A-beta 25-35 y AICI3, y finalmente el lugar para la fijación del segundo tornillo.Taladre suavemente tres orificios de un milímetro de diámetro con un taladro óseo flexible en los tres puntos marcados sobre el cráneo. Detenga la hemorragia y limpie repetidamente la superficie del cráneo con algodón estéril y seco. A continuación, inserte una aguja conectada a la bomba de microinyección en el cerebro a una profundidad de 4,2 milímetros e inyecte suavemente un microlitro de RHTGF beta uno en el área ad.Mantenga la microinyección durante dos minutos después de la inyección. Luego, sáquela lentamente. Fije los dos tornillos en el cráneo, en los puntos marcados previamente, con un destornillador pequeño.Después de colocar el tornillo, ensamble el sistema de implantación de cánulas insertando primero la cánula simulada en la cánula guía tras desinfectarla mediante inmersión en alcohol al 75% durante 24 horas. Luego, inserte la cánula guía de tubo de acero inoxidable en el cerebro a 4,6 milímetros dentro del área del ventrículo lateral (LV) a través del orificio en el cráneo, con la ayuda de un portacánula en el aparato estereotáxico de la rata. A continuación, mezcle el material de base para prótesis dental con agua para base de prótesis en una proporción de 1,5 gramos por un mililitro.Coloque la pasta para cubrir el pedestal de plástico de la cánula guía y los dos tornillos para inmovilizar la cánula guía. Cubra toda la incisión en la piel para evitar infecciones cutáneas. Al día siguiente, retire la cánula simulada e inserte la cánula interna dentro de la cánula guía.Ajuste el tornillo de fijación para inmovilizar la cánula interna. Coloque el tubo de polietileno que conecta la bomba de microinyección con la cánula interna, y regule la velocidad de inyección a un microlitro por minuto. Microinyecte el A-beta 25-35 en el ventrículo lateral (LV). Espere cinco minutos después de finalizar la inyección, y retire suavemente la cánula interna.Luego, inserte nuevamente la cánula simulada dentro de la cánula guía. En el día 15 posterior a la cirugía, desmonte el sistema de implantación de cánula eliminando el material de base para prótesis dental sólido con tijeras quirúrgicas y pinzas, y desinfecte la herida con yodóforo. Finalmente, rellene el orificio del cráneo con cemento óseo y cierre la piel con un método de sutura simple interrumpida.Comience por ennegrecer el agua de la piscina con colorante alimentario negro. Mantenga la profundidad del agua en 31,5 centímetros y la temperatura en 23 más o menos un grado Celsius. Luego, coloque una plataforma circular transparente de plexiglás de 1,5 centímetros por debajo de la superficie del agua.A continuación, divida la piscina en cuatro cuadrantes iguales mediante líneas imaginarias para la recopilación descriptiva de datos. Coloque la plataforma oculta en el primer cuadrante, o Q1, del laberinto acuático. Por último, registre los comportamientos natatorios de la rata mediante una cámara de video sobre el laberinto acuático, conectada a un software informático de análisis gráfico.Estos resultados indican que el grupo de ratas sometido a sham-operación siempre nadó libremente, mientras que las ratas del grupo tratado con A-beta compuesto siempre nadaron alrededor del perímetro de la piscina en nado adaptativo en el laberinto acuático de Morris. Durante los cuatro días de evaluación para identificar ratas modelo de deterioro cognitivo, todas las ratas mostraron tiempos progresivamente decrecientes para encontrar la plataforma oculta. Además, las latencias del grupo tratado con A-beta compuesto para localizar la plataforma oculta fueron significativamente más largas que las del grupo sham-operado, lo que demuestra que el A-beta compuesto puede aumentar el deterioro del re-aprendizaje de la memoria en ratas.En la prueba de retención de la memoria de un día, el grupo tratado con A-beta compuesto tardó menos tiempo nadando, recorrió una distancia menor y realizó menos cruces dentro de los 60 segundos, en comparación con el grupo sometido a cirugía simulada. Por último, además de los cambios patológicos, el número de neuronas también se redujo significativamente en el hipocampo y la corteza cerebral del grupo tratado con A-beta compuesto en comparación con el grupo sometido a cirugía simulada. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en 20 a 30 minutos si se realiza adecuadamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar evitar que la cánula guiada se desprenda del tornillo encefálico. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la prueba de laberinto para responder preguntas adicionales, como si el modelo de AD simulado fue exitoso. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran enfermedades neurodegenerativas in vivo.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer modelos animales de simulación de la enfermedad de Alzheimer mediante la inyección intracerebroventricular de A-beta 25 a 35 combinada con tricloruro de aluminio y factor de crecimiento transformante beta uno recombinante humano en ratas. No olvide que trabajar con metacrilato de polimetilo puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar mascarillas y guantes, durante la realización de este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Una de las características patológicas de la EA es la formación de placas de proteína amiloide β neuríticas positivo. En este protocolo se describen dos métodos de detección de placas neuríticas en ratones transgénicos modelo de AD: la detección inmunohistoquímica utilizando el método ABC y DAB y detección fluorescente utilizando el método de tinción thioflavin S.

La detección de placas neuríticas en el modelo de la enfermedad de Alzheimer ratón

Este video muestra el procedimiento de inyectar péptidos amiloides monoméricos en el prosencéfalo de un pez cebra adulto para generar toxicidad amiloide, imitando el daño neuronal observado en la enfermedad de...

Establecimiento de un modelo de enfermedad de Alzheimer en el cerebro de pez cebra mediante la inyección de péptido amiloide

Este video muestra el procedimiento para inyectar péptidos de beta-amiloide, cloruro de aluminio y un factor de crecimiento neuroinflamatorio, que colectivamente ayuda en la formación de placa amiloide tóxica en la región del hipocampo. Esto causa deterioro de la memoria en la rata, característico de la enfermedad de Alzheimer.

Establecimiento de un modelo de rata para la enfermedad de Alzheimer a través de una inyección de péptido de beta amiloide

Este video muestra la infusión estereotáxica precisa de beta amiloide en el giro dentado para establecer un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer. La determinación precisa de las coordenadas y la administración controlada de las proteínas beta amiloides dan como resultado la degradación neuronal, lo que interrumpe el procesamiento de la memoria y contribuye al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer.

Infusión cerebral estereotáxica directa de proteínas beta-amiloide para un modelo de enfermedad de Alzheimer

Aquí, presentamos un protocolo para la infusión cerebral estereotáxica directa de beta-amiloide. Esta metodología proporciona un modelo de ratón alternativo in vivo para abordar los efectos a corto plazo de la beta-amiloide en las neuronas cerebrales.

Infusión estereotáxica de Oligomeric beta-amiloide en el hipocampo del ratón

Para investigar la co-mórbida enfermedad de Alzheimer (EA) y la condición de accidente cerebrovascular en un nuevo modelo, se describen tres tareas de comportamiento que evaluar tanto el control motor y comportamientos cognitivos. Estas tareas incluyen la tarea haz de pie, tarea cilindro y laberinto acuático de Morris.

Motor y del hipocampo aprendizaje espacial dependiente y Evaluación de referencia a memoria en un modelo de rata transgénica de la enfermedad de Alzheimer con accidente cerebrovascular

El amiloide-β (Aß): se inyecta modelo animal permite la administración de una cantidad y especies de fragmentos Aß definido y reduce las diferencias individuales dentro de cada grupo de estudio. Este protocolo describe la inyección intracerebroventricular (ICV) de Aß sin instrumentos de estereotaxia, permitiendo la producción de anomalías en el comportamiento de Alzheimer como en ratones normales.

La inyección intracerebroventricular de péptidos beta-amiloide en ratones normales para inducir de forma aguda déficits cognitivos como la enfermedad de Alzheimer,

Para estudiar los efectos del Aβo in vivo, desarrollamos un modelo basado en infusiones repetidas de Aβo soluble en el hipocampo junto con una infusión continua de anticuerpo Aβo (6E10) en el hipocampo utilizando bombas osmóticas para contrarrestar el efecto neurotóxico del Aβo.

Neurodegeneración en un modelo animal de beta-amiloide crónica Oligómero de infusión es contrarrestado por el anticuerpo Tratamiento Con una infusión de bombas osmóticas

Hemos desarrollado una metodología para 3D cuantitativa en el modelado in silico (q3DISM) de β-amiloide cerebral fagocitosis (Aß) por los fagocitos mononucleares en modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer. Este método puede ser generalizado para la cuantificación de virtualmente cualquier caso fagocítica in vivo.

3D cuantitativa In silico Modelado (q3DISM) de beta-amiloide cerebral fagocitosis en roedores modelos de enfermedad de Alzheimer

Este protocolo ilustra un método de encapsulación celular mediante la gelación física rápida de alginato para inmovilizar las células. Los microperlas obtenidos permiten la secreción controlada y sostenida de amiloide a lo largo del tiempo y se pueden utilizar para estudiar los efectos de los amiloides secretos en modelos in vitro e in vivo.

Fabricación de Microperlas de Alginato Secreto de Amiloide para su uso en el modelado de la enfermedad de Alzheimer

Aprende a establecer un modelo de enfermedad de Alzheimer en ratas mediante inyección intracerebroventricular de Aβ25-35, cloruro de aluminio y factor de crecimiento transformante beta. Este método permite evaluar alteraciones de memoria espacial y cambios neuronales patológicos de forma reproducible.

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Establecimiento de un imitador valiosa de la enfermedad de Alzheimer en modelo Animal de rata por la inyección Intracerebroventricular de proteína Beta amiloide compuesta

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