En Vivo La proyección de imagen multimodal y análisis del modelo de neovascularización coroidea inducida por láser Mouse

Presentamos la utilidad de la proyección de imagen longitudinal en vivo en el seguimiento de los cambios morfológicos del neovascularization coroides laser-inducida en ratones.

Los procesos neovasculares son un rasgo característico de varias patologías oculares prevalentes. Más prominentemente, la degeneración macular exudativa relacionada con la edad o DMAE húmeda para la retinopatía diabética proliferativa corta y la retinopatía del prematuro. En conjunto, estos trastornos representan la mayoría de los casos de ceguera legal en todo el mundo y se asocian con complicaciones oculares adicionales, como la hemorragia vítrea y el glaucoma neovascular.

Sin embargo, a pesar de su prevalencia, las opciones terapéuticas para los trastornos neovasculares oculares son limitadas. El estándar de atención actual para la neovascularización asociada con la DMAE y la retinopatía diabética proliferativa es la inyección intravítrea de anticuerpos humanizados dirigidos contra un mediador crítico de la angiogénesis y la neovascularización, el factor de crecimiento endotelial vascular o VEGF. Sin embargo, a pesar de la eficacia para detener la progresión de la enfermedad y mejorar la visión funcional, las inyecciones intravítreas son costosas y están lejos de estar exentas de riesgos.

Las complicaciones pueden incluir infecciones, endoftalmitis, desprendimiento de retina y hemorragia ocular. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas opciones de tratamiento que sean eficaces, seguras y menos costosas. Con el fin de avanzar en el desarrollo de fármacos para los trastornos neovasculares, los modelos de animales pequeños son de vital importancia.

Dichos modelos deben ser reproducibles, tener lecturas y criterios de valoración establecidos y validados e, idealmente, utilizar un compuesto de referencia clínicamente relevante para que sirva como control positivo. En este protocolo, presentaremos el modelo de neovascularización coroidea de ratón, o CNV, que es uno de los modelos más comúnmente empleados tanto para el estudio de los mecanismos fisiopatológicos que contribuyen a la CNV como para el desarrollo de nuevos agentes antineovasculares. En el modelo CNV, la membrana de Bruch se rompe utilizando un láser de argón.

Iniciando así los procesos neovasculares que se originan en la coroides. El empleo de imágenes longitudinales in vivo mediante tomografía de coherencia óptica de dominio espectral, o SD-OCT para abreviar, y angiografía con fluoresceína, proporciona un medio para seguir la proliferación y regresión de CNV. Y, por lo tanto, evaluar la eficacia y la evolución temporal de las nuevas intervenciones farmacéuticas.

Los avances recientes en el procesamiento de imágenes permiten, además, la segmentación automatizada para la medición del grosor de la retina, proporcionando una metodología libre de sesgos del investigador para evaluar la presencia de edema. En este artículo, discutiremos la utilidad del nuevo software InVivoVue Diver de Leica Microsystems para la segmentación automatizada de capas de retina en el modelo CNV de ratón. Por último, discutiremos cómo el análisis histológico de los montajes completos de la retina puede complementar la imagen longitudinal in vivo en este modelo.

Se aplica una sola gota de tropicamida en cada ojo para la dilatación pupilar. Posteriormente, el animal se coloca suavemente en la etapa de alineación de roedores. El ratón se ajusta para exponer el ojo y se asegura con el soporte para la nariz y un trozo de cinta de laboratorio que se coloca suavemente sobre la parte posterior.

A continuación, se aplica una gota de lubricante sobre el ojo para hidratar, y el exceso de líquido se elimina cuidadosamente con bastoncillos de papel de filtro. Por último, la platina se alinea frente al dispositivo OCT para la obtención de imágenes OCT de referencia. La tomografía de coherencia óptica de dominio espectral in vivo se realiza al inicio, antes de la aplicación del láser, para verificar la ausencia de anomalías en la retina.

Retire suavemente el ratón del soporte. Coloque una gota de Viscotears Gel en un cubreobjetos para aplanar la córnea. Oriente el ratón con la cabeza del nervio óptico en el centro y enfoque el rayo láser en el epitelio pigmentario de la retina.

Realice tres disparos con láser evitando los vasos sanguíneos de la retina en las posiciones de las cuatro, las ocho y las 12 en punto alrededor del nervio óptico. Inspeccione la firmeza del ojo después de todos los disparos con láser para detectar la ausencia de sangrado de retina. Al igual que antes, alinee el ratón en el soporte y realice una angiografía con fluoresceína y una OCT para confirmar el daño de la membrana de Bruch.

Para la angiografía con fluoresceína, primero concéntrese en las áreas quemadas con láser utilizando el modo de reflectancia infrarroja, que permite visualizar los sitios donde se administró el láser. Inyecte cuidadosamente 0,1 mililitros de sal sódica con fluoresceína al 5%, para aproximadamente 20 gramos de peso corporal del ratón sin cambiar la posición del ojo del ratón. Comience a tomar imágenes de angiografía con fluoresceína a nivel de la coroides y a nivel de la retina, aproximadamente cada 30 segundos.

Alinee el ojo para las imágenes de OCT como antes y comience a tomar imágenes. El promedio de la señal SD-OCT ayuda a visualizar mejor la morfología detallada de la retina, como se muestra en esta secuencia. Una vez que se haya realizado la imagen SD-OCT, retire con cuidado el mouse del soporte.

Aplícate lubricante para ambos ojos. En este punto, puede optar por revertir la anestesia mediante una inyección subcutánea del antagonista alfa-2 para la medetomidina, atipamezol, o esperar a que el animal se recupere de la anestesia. Repetir las imágenes SD-OCT y FA in vivo en animales anestesiados en los días de seguimiento cinco, 10 y 14.

Utilice la función de segmentación automatizada del software InVivoVue Diver para las mediciones del grosor de la retina. Para la retina sana, el grosor total de la retina se considera como el grosor de todas las capas, desde la capa de fibras nerviosas hasta el EPR. En la retina sana, la segmentación automatizada puede detectar con precisión capas individuales de la retina, como se puede ver en este ejemplo.

Cabe destacar que en los lugares donde hay presencia de CNV, la medición manual del grosor de la retina debe realizarse para cada sitio de lesión de CNV por separado. Desde la capa de fibra nerviosa hasta una línea imaginaria que pasa a través de la capa de EPR. Esta secuencia muestra el flujo de trabajo para las mediciones manuales de espesor en sitios donde hay lesiones de CNV.

La capa de fibra nerviosa se encuentra en la parte superior, la coroides en la parte inferior de la imagen. Con el ratón o el panel táctil, se determinan manualmente los bordes de la capa de fibra nerviosa y la coroides, y el software calcula automáticamente el grosor total de la retina en función de estas coordenadas. Esta figura muestra imágenes seriadas tomadas cada 20 segundos a nivel coroideo.

La primera imagen se adquirió en modo de reflectancia infrarroja. Mientras que los otros, tras la inyección intraperitoneal de fluoresceína. Las flechas blancas en la imagen uno apuntan a los sitios grabados con láser, que muestran fugas de fluoresceína en puntos de tiempo posteriores, resaltadas por las flechas blancas en la imagen 18.

Esta imagen muestra imágenes seriadas de AF adquiridas a nivel de la retina. La flecha blanca en la imagen 18 apunta a un sitio grabado con láser, que muestra una fuga de fluoresceína que aparece más rápido que las otras dos, delineadas en círculos en la imagen 18. Esta figura de resumen muestra un curso de tiempo de las imágenes SD-OCT.

Al inicio, inmediatamente después de la aplicación con láser, y los puntos de tiempo de seguimiento en los días cinco, 10 y 14. En resumen, el protocolo para la obtención de imágenes longitudinales in vivo de lesiones de NVC mediante imágenes SD-OCT y FA permite la clasificación rápida, multimodal y fiable de la patología de NVC y la presencia de edema retiniano. Gracias por su interés.