Name: Derivación de líneas de células madre de embriones de preimplantación de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Aprende a derivar líneas de células madre embrionarias de ratón con alta eficiencia usando condiciones estándar y fibroblastos de piel humana como células alimentadoras. Este protocolo simplificado facilita la investigación en medicina regenerativa.

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Agradecemos a Jonatan Lucas por su asistencia técnica en cultivo de células de alimentador, Servei Estabulari de la UAB para el cuidado de los animales y Domènec Martín para grabar el video. Este trabajo ha sido apoyado por el Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R y la Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC es beneficiario de una beca de PIF-UAB.

el uso de los animales descritos en las secciones a continuación ha sido aprobado por el Comité de ética Animal y de la investigación humana de la Universitat Autònoma de Barcelona y por el Departamento d &#39; Agricultura, Ramaderia, Pesca Alimentació de la Generalitat de Catalunya (protocolo #8741).
 1. inactivación de células de alimentador y almacenamiento Nota: fibroblastos de prepucio humano (HFF-1) fueron congelados previamente en 1 mL de la solución congelada que consiste en 90% suero bovino Fetal (FBS) y 10% dimetil sulfóxido ( DMSO) y almacenadas en nitrógeno líquido hasta uso.
<ol><li>Descongelar un vial criogénico de HFF-1 (1 mL) sumergiendo el frasco en un baño de agua de 37 ° C.</li>
	<li>Agregar el contenido descongelado del frasco criogénico a precalentado Dulbecco &#39; s Modified Eagle &#39; s medio (DMEM) suplementado con 10% FBS para hacer un 1:10 dilución.</li>
	<li>Las células diluidas (10 mL) de semillas en un frasco de T75 y cultivo a 37 ° C y 5% CO 2.</li>
	<li>Al día siguiente, cambiar el medio para eliminar los restos de DMSO. Quite el medio y añadir 10 mL de precalentado DMEM suplementado con 10% FBS.</li>
	<li>Cultura las HFFs y cambiar el medio cada 48 h hasta que la cultura llegue a la etapa confluente. Esto puede tardar aproximadamente 7 a 10 días.</li>
	<li>Para preparar la solución de inactivación, diluir la mitomicina C en DMEM suplementado con 10% FBS a una concentración final de 10 μg/mL. Incubar las células con la solución de inactivación por 3 h a 37 ° C y 5% CO 2.</li>
	<li>Eliminar la inactivación de la solución y enjuague las células tres veces con 2 mL de Hanks balanceada sal solución (HBSS) para eliminar restos de mitomicina C.</li>
	<li>Para separar las células inactivadas, añadir 1 mL de solución de tripsina-EDTA precalentado e incubar 5 min a 37 ° C y 5% CO 2.</li>
	<li>Observar las células bajo un microscopio invertido para asegurar que están separadas (objetivo de 10 x 0.3 apertura numérica o NA). Si no, los incuban durante un par de minutos más a 37 ° C y 5% CO 2. Compruebe las células otra vez bajo el microscopio invertido.</li>
	<li>Pipetear la solución con una pipeta Pasteur para disociar las matas celular.</li>
	<li>Neutralizar la solución enzimática añadiendo 4 mL de DMEM suplementado con 10% FBS y resuspender.</li>
	<li>Toma una alícuota de la suspensión de células y hace una dilución 1: 100 en HBSS. Para determinar el número de células, cargar 10 μl de la dilución en un Neubauer &#39; cámara de s. Contar las células situadas en una de las grandes plazas de la cámara en un microscopio invertido (objetivo 20 x con un NA 0.45).
	<ol><li>Repetir el recuento en un total de cuatro cuadrados grandes. Calcular el número total de células (N) n = número promedio de células contadas x volumen total x dilución x 10 4.</li>
	</ol></li> <li>Centrifugar el resto de la muestra durante 5 min a 200 x g. descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado con congelación de la solución en una concentración de 10 6 células / mL.</li>
	<li>Alícuota la suspensión en frascos criogénicos con 10 6 celdas (1 mL) cada uno. Coloque los frascos criogénicos en un recipiente de congelación y congelación a -80 ° C.</li>
	<li>Al día siguiente, guarde los viales criogénicos de nitrógeno líquido.</li>
</ol> 2. Cultivo de células de alimentador <ol><li>uno a cuatro días antes de iniciar el proceso de derivación, inactivado de descongelar un vial criogénico que contiene 1 x 10 6 células de HFF-1 en un baño de agua a 37 ° C.</li>
	<li>Hacer una dilución de 1:6 del HFF-1 descongelado en pre calentado DMEM suplementado con 10% FBS y mantenga la temperatura a 37 ° C.</li>
	<li>Llene cada pocillo de una placa de 4 pozos con 500 μl de precalentado 0.2% de gelatina de piel porcina y mantenga la placa a 37 ° C durante 10 minutos</li>
	<li>Quitar el 500 μl de la gelatina de los pozos y agregar 500 μl de la dilución de HFFs. Muévalo suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de las HFFs en la parte inferior de los pozos. Evitar movimientos circulares, de lo contrario las células se concentrarán en el centro del pozo.</li>
	<li>Incubar la placa por lo menos 24 h a 37 ° C y 5% CO 2 para obtener una monocapa de HFFs inactivados en cada pozo.</li>
	<li>Al día siguiente, observar las células bajo un microscopio invertido (objetivo de 10 X con NA 0.3) y compruebe que están conectados y distribuidos homogéneamente. Cambiar el medio para eliminar los restos de DMSO. Quite el medio y agregar 500 μl de precalentado DMEM suplementado con 10% FBS.</li>
</ol> 3. Colección de embriones y de la cultura <ol><li>cuatro días antes de la recogida de embriones, administrar 5 UI de yegua preñada &#39; gonadotropina del suero de s por inyección intraperitoneal a ratones hembra 6-12 semanas de edad. 
	Nota: Hemos utilizado las hembras de los 129S2 o cepas de B6CFAF1, aunque las hembras de otras cepas de ratón pueden ser utilizadas. Sin embargo, cuando trabajo con hembras de cepas no-permisivas (por ejemplo, CBA), medio debería complementarse con 2i como se menciona en el paso 4.2.</li>
	<li>Después de 48 h, administrar 5 UI de gonadotropina coriónica humana por inyección intraperitoneal y aparearse las hembras con los machos, por lo menos 8 semanas de edad, en una proporción 1:1. Separar las hembras de los machos al día siguiente.</li>
	<li>El día antes de embrión, preparar un cultivo de células de 35 mm placa de Petri con varias gotas de μl 40 KSOMaag suplementado con 4 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA) y llenar el plato con aceite mineral para cubrir completamente las gotas. Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO 2 para equilibrar el medio.</li>
	<li>Para preparar pipetas de la manipulación del embrión, calienta la parte más delgada de un cristal con punta larga pipeta Pasteur utilizando un mechero Bunsen. Una vez suave, retirar del fuego y separe los dos extremos. Romper a la longitud deseada. El diámetro interior en la punta debe ser 100-150 μm.</li>
	<li>Eutanasia los ratones hembra por dislocación cervical 45-48 h post-coitum (p.c.).</li>
	<li>Disecar ratones para exponer la cavidad abdominal mediante la reducción de la piel con unas tijeras afiladas lisas curvadas y peritoneo con tijeras recta agudos. Agarrar un útero con pinzas, corte el oviducto utilizando unas tijeras afiladas rectas y colóquelo en CZB tamponado con Hepes medio (HCZB) 13 a 37 ° C. Repita el proceso para eliminar el otro oviducto.</li>
	<li>Descarga los oviductos con una jeringa de 1 mL cargados con HCZB sostenido por pinzas de relojero para recoger los embriones de 2 células. 
	Nota: Para preparar la aguja lavado, tomar una aguja de hipodérmica 30 G, corte el extremo y una punta Roma en una piedra abrasiva de tierra.</li>
	<li>Usando el aparato de la pipeta de boca, recoger los embriones, lavar en HCZB y les cultura en la placa de cultivo de embriones previamente preparado a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta la fase de blastocisto. Hasta 50 embriones pueden ser cultivados en cada gota de 40 μl. Supervisar el desarrollo del embrión cada 24 h bajo un estereomicroscopio. 
	Nota: Como alternativa, los embriones pueden recogerse en la etapa de blastocisto para acortar en vitro el cultivo de embriones. En este caso, las hembras de eutanasia en día 3.5-4.5 p.c., diseccionar el útero. y enjuague con HCZB.</li>
</ol> 4. Derivación de células madre <ol><li>preparación de las placas de derivación <ol><li>en el día de la siembra de embriones, preparar el medio de derivación complementando el medio DMEM con 100 μm 2-β-mercaptoetanol, 1 x de los aminoácidos no esenciales , el 20% de reemplazo de suero y 10 3 U/mL LIF.</li>
		<li>Si lo desea, también añadir 1 μm del inhibidor MEK PD0325901 y 3 μm del inhibidor GSK3 CHIR99021 para obtener un medio de 2i.</li>
		<li>Tomar la placa de 4 pozos con la monocapa de HFFs inactivadas (paso 2.6) de la incubadora. Quite el medio y añadir 800 μl de medio con derivación a cada pocillo. Devolver la placa a la incubadora de.</li>
	</ol></li> <li>Retiro de la Zona pelúcida y embrión siembra <ol><li>preparar un cultivo celular de 35 mm placa de Petri con gotas tres 30 μl de ácido Tyrode &#39; s solución 14 y gotas tres 30 μl de medio de derivación. Cubrir las gotas con aceite mineral y mantener el plato a 37 ° C.</li>
		<li>Tomar la placa de cultivo de embrión de la incubadora. Uno por uno, transfiera los blastocistos de las gotas de cultura a un ácido Tyrode &#39; gota de la solución de s con una pipeta de manipulación de embriones. Si es posible, seleccione sólo los blastocistos expandidos para iniciar el proceso de derivación.</li>
		<li>Monitor la zona pelúcida digestión bajo el estereomicroscopio. Tan pronto como desaparece la zona pelúcida, transferir el blastocisto a una gota media de derivación para lavar el ácido Tyrode &#39; solución s.</li>
		<li>Tomar la placa de 4 pozos de derivación de la incubadora y semilla de una zona libre blastocisto en el alimentador de células en cada pozo.</li>
		<li>Volver la placa de 4 pozos de derivación a la incubadora y la cultura en 37 ° C y 5% CO 2.</li>
	</ol></li> <li>Crecimiento de la célula de vástago de monitoreo y medio cambio <ol><li>vigilar los cultivos cada 24 h debajo de un microscopio invertido (objetivo 20 X con NA 0.45). Es importante observar si hay signos de diferenciación de células madre, como células refractivas inflamadas que rodea el fruto o incluso empujar el alimentador células aparte.</li>
		<li>Día, cambiar el medio de la cultura. Tomar la placa de 4 pozos de la incubadora, retire el medio de cada bien y añadir 800 μl de medio con derivación suplementado con LIF y 2i, si se utiliza. Mantener la cultura hasta crecimientos se observan (días 6-8).</li>
	</ol></li></ol> 5. Mantenimiento y cultivo de células de vástago asas de Kolle-como <ol><li>preparar y pipetas de manipulación de células madre. Siga el paso 3.4 preparar pipetas de manipulación de la célula de vástago con diámetro interno en la punta de 250-300 μm. utilizar la otra parte de la pipeta de Pasteur tirada para preparar el mango de Kolle-como. Calor y la forma hasta obtener un gancho de.</li>
	<li>Tomar la placa de cultivo de 4 pozos fuera de la incubadora y localizar la consecuencia bajo un estereomicroscopio. Use la manija para alejar las células diferenciadas y los alimentadores que rodean el fruto. 
	Nota: Para evitar eventual diferenciación de la consecuencia, es importante eliminar todas las células diferenciadas del borde de la extensión.</li>
	<li>Aspire el fruto con una pipeta de la manipulación de células madre y coloque en un plato nuevo en una gota de tripsina-EDTA 50 μl.</li>
	<li>Utilizar un bisturí para cortar el fruto en varias partes para desagregación mecánica y enzimáticamente.</li>
	<li>, Transferencia de los fragmentos del fruto en una dulce gota de medio de derivación para neutralizar la acción de la tripsina.</li>
	<li>Transferencia de los fragmentos del fruto a una nueva placa de 4 pozos con una monocapa de alimentadores. Transferencia de fragmentos de hasta 10 por pozo y de la cultura con un medio de derivación a 37 ° C y 5% CO 2.</li>
	<li>Mantener las culturas de célula de vástago-como por lo menos seis semanas antes de considerar la línea mESC establecida. Cambiar el medio cada otro día y subcultura ellas una vez por semana.</li>
</ol>

<ol><li>Biswas, A., Hutchins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells.</a> Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).</li>
<li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+stem+cell+states%3A+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells%3A+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).</li>
<li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prot%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).</li>
<li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li>
<li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).</li>
<li>Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+germline+transmission+of+mouse+embryonic+stem+cells+grown+in+synthetic+serum+in+the+absence+of+a+fibroblast+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer.</a> Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Wakayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+establishment+of+mouse+embryonic+stem+cell+lines+from+single+blastomeres+and+polar+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+%28Dayton%2C+Ohio%29%22%5BJournal%5D)">Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).</li>
<li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2760894">An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).</li>
<li>Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).</li>
<li>Lee, K. H. <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/pluripotent-stem-cells/conditions-and-techniques-for-mouse-embryonic-stem-cell-derivation-and-culture">Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture.</a> Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+foreskin+fibroblast+produces+interleukin-6+to+support+derivation+and+self-renewal+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).</li>
<li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+generation+of+C57BL%2F6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).</li>
<li>Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+medium+composition+and+serum+or+serum+replacement+concentration+influences+on+the+maintenance+of+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells.</a> Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).</li>
<li>Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+difference+in+establishment+of+mouse+embryonic+stem+%28ES%29+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines.</a> Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).</li>
<li>Gonzalez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+culture+conditions+support+distinct+states+associated+with+different+developmental+stages+and+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency.</a> Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque mESC línea derivación es un procedimiento bien conocido en muchos laboratorios utilizado habitualmente, su eficiencia no siempre es tan alta como se esperaba debido a los múltiples factores que pueden perturbar el mantenimiento de la pluripotencia. En el presente artículo mostramos, paso a paso, cómo establecer líneas mESC con alta eficiencia utilizando un protocolo sencillo y fiable. Estas eficiencias son similares a los reportados en la literatura.
Para asegurar la máxima eficiencia, ...

Las células madre embrionarias (ESC) son células pluripotentes derivadas de embriones preimplantación, que conservan la capacidad de autorrenovación o diferenciar bajo condiciones específicas1. Partiendo de estas propiedades, ESC se han convertido en una herramienta útil para la medicina regenerativa, modelado de la enfermedad y tejido ingeniería estudios2.
ESC se derivan por primera vez embriones de preimplantación ratón, origina líneas ESC (mESC) de ratón con éxito bajo3,4. Durante años, la eficacia de la derivación seguía siendo baja debido a la dificultad de mantenimiento de la pluripotencia in vitro. Además de la presencia de alimentador células5, que mejorar la eficiencia de la derivación, promover la fijación de la Colonia y mejorar estabilidad cariotípica6, varias modificaciones del protocolo conducen a una mejora en el mantenimiento de la pluripotencia. El más importantes eran la adición de Factor inhibitorio de leucemia (LIF) para mESC medio de cultivo7,8, el uso de embriones de la 129S2 fondo permisiva9 y define la cultura de la mESC con suplementado con suero, libre de potenciales factores de diferenciación10. Más recientemente, convincente evidencia ha demostrado que la adición de un cóctel de dos moduladores de molécula pequeña de vías de señalización al medio de cultivo mESC (conocido como 2i) es mejor mantener la pluripotencialidad. El 2i cóctel consiste en una combinación de inhibidor de la MEK PD0325901, que reduce las señales de diferenciación mediante la inhibición de la vía de la quinasa (MAPK) de proteína mitogen-activados, y el inhibidor de la GSK3β CHIR99021, que mejora la supervivencia de la célula a baja densidad mediante la activación de la vía Wnt del11.
En el presente artículo, se describe un protocolo simple para derivar eficazmente mESC líneas de blastocistos de ratón. Seguimos procedimientos estándar, cultivo de embriones de cepas permisivas en las células de alimentador en medio de la derivación con LIF y un recambio de suero12. Siguiendo este protocolo, mESC líneas puede derivarse con rendimientos equivalentes a las obtenidas en medio 2i. A pesar de esto, pueden agregarse 2i para evitar posibles problemas con el mantenimiento de la pluripotencia o cuando se trabaja con cepas no permisiva.

<table><tbody><tr><td>1 mL de jeringa</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>2-&beta;-mercaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 4 pocillos</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Tyrode Ácido&nbsp;</td><td>Hecho en</td><td></td> casa <td>Ver receta en Nagy et al, 2003. Para el almacenamiento a corto plazo (hasta 1 mes) manténgalo a 4 °C. Alternativamente, para el almacenamiento a largo plazo, manténgalo a -20 °C. Si la eficacia de la solución disminuye, debe acidificarse mediante la adición de una pequeña gota de HCl 1M.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Pollo anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Sondas Moleculares - Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>dilución 1:500. Anticuerpo secundario para anticuerpos de ratón Oct4, Tuj1, &alpha;SMA y AFP.&nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1386</td><td>Reconstituir con 2,15 ml de DMSO por cada mg de polvo, para obtener una solución madre de 1 mM. Alícuota al volumen deseado y almacene a -20&ordm;C. Evite los ciclos de congelación y descongelación.&nbsp;</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>3754518</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>Inactívelo antes de usarlo calentándolo durante 30 minutos a 56&ordm;C. Aliquot y guárdelo a -20&ordm; C</td></tr><tr><td>Aguja de lavado</td><td>BD&nbsp;</td><td>304000</td><td>Cortar el extremo de la aguja y moler hasta obtener una punta roma sobre una piedra abrasiva</td></tr><tr><td>Gelatina de piel de cerdo</td><td>Fluka</td><td>48724</td><td>Diluir al 0,2% en agua destilada y esterilizarla en autoclave. Cada dilución se puede utilizar durante un mes.</td></tr><tr><td>IgG anti-Conejo de Cabra, Alexa Fluor 594</td><td>Sondas Moleculares - Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>dilución 1:500. Anticuerpo secundario para el anticuerpo de conejo Sox2.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>CZB&nbsp;</td><td>Hecho</td><td></td><td>en casa Ver composición en Chatot et al, 1989</td></tr><tr><td>Gonadotropina coriónica humana</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>Diluir en NaCl 0,9% a 50 UI/ml. Aliquotar en 1 ml y almacenar a -20&ordm; C durante un máximo de dos meses. Una vez descongelado, no vuelva a congelar.</td></tr><tr><td>Fibroblastos del prepucio humano</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>Para el almacenamiento a largo plazo se recomienda almacenarlos en nitrógeno líquido.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Life</td><td>Technologies</td><td>&nbsp; 10828-028</td><td>Fotosensible. Se recomienda alícuota en pequeños volúmenes como 10 ml y almacenarlo a -20&ordm; C (comprobar la fecha de caducidad). Evite los ciclos de congelación y descongelación. &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td><td>Suplemento con 4 mg/ml de BSA. Equilibrio a 37&ordm; C y 5% de CO2 al día antes de su uso.</td></tr><tr><td>Factor inhibidor de la leucemia</td><td>Merk Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>ratones&nbsp;</td><td>Charles River/Harlan</td><td></td><td>Se recomienda utilizar ratones de una cepa permisiva en términos de derivación de mESC (como 129S2 o C57BL). Sin embargo, las cepas endogámicas son menos eficientes en la producción de embriones. Por lo tanto, se recomienda utilizar una cepa híbrida, como 129S2 x C57BL o B6CBAF1 para aprovechar el vigor híbrido.</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Embrión testado. Fotosensible.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>Reconstituir el polvo con agua MilliQ a 0,5 mg/ml. Almacenar a 4&ordm; C protegido de la luz. Atención, es dañino y se sospecha que causa cáncer.</td></tr><tr><td>Anti-tubulina y beta para ratones; III (Tuj1)</td><td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>Dilución 1:500</td></tr><tr><td>Monoclonal de ratón anti-&alfa;SMA</td><td></td><td>Sigma A5228</td><td>Dilución 1:200</td></tr><tr><td>Monoclonal de ratón anti-AFP</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1368</td><td>dilución 1:50</td></tr><tr><td>anti monoclonal de ratón Oct3/4&nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>Sc-5279</td><td>dilución 1:50</td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales Life</td><td>Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1408</td><td>Reconstituir con 2,08 ml de DMSO por cada mg de polvo, para obtener una solución madre de 1 mM. Alícuota al volumen deseado y almacene a -20&ordm;C. Evite los ciclos de congelación y descongelación.</td></tr><tr><td>Placa de Petri (35 mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (60 mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina sérica de yegua preñada</td><td>Foligon</td><td>Foligon-1000 UI</td><td>Diluir en NaCl al 0,9% a 50 UI/ml. Aliquotar en 1 ml y almacenar a -20&ordm; C durante un máximo de dos meses. Una vez descongelado, no vuelva a congelar.</td></tr><tr><td>Conejo policlonal anti-Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>T75 halcón</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>Diluir 1:10 en HBSS para obtener una solución 1x</td></tr></tbody></table>

derivación de líneas de células madre de embriones de preimplantación de ratón

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivación de células madre embrionarias (mESC) de ratón es el proceso por que pluripotentes se establecen líneas celulares de embriones de preimplantación. Estas líneas conservan la capacidad de autorrenovación o diferenciar bajo condiciones específicas. Debido a estas propiedades, mESC son una herramienta útil en la medicina regenerativa, modelado de la enfermedad y estudios de ingeniería de tejidos. Este artículo describe un protocolo simple para obtener líneas mESC con eficiencias de derivación alta (60-80%) por cultivo de blastocistos de cepas permisivas ratón células de alimentador en definido suplementado con factor inhibidor de leucemia. El protocolo se puede aplicar también para derivar eficazmente mESC líneas de cepas de ratón no permisiva, por la simple adición de una combinación de dos inhibidores de molécula pequeña al derivación medio (2i). Se proporcionan procedimientos detallados sobre la preparación y cultivo de células de alimentador, recolección y cultivo de embriones de ratón y derivación y cultura de mESC líneas. Este protocolo no requiere equipo especializado y puede realizarse en cualquier laboratorio con experiencia en cultivo células de mamífero básico.

Siguiendo este protocolo, debe lograrse más 95% de la formación del fruto después de la primera semana de la cultura (figura 1A). Establecimiento de líneas de la mESC luego de seis pasos es variable entre los distintos recipientes experimentales, con un éxito promedio de 60-80%. La adición de 2i no mejora significativamente los resultados cuando se trabaja con cepas de ratón permisiva, como aquellas con antecedentes de 129S2, pero es necesario cuando se traba...

Este artículo describe un protocolo y eficiente derivar líneas de células madre pluripotentes de embriones de ratón de la cultura en la etapa de blastocisto.

Derivación de líneas de células madre de embriones de preimplantación de ratón

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Las células madre son células pluripotentes y especializadas caracterizadas por su autorrenovación a largo plazo y su capacidad para dar lugar a células diferenciadas de las tres capas germinales bajo ciertas condiciones. Debido a estas propiedades, las células madre tienen un gran potencial en medicina regenerativa, modelado de enfermedades e ingeniería animal. Durante años, las líneas de células madre embrionarias destinadas a fines de investigación se han derivado principalmente de embriones de ratón, pero en general las eficiencias de derivación logradas han sido bajas.En este video, mostramos un protocolo sencillo para obtener líneas de células madre embrionarias de ratón utilizando condiciones estándar que proporcionan eficiencias de obtención razonablemente altas, comparables a las obtenidas cuando se usan moduladores de vías de señalización, como 2i. En este protocolo, utilizaremos fibroblastos de prepucio humano como células alimentadoras para la obtención y cultivo de ESC. Antes de iniciar el proceso de obtención de ESC, es necesario inactivar las células alimentadoras.Primero, tome un vial criogénico de fibroblastos de prepucio humano almacenado en nitrógeno líquido y désiémelo sumergiendo el vial en un baño de agua a 37 grados C. Una vez désierto, diluya el contenido en DMEM suplementado con suero bovino fetal. Siembre la dilución en un matraz Falcon y cultívelo hasta alcanzar la etapa de confluencia. A continuación, para inactivar los fibroblastos, diluya la mitomicina C en DMEM suplementado con suero bovino fetal e incube las células durante tres horas en esta solución de inactivación.Luego, retire la solución de inactivación y lave las células tres veces con solución salina equilibrada de Hanks para eliminar los restos de mitomicina C. Para desprender las células alimentadoras inactivadas, agregue un mililitro de solución de tripsina-EDTA e incube las células durante cinco minutos. Después, observe las células bajo un microscopio invertido para asegurarse de que se hayan desprendido del frasco de cultivo.Luego, pipetee las células con una pipeta de Pasteur para disociar los agregados celulares y neutralice la solución enzimática añadiendo cuatro mililitros de DMEM suplementado con suero bovino fetal. Tome una pequeña alícuota, dilúyala en solución salina y determine el número de células utilizando una cámara de Neubauer. En paralelo, centrifugue el resto de la muestra.Descarte el sobrenadante y diluya el sedimento en solución crioprotectora a una concentración final de un millón de células por mililitro. Ali-cuote la suspensión en viales criogénicos. Y finalmente, coloque los viales criogénicos en un recipiente de congelación y guárdelos a menos 80 grados C. Al día siguiente, almacénelos en nitrógeno líquido.De uno a cuatro días antes de comenzar el proceso de derivación, tome un tubo criogénico de células alimentadoras inactivadas almacenadas en nitrógeno líquido y descongélelo en un baño de agua a 37 grados C. Luego, diluya las células en DMEM precalentado suplementado con suero bovino fetal y pipetee suavemente para asegurar una mezcla homogénea. Añada 500 microlitros de solución precalentada de gelatina a cada pocillo de una placa de cuatro pocillos, y manténgala a 37 grados C durante 10 minutos. Inmediatamente después, retire la gelatina de cada pocillo.Añada 500 microlitros de la dilución de células alimentadoras a cada pocillo y agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de las células alimentadoras en el fondo de los pocillos. Evite realizar movimientos circulares, ya que esto concentraría las células en el centro del pocillo. Luego, coloque la placa en el incubador a 37 grados y 5% de dióxido de carbono durante al menos 24 horas.Al día siguiente, observe las células bajo un microscopio invertido y verifique que estén adheridas y distribuidas uniformemente. Finalmente, cambie el medio de las células alimentadoras por DMEM precalentado suplementado con suero bovino fetal para eliminar los residuos de DMSO. Antes de la recolección de embriones, induzca la superovulación en hembras de ratón mediante inyección intraperitoneal de cinco unidades internacionales de gonadotropina de suero de yegua preñada y gonadotropina coriónica humana, con un intervalo de 48 horas entre ambas.Aparee a las hembras con machos y sepárelos 24 horas después. Para recolectar embriones en estadio de dos células, sacrifique a las hembras 48 horas postcópula, diseque a las ratones hembras para obtener los oviductos y una porción corta de los cuernos uterinos, y colóquelos en una placa con medio CZB tamponado con HEPES. Luego, uno por uno, lave los oviductos con medio CZB tamponado con HEPES bajo el microscopio estereoscópico para recolectar los embriones.Transfiera los embriones de dos células a una placa de cultivo preparada el día anterior con varias gotas de medio de cultivo embrionario cubiertas con aceite mineral. Mantenga los embriones en el incubador hasta la etapa de blastocisto. Monitoree el desarrollo embrionario cada 24 horas.Se espera que los embriones alcancen la etapa de blastocisto 48 horas después del inicio del cultivo in vitro. Si es posible, seleccione únicamente blastocistos expandidos para comenzar el proceso de derivación. En el día de siembra de embriones, prepare el medio para la derivación de células madre.Añada el factor inhibidor de la leucemia, o LIF, al DMEM suplementado con 2-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales y reemplazo sérico KnockOut. Si se desea, añada un inhibidor de MAPK y un inhibidor de GSK-3 para obtener un medio 2i. Tome la placa de cuatro pocillos con la monocapa de células alimentadoras del incubador.Retire el medio y agregue 800 microlitros del medio de derivación recién preparado. Antes de sembrar los blastocistos sobre las células alimentadoras, se debe eliminar la zona pelúcida. Para ello, transfiera un embrión desde la placa de cultivo a una gota de solución ácida de Tyrode y déjelo allí hasta que la zona pelúcida sea digerida.Asegúrese de que la zona pelúcida se haya eliminado completamente ajustando el enfoque y el contraste del microscopio estereoscópico. Luego, enjuague el embrión sin zona en varias gotas de medio de derivación y siémbralo sobre una monocapa de células alimentadoras. Repita el proceso con el resto de los embriones.Cultivar la placa a 37 grados C y 5% de dióxido de carbono. Monitorear los cultivos cada 24 horas bajo un microscopio invertido para evaluar su crecimiento y para identificar posibles signos tempranos de diferenciación, como células refractivas hinchadas que rodean el crecimiento o incluso que desplazan a las células alimentadoras. Cambiar el medio del cultivo cada dos días.Para ello, retire la placa de cuatro pocillos del incubador, elimine el medio de cada pocillo y agregue 800 microlitros de medio de derivación precalentado suplementado con LIF y 2i, si se utiliza. Devuelva las placas al incubador y mantenga el cultivo hasta observar crecimientos. De seis a ocho días después de la siembra de blastocistos, debería observarse un crecimiento, el cual debe subcultivarse.Para este procedimiento, se requieren pipetas con mangos similares a los de una cuchilla y pipetas para la manipulación de células madre. Para fabricarlas, tome una pipeta Pasteur de punta larga y caliente su parte más delgada utilizando un mechero Bunsen. Una vez que esté blanda, retire la pipeta de la llama y jale de ambos extremos hasta que se separen.Utilice la parte más gruesa como pipeta para la manipulación de células madre. Caliente la punta de la parte más delgada y moldee hasta obtener un gancho para preparar un mango similar al de una cuchilla. Para subcultivar el crecimiento celular, localícelo bajo el microscopio estereoscópico.Con la ayuda del mango, separe las células diferenciadas que rodean el crecimiento. Para evitar una diferenciación eventual, es importante ser riguroso al eliminar las células diferenciadas del borde del crecimiento. Utilizando una pipeta de manipulación de células madre, aspire el crecimiento y colóquelo en una gota de solución precalentada de tripsina-EDTA.Con la ayuda de un escalpelo, corte el crecimiento en varios fragmentos para desagregarlo mecánica y enzimáticamente. Recupere los fragmentos del crecimiento y colóquelos en una gota de medio de derivación precalentado para neutralizar la acción de la tripsina. Finalmente, siembre los fragmentos del crecimiento en una placa de cuatro pocillos con una monocapa de células alimentadoras y cultívelos en medio de derivación a 37 grados C y 5 % de dióxido de carbono.Las culturas con características de células madre deben mantenerse durante al menos seis semanas antes de que una línea de células madre embrionarias pueda considerarse establecida. Durante este periodo, es necesario cambiar el medio cada dos días y realizar subcultivos una vez por semana. A medida que aumentan los números de pase, la morfología de las colonias cambia progresivamente desde una forma abovedada hasta una morfología más alargada y aplanada.Después de seis pases, las líneas de células madre embrionarias de ratón expresan constitutivamente marcadores de pluripotencia, como Oct4 y Sox2. Además, tras inducir la diferenciación in vitro de las células madre embrionarias cultivándolas en DMEM suplementado con 10 % de suero bovino fetal y sin células alimentadoras, pueden detectarse mediante inmunofluorescencia marcadores representativos de las tres capas germinales. Aquí mostramos la detección de la proteína anti-tubulina beta-3 como marcador del ectodermo, de la alfa-actina de músculo liso como marcador del mesodermo y de la alfa-fetoproteína como marcador del endodermo.Tras seguir este procedimiento sencillo, se pueden obtener células madre embrionarias a partir de blastocistos de ratón con eficiencias que oscilan entre el 60 % y el 78 %. Al intentar este procedimiento, es importante controlar las células diariamente o cada dos días, ya que los tiempos indicados aquí son solo orientativos. Si las colonias de células madre embrionarias crecen en exceso, se oscurecen debido a la acumulación celular y tienden a diferenciarse más fácilmente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre el aislamiento y cultivo de células madre embrionarias de ratón utilizando condiciones estándar.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este protocolo detalles de la derivación de células madre hematopoyéticas trasplantables a partir de células madre embrionarias de ratón (ESC) y su posterior inyección en ratones receptores irradiados letalmente. En pocas palabras, el CES se diferencian como cuerpos embrioides, que luego se infectan con HOXB4 retrovirales y co-cultivadas con células del estroma y OP9 citocinas hematopoyéticas.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

La capacidad de las células madre embrionarias humanas de auto-renovación y diferenciación en todos los tipos celulares del cuerpo sugiere que una gran promesa para aplicaciones médicas y como herramienta de investigación para abordar las cuestiones fundamentales en el desarrollo y la enfermedad. Aquí, ofrecemos un breve paso a paso el protocolo para la derivación de células madre embrionarias humanas a partir de embriones por el aislamiento immunosurgical de la masa celular interna.

Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

La capacidad de las células germinales embrionarias a diferenciarse en células germinales primordiales durante etapas tempranas del desarrollo es un modelo perfecto para hacer frente a nuestra hipótesis sobre el cáncer y la infertilidad. Este protocolo se muestra la forma de aislar las células germinales primordiales de las gónadas en desarrollo de embriones de 10.5 a 11.5 días después de ratón coitum.

El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

En este vídeo, se demuestra el aislamiento de los blastocistos de ratón y la derivación de células madre del trofoblasto de los blastocistos. También describe las condiciones para el mantenimiento de la propiedad de células madre, así como la inducción de diferenciación en la cultura.

Derivación de células madre de ratón a partir de blastocistos Trofoblasto

Generación de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) Líneas produce líneas con diferente potencial de desarrollo aún cuando pasan las pruebas estándar de pluripotencia. Aquí se describe un protocolo para producir ratones totalmente derivadas de iPS, que define las líneas de IPSC como poseedor completo...

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

Un método sencillo para obtener y mantener la madre de espermatogonias y las líneas de células progenitoras de ratones adultos se presenta aquí. El método utiliza las células de alimentación se originan en el compartimiento de células somáticas de los testículos de ratón adulto. Esta técnica es aplicable a las cepas de ratones comunes, incluyendo transgénicos, knock-out y knock-en ratones.

Enriquecimiento de serie de la madre de espermatogonias y células progenitoras (SSC) en Cultura para la derivación de largo plazo de ratones adultos Líneas SSC

En los últimos años la formación de las células germinales que utilizan en los métodos de cultivo in vitro se ha demostrado usando varios tipos diferentes de células madre somáticas. En este artículo se presentará visualmente la diferenciación de las células madre derivadas de ratones recién nacidos a principios de células ovocitos similares.

La diferenciación de ratón recién nacido piel derivados de las células madre en células germinales-como<em&gt; In vitro</em

Las células madre embrionarias de ratón pueden diferenciarse a células T in vitro utilizando el sistema de cocultivo OP9-DL1. El éxito en este procedimiento requiere una atención cuidadosa al mantenimiento del reactivo/célula y a los pasos sensibles de la técnica clave. Aquí discutimos estos parámetros críticos y proporcionamos un protocolo detallado para fomentar la adopción de esta tecnología.

Derivación de células T In Vitro De células madre embrionarias de ratón

Este protocolo presenta un método para llevar a cabo cuantitativa, de una sola célula en el análisis in situ de la expresión de la proteína a estudiar especificación linaje en embriones de preimplantación ratón. Los procedimientos necesarios para la recogida de los blastocistos, todo el montaje de detección de inmunofluorescencia de las proteínas, se describen las imágenes de las muestras en un microscopio confocal, y la segmentación nuclear y análisis de imágenes.

Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína para el Estudio de la especificación del linaje de ratón de preimplantación de embriones

Este artículo tiene como objetivo demostrar el uso de células madre embrionarias heploideas partefenogenéticas como sustituto de los espermatozoides para la construcción de embriones semi-clonados.

Aplicación de células madre embrionarias haploides partegenéticas del ratón como sustituto de los espermatozoides

Aprende a derivar líneas de células madre embrionarias de ratón con alta eficiencia usando condiciones estándar y fibroblastos de piel humana como células alimentadoras. Este protocolo simplificado facilita la investigación en medicina regenerativa.

Derivación de líneas de células madre de embriones de preimplantación de ratón

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