Name: Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprende a diseccionar y realizar inmunofluorescencia en cerebros adultos de Drosophila melanogaster para estudiar neuronas del cuerpo seta y fotorreceptoras. Este protocolo permite visualizar defectos morfológicos en regiones específicas del cerebro.

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Nos gustaría agradecer a Changhui Pak y Alysia Vrailas Mortimer inicialmente enseñanza SMK la técnica de disección del cerebro. También agradecemos a los miembros del grupo de lab de Ken Moberg, especialmente Chris rondas, para leer críticamente el manuscrito. Anticuerpos reconociendo Fas2 (1 4) y chaoptin (24B10) se obtuvieron del Banco de hibridoma de estudios del desarrollo. Anticuerpos 24B10 se depositó a la DSHB por Seymour Benzer y Nansi Colley24,60,61, anticuerpo 1 4 se depositó a la DSHB por Corey Goodman 22,23,56. Las poblaciones de mosca se obtuvieron desde el centro de Stock de Bloomington. También queremos agradecer al Ohio Agricultural Research y desarrollo centro (OARDC) MCIC Imaging Center, para el uso del microscopio confocal para obtener imágenes del cerebro en la Figura 4A y B. SMK es apoyado por una beca de la NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

El método de disección y visualización descrito anteriormente puede utilizarse en una amplia variedad de inmunotinción y aplicaciones en vivo. Han descrito un protocolo general de inmunotinción y han puesto de relieve una forma en la que MARCM permite visualizar la morfología axonal de neuronas del cuerpo individual de la seta. Además, estos procedimientos generales pueden utilizarse también para otras regiones del cerebro fija la proyección de imagen o adulto recién disecado cerebros48,65. En proyección de imagen puede proporcionar un enfoque más eficiente al analizar patrones de expresión de enhancer trampas, genes del reportero o imitador líneas66, por ejemplo. Para evitar capturar artefactos de muerte celular durante proyección de imagen viva de la GFP en el tejido no fijado, cerebros disecados en 1 x fosfato tampón salino (PBS) o HL3 media48, montados en portaobjetos de puente de 1 x PBS (o HL3) y reflejados en menos de 15-20 min cuidado deben adoptarse para eliminar tanto tráquea como sea posible del cerebro disecados antes de la proyección de imagen, ya que puede interferir con la visualización de la fluorescencia de GFP.
Mientras que condiciones de tinción para la evaluación de la morfología de las neuronas cuerpo y fotorreceptor setas están relativamente bien establecidas24,61,67, la localización de una proteína específica de interés en estas células tipos pueden requerir optimización y solución de problemas extensa. En particular, varios pasos críticos, incluyendo la dilución del anticuerpo, tampón componente concentración bloqueo y fijación, deben ser optimizados para generar los resultados más reproducibles y fiables. En primer lugar, debe determinarse la concentración óptima del anticuerpo primario. Aunque anticuerpos disponibles en el mercado suelen tienen una dilución sugerida (y a menudo inicialmente empezamos por esa concentración), estos valores rara vez determinados empíricamente en los tejidos de la Drosophila . Por lo tanto, probando una serie de diluciones del anticuerpo primario que gama por encima y por debajo de la propuesta inicial del fabricante a menudo resulta en manchas más específica. Mientras que la dilución del anticuerpo primario puede tener un efecto significativo en la coloración de precisión y debe determinarse precisamente, se incuban los cerebros de la época en que contiene el anticuerpo primario soluciones pueden variar considerablemente con poco efecto sobre el resultado global. Por ejemplo, hemos observado resultados similares cuando incubando diseccionado cerebros con el anticuerpo primario Fas2 anticuerpo para dos, tres o incluso cuatro días a 4 ° C. Aunque recomendamos al menos dos noches, también hemos incubado cerebros en la solución de anticuerpo primario para una sola noche y obtuvo tinción reproducible. Lo importante, limitando la cantidad de tiempo que los cerebros se incuban en el anticuerpo secundario a 3 h a temperatura ambiente (o una noche a 4 ° C) permite a fijación de límite no específica de anticuerpos secundarios tejido cerebral.
En segundo lugar, puede ser necesario utilizar reactivos adicionales de "bloqueo" para eliminar señales de fondo no deseados. Las opciones incluyen aumento de la concentración de NGS a ~ 10%, agregar 1-10% albúmina de suero bovino (BSA) al bloqueo y primario y secundario soluciones de anticuerpos, o la adsorción de anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C con Drosophila embriones (véase de referencia68, sección 2.9, paso 3).
Mientras que hemos escrito el anterior protocolo usando RTP como el búfer sugerido para la fijación de todos, colada y pasos de incubación de anticuerpos, fijación del tejido en otros búferes (como PLP y PEM, indicados en la Tabla de materiales) puede resultar en diferencias profundas en intensidad de la señal. Por ejemplo, estudios anteriores han demostrado que la ciclina E es indetectable en los discos imaginales larvas cuando los tejidos se fijan en paraformaldehído al 4% de tradicional diluido en PBS, pero es claramente visible cuando los tejidos se fijan en tampón de PLP (Ken Moberg, personal comunicación y referencia69). Además de los cambios en el búfer de componentes, alterando el tiempo y la temperatura de fijación del tejido también significativamente puede afectar inmunofluorescente tinción y puede determinarse empíricamente si es necesario. En general, tiempo de fijación debe ser lo suficientemente largos para permitir la reticulación suficiente de componentes celulares y mantenimiento a largo plazo de morfología general celular estando limitado lo suficiente para evitar la sobre-reticulación y "enterrar" de epítopes de la proteína. Por lo tanto, cuando inicialmente optimizar condiciones de tinción para un anticuerpo primario recién adquirida, generalmente limitar el tiempo de fijación para aproximadamente 20 minutos y a menudo va a arreglar los tejidos a temperaturas más frías.
Varios controles deben incluirse en cualquier experimento de inmunofluorescencia para investigar la especificidad de los anticuerpos primarios y secundarios, así como el efecto de los transgenes/genética en el fenotipo observado. Para comprobar si el anticuerpo primario se utiliza específicamente reconoce la proteína de interés, tejido de moscas que carecen de esta proteína o tejido overexpressing la proteína debe ser incluido como controles. También se pueden incluir la adición de exceso proteína purificada para determinar si el anticuerpo primario reconoce otros epítopes en el cerebro de mosca. Por último, cualquier señal fluorescente cuando se omiten los anticuerpos primarios representa el nivel de fijación no específica de los anticuerpos secundarios seleccionados.
También deben incluir varios controles importantes para evaluar la contribución de la genética o la presencia de los transgenes a la intensidad de la tinción o morfología neuronal. Por ejemplo, las moscas utilizadas en el experimento MARCM en la figura 5 contienen múltiples transgenes (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, tina &#62; GAL80 y OK107-GAL4), cada uno de los cuales debe ser analizado por separado para efectos en la morfología del cuerpo de la seta. En una morfología de cuerpo mínimo, seta de las moscas que contengan OK107-GAL4 y UAS-CD8-GFP debe analizarse. También puede ser necesario evaluar el efecto del choque del calor y producción de recombinase de Flp en el desarrollo del cuerpo de la seta analizando vuela que contiene hsFLP y FRT82B. Aunque MARCM puede proporcionar la penetración importante en si una determinada proteína controla autónomamente la Guía axonal, el número de controles necesarios para realizar con precisión esta conclusión puede ser una menor limitación de esta técnica. En los experimentos menos complicados, controles similares también son aplicables. Por ejemplo, tomar un experimento donde el sistema de GAL4/UAS se está utilizando en combinación con un transgén ARNi a precipitación expresión de una proteína de interés en todas las neuronas. En este experimento, por lo menos dos transgenes estará presentes: un conductor GAL4 pan-neuronal, elav-GAL4, como el transgén UAS-ARNi . La morfología de las neuronas del cuerpo de la seta de moscas que contiene cada uno de estos transgenes solo debe investigarse además de la condición experimental donde moscas albergan tanto los transgenes en la mosca de la misma.
Finalmente, para determinar si la proteína de interés se expresa en las neuronas del cuerpo de la seta es generalmente necesario cerebros mancha Co con anticuerpos para Fas2. Por otra parte, proteínas fluorescentes como GFP y RFP la membrana destino CD8-GFP también puede expresarse utilizando el sistema de GAL4/UAS y utilizado en combinación con anticuerpos reconocer la proteína de interés. Desde Fas2 sólo reconoce los axones fasciculados que forman los lóbulos α y β del cuerpo de la seta, el uso de GAL4-conducido, unida a la membrana CD8-GFP ha sido especialmente útil para marcar las neuronas del cuerpo de la seta.
Defectos en la Guía axonal a menudo no son 100% penetrante y cerebro incluso del mismo genotipo puede mostrar cierta variabilidad. Por lo tanto, cuando analizando nuevamente genera alelos del mutante para defectos en el cuerpo de la seta o pathfinding fotorreceptor, debería utilizarse una combinación de alelos diferentes y enfoques. Mayoría de los estudios en la literatura utiliza varios métodos para investigar si una proteína desempeña un papel autónomo de la célula en el control de Guía axonal: i) análisis de pathfinding defectos homocigóticos moscas nulas (preferentemente utilizando diferentes nualelos de ll), ii) análisis de pathfinding defectos de moscas que carecen de la proteína de interés sólo en las neuronas (generalmente vía RNAi), iii) análisis MARCM de pathfinding defectos y iv) rescate de experimentos donde el gen es volver a expresado en las neuronas de homocigotos nulos vuela. Idealmente, deben analizarse varios docena cerebros por genotipo por defectos en la morfología neuronal.
Aunque el protocolo descrito aquí sobre todo se centra en localización inmunofluorescente de proteínas dentro del tejido fijo, se están desarrollando varias futuras aplicaciones de esta técnica al tejido fino del cerebro en imagen. Una vez que los cerebros se disecan (generalmente en medios de cultivo celular), pueden entonces ser cultivadas durante varios días a 25 ° C. Estos métodos de cultivo ex vivo se están desarrollando con el fin de investigar una amplia variedad de procesos biológicos, como la actividad de la proteína que promueve la regeneración del axón siguiendo lesión70,71, intracelular señalización dinámica72y73de desarrollo neuronal.

Aunque el sistema nervioso de Drosophila es menor que la de los seres humanos y roedores, su complejidad proporciona un modelo potente y accesible para entender mejor sus equivalentes vertebrados. En muchos casos, los genomas de vertebrados y moscas codifican proteínas muy similares que determinan los mecanismos de desarrollo del sistema nervioso. De hecho, muchos de los genes necesarios para el desarrollo neuronal en vertebrados han ortólogos en moscas, incluyendo aquellos involucrados en vías de señalización patrones de control, la neurogénesis y Guía axonal1,2,3 ,4,5. Por ejemplo, netrin es un ligando para la Guía axonal en mamíferos y D. melanogaster6,7,8. Mientras netrin fue originalmente aislado de chick embrionario cerebro tejido6, estudios posteriores han revelado que netrin desempeña un papel conservado durante el desarrollo del embrionario sistema nervioso central (SNC) en Drosophila8. Otros estudios han utilizado pantallas genéticas en el embrión de Drosophila CNS para identificar conservados ligandos y receptores para pathfinding en tanto en Drosophila como en vertebrados9.
Mientras que la mosca embrionaria del CNS se ha utilizado ampliamente en el pasado para identificar ligandos, receptores y proteínas de señalización intracelulares necesarias para la Guía axonal8,9, el trabajo reciente ha investigado las formas en que muchos de Estas proteínas también controlan las decisiones pathfinding durante etapas posteriores del desarrollo. Específicamente, investigación del cuerpo de la seta (MB) y desarrollo de neuronas fotorreceptoras retinianas (figura 1) ha proporcionado información sobre los mecanismos pathfinding control, formación de sinapsis, axón poda y otros aspectos del neuronal desarrollo10,11,12,13,14,15,16,17. Las neuronas fotorreceptoras conectan la retina de la mosca a las regiones del cerebro adulto llamada la lámina y médula y son fundamental para transmitir información visual al cerebro (revisado por18,19), mientras que las neuronas del cuerpo de la seta centralmente localizado en el cerebro de mosca y son necesarios para el aprendizaje y la memoria de20,21. Las neuronas fotorreceptores y las neuronas intrínsecas de los cuerpos de hongos, llamadas células de Kenyon, utilizan mecanismos evolutivamente conservado Guía axonal difusible y dependientes del contacto para encontrar sus blancos postsinápticos. Además de ser visible en moscas adultas, fotorreceptores y neuronas MB pueden también ser directamente visualizadas en larvas y pupas con anticuerpos o reportero genes22,23,24,25. La capacidad de visualizar fácilmente estos dos conjuntos de neuronas en diferentes momentos del desarrollo ha promovido su uso como modelos excelentes para muchos aspectos del desarrollo neuronal.
Además de ser utilizado como un modelo para entender los mecanismos del desarrollo normal del sistema nervioso, estudios recientes han demostrado que moscas también sirven como modelos precisos de una gran variedad de enfermedades humanas, incluyendo el síndrome de X frágil (FXS)26 ,29,30,31de discapacidad intelectual (di)27,28,y otros32. Por ejemplo, para estudiar la función molecular de ZC3H14, un gen recientemente vinculado a discapacidad intelectual humano, hemos creado un modelo de mosca de ID con un alelo nulo de la mosca ZC3H14 ortólogo, llamado Nab230. Moscas que carecen Nab2 tienen discapacidad severa de la memoria y poly(A) colas, recapitulando lo que se observa en pacientes humanos o paciente derivado célula líneas33,34. Lo importante, moscas que carecen Nab2 también mostrarán defectos de morfología cerebral grave en sus cuerpos seta adultos34, similar a lo que se observa en moscas que carecen el gene del síndrome de FXS, FMR135. Por lo tanto, moscas pueden servir como un organismo modelo importante para estudiar el desarrollo normal del cerebro y enfermedades que lo interrumpen.
Por último, la accesibilidad de métodos de alto rendimiento para controlar el comportamiento, combinado con la amplia gama de herramientas genéticas disponibles, hacer Drosophila , un organismo modelo de elección para la identificación de las regiones del cerebro que controlan los comportamientos complejos, tales como aprendizaje y memoria, sueño, cortejo, sed y otros36,37,38,39. Una herramienta especialmente útil que está en el centro de "caja de herramientas" de un genetista mosca es el sistema de GAL4/UAS (figura 2). Este sistema40,41 utiliza la expresión específica de tejido del activador transcripcional Gal4 para aumentar la expresión de genes o transgenes aguas abajo de una secuencia de activación ascendente (UAS). Modificaciones de este sistema han permitido a los investigadores, por ejemplo, precisamente el control de la excitabilidad de las neuronas específicas42,43, sobrexpresan o precipitación de genes específicos de interés44, 45, analizar la dinámica de calcio en tiempo real en vivo46y expresar genes del reportero para marcar linajes neuronal41. La combinación del sistema de GAL4/UAS con la recombinación mitótica también permitida la creación del análisis de mosaico con un marcador de célula Repressible (MARCM) sistema12,47. MARCM se ha utilizado extensivamente en seguimiento de neurona única para identificar los componentes celulares de señalización necesarios para la Guía axonal12,47. Aunque estas y otras técnicas han proporcionado una cantidad de información valiosa sobre los mecanismos celulares necesarios para la función del sistema nervioso, la mayoría requieren que el cerebro de la Drosophila primero se diseca; eliminar del cerebro es necesaria para mantener patrones de morfología y conexión correcta del cerebro entre las regiones del cerebro. El siguiente protocolo utiliza neuronas cuerpo y fotorreceptor hongos comopoblaciones neuronales ejemplo como él le guía a través de la disección y cerebros inmunofluorescente de la coloración del adulto de Drosophila .

<table><tbody><tr><td>Pinzas de microdisección/pinzas</td><td>Ted Pella</td><td>505-NM</td><td></td></tr><tr><td>Placas Sylgard</td><td>Living Systems Instrumentación</td><td>DD-50-S-BLK</td><td>Disponible en amazon.com</td></tr><tr><td>Fas2</td> Estudios del desarrollo de anticuerpos <td>Banco de hibridomas</td><td>1D4</td><td></td></tr><tr><td>Chaoptin</td><td>Estudios del desarrollo de anticuerpos Hibridoma Bank</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP Aves de anticuerpos</td><td> Laboratorio</td><td>GFP-1010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 cabra anti-ratón</td><td>anticuerpo secundario ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 cabra anti-pollo anticuerpo secundario</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 cabra anti-ratón anti-anti-ratón</td><td>anticuerpo ThermoFisher</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehído</td><td>Microscopio electrónico Servicios</td><td>RT15713</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Portaobjetos</td><td>ThermoFisher</td><td>99-910-01</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>ThermoFisher</td><td>12-553-454</td><td></td></tr><tr><td>Na Tampón de fosfato monobásico</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Na tampón de fosfato dibásico</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>esmalte de uñas</td><td>Electron Microscope Services (EMS)</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>microscopio estereoscópico</td><td>Leica S6D con fuente de luz LED KL300 Plato</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 9 pocillos (placa puntual)</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>nutator/balancín</td><td>Fisher</td><td>22-363-152 o 88-861-041</td><td></td></tr><tr><td>plato de 35 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Fisher</td><td>50-366-794</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Potential Fixation Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTN Buffers</td><td></td><td></td><td>0,1 M de NaFosfato, pH 7,2, 0,1% Triton-X-100, Por lo general, componen 0,5 L de tampón de NaFosfato 0,1M y alícuota 50 ml a la vez según sea necesario</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> PLP <td>2% de paraformaldehído, 0,01M NaI04, 0,075M de lisina, 0,037M NaPO4, pH 7,2, Disuelva 0,36 g de lisina en 10 ml de H2O + 7,5 ml 0,1 M de NaH2PO4 pH 7,2 + 2,5 ml 0,1 M de Na2HPO4 en hielo. Inmediatamente antes de usar, mezcle 15 ml de esta solución de lisina tamponada con 50 mg de NaIO4 (periodato de sodio) + 2 ml de paraformaldehído de alto grado (EMS) al 20% + 3 ml de</td></tr><tr><td>tampón</td><td></td><td></td> H2O PEM <td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, Este tampón se puede hacer convenientemente como un stock 2x y diluir con un 8% de paraformaldehído (PFA) para dar una concentración final de 4% de PFA</td></tr><tr><td><fuerte>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Fly Stocks disponibles en Bloomington</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elav (c155)-GAL4</td><td></td><td>BL458</td><td>Pan-neuronal GAL4</td></tr><tr><td>driver w*;;; Controlador OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 854</td><td>GAL4 para todas las neuronas del cuerpo de hongo (la inserción de OK107-GAL4 está en el cromosoma 4)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td><td></td><td>BL 7362</td><td>Controlador GAL4 para lóbulos alfa y beta (en el 2º cromosoma)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64305</td><td>Controlador GAL4 para lóbulos alfa y beta, también contiene UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*; 201Y-GAL4</td><td></td><td>BL 4440</td><td>Controlador GAL4 principalmente para los lóbulos gamma del cuerpo del hongo (en el cromosoma 2)</td></tr> <tr><td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64296</td><td>Controlador GAL4 para lóbulos gamma del cuerpo del hongo, también contiene UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO</td><td></td><td>BL 5145</td><td>MARCM stock, contiene sitio FRT y GAL80 en el 2º cromosoma</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL5146</td><td>MARCM stock, contiene hsFLP, GAL4 panneuronal y CD8-GFP en el cromosoma X</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;; FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1); OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44408</td><td>Culata MARCM para voltear el 3er cromosoma</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; FRT40A, Tina>GAL80; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL44406</td><td>culata MARCM para voltear el 2º cromosoma</td></tr><tr><td>w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44407</td><td>Culata MARCM para voltear el cromosoma X</td></tr><tr><td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td><td></td><td>BL 5137</td><td>GFP marca la superficie celular (CD8 es una proteína transmembrana)</td></tr><tr><td>y(1), w*; FRTG13, culata UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 5139</td><td>MARCM, contiene sitio FRT y CD8-GFP en el 2º cromosoma</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td><td></td><td>BL 28832</td><td>MARCM stock, contiene hsFLP y CD8-GFP en el cromosoma X</td></tr><tr><td>w*; FRTG13, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5140</td><td>MARCM stock, contiene sitio FRT y GAL80 en el 2º cromosoma</td></tr><tr><td>y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5135</td><td>MARCM stock, contiene sitio FRT y GAL80 en el 3er cromosoma</td></tr></tbody></table>

disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de drosophila melanogaster

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Desarrollo del sistema nervioso consiste en una serie secuencial de acontecimientos que son coordinados por varias vías de señalización y redes reguladoras. Muchas de las proteínas implicadas en estas vías son evolutivamente conservados entre los mamíferos y otros eucariotas, tales como la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, sugiriendo que existen principios de organización similares durante el desarrollo de estos organismos. Lo importante, Drosophila se ha utilizado ampliamente para identificar los mecanismos celulares y moleculares de regulación de procesos que se requieren en los mamíferos incluyendo la neurogénesis, diferenciación, Guía axonal y sinaptogénesis. Moscas también se han utilizado con éxito para modelar una variedad de enfermedades del desarrollo neurológico humano. Aquí se describe un protocolo para la microdisección paso a paso, fijación y localización inmunofluorescente de proteínas en el cerebro adulto de Drosophila . Este protocolo se centra en dos poblaciones neuronales de ejemplo, las neuronas del cuerpo de la seta y fotorreceptores retinianos e incluye pasos opcionales para rastrear las neuronas cuerpo seta individual mediante análisis de mosaico con una técnica de marcador celular Repressible (MARCM). Ejemplo datos de tipo salvaje y mutantes cerebros se presentan junto con una breve descripción de un criterio de puntuación para los defectos de Guía axonal. Si bien este protocolo destaca dos anticuerpos bien establecidos para la investigación de la morfología del cuerpo de la seta y las neuronas fotorreceptoras, otras regiones del cerebro de Drosophila y la localización de proteínas dentro de otras regiones del cerebro también puede ser investigados mediante este protocolo.

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

El objetivo general de este protocolo de disección de cerebro de Drosophila es obtener cerebros intactos de moscas adultas que puedan utilizarse en una amplia gama de aplicaciones, como inmunofluorescencia, localización de proteínas marcadas con GFP y experimentos de cultivo ex vivo. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en los campos de la biología del desarrollo y la neurociencia, tales como los roles de proteínas específicas y vías de señalización, y el establecimiento de patrones de conectividad neuronal durante el desarrollo del cerebro. La principal ventaja de esta técnica es que, una vez dominada, proporciona un método rápido y eficaz para identificar inmunológicamente defectos morfológicos en regiones específicas del cerebro adulto.Este procedimiento puede ser difícil de aprender, porque retirar el exoesqueleto de la cabeza de la mosca requiere una gran dosis de cuidado y práctica. Sus movimientos deben ser lentos y deliberados, y los brazos del instrumento de disección deben estar bien sujetos para mantener la estabilidad. Es recomendable practicar primero con moscas de ojos rojos y luego con moscas de ojos blancos antes de diseccionar los genotipos de interés para los experimentos reales.Para prepararse para la disección, coloque las moscas de interés anestesiadas sobre una placa metálica fría o en una placa de Petri colocada sobre hielo. Alternativamente, use una placa para moscas que emita dióxido de carbono. A continuación, coloque una pequeña cantidad de PTN en el centro del recipiente de disección para crear una burbuja de PTN.Luego, bajo un microscopio estereoscópico, llene el campo de visión con la burbuja de PTN bajo iluminación uniforme. Ahora, manipule las moscas para que queden boca arriba y transfiera una por el abdomen al PTN. Sumerja completamente al animal en el PTN y realice toda la disección sumergida en PTN.Con un segundo par de pinzas, sujete el probóscide y tire de la cabeza para separarla del cuerpo. A veces, el probóscide se desprenderá, pero la cabeza permanecerá unida al cuerpo. Si esto ocurre, tome el borde medial de una retina y aplique una fuerza lateral para retirar la cabeza.Deseche el abdomen y el tórax. Es fundamental mantener la cabeza en el PTN durante este paso. Las conexiones desde el cerebro central hasta la CVM no pueden analizarse claramente mediante este método.A continuación, sujete el borde medial de la retina izquierda en el borde del orificio central en la cutícula y tire lentamente de las pinzas directamente en direcciones opuestas para evitar el desgarro del lóbulo óptico, que es la estructura opaca cubierta por traqueas blancas y filamentosas. A medida que la retina se disocia, habrá una ligera disminución de la tensión. Con el fin de evitar que el cerebro se rompa, es fundamentalmente importante sujetar el borde medial de cada ojo y separar muy lentamente las pinzas.Moverse demasiado rápido puede provocar una morfología cerebral alterada o daño al tejido cerebral. Como se muestra aquí, sujete la cutícula con cada par de pinzas y sepárelas lentamente en direcciones opuestas. Si se realiza correctamente, la cutícula se separará del tejido cerebral, dejando el cerebro intacto.Se necesitan pinzas muy afiladas para este paso. A continuación, retire cuidadosamente la cutícula circundante pedazo por pedazo. Al eliminar la cutícula adherida con firmeza, puede ser útil asegurar el cerebro sosteniendo el resto del VNC para evitar aplastarlo.Finalmente, use una pipeta P200 para transferir los cerebros diseccionados a un pocillo de una placa lleno con PTN para la fijación y la inmunotinción. Bajo el microscopio, utilice una pipeta P200 para transferir 10 a 15 cerebros diseccionados del mismo genotipo a un tubo microcentrífugo de 0,5 mililitros lleno con paraformaldehído al 4% diluido en PTN. A continuación, incube los cerebros durante 20 minutos con agitación lenta a temperatura ambiente.Tras la fijación, deje que los cerebros se sedimenten en el fondo del tubo y luego retire el fijador. A continuación, realice dos lavados rápidos con 500 microlitros de PTN por lavado. Cambie el PTN tan pronto como los cerebros se sedimenten en el tubo.A continuación, realice tres lavados largos con PTN utilizando agitación suave a temperatura ambiente. Tras estos lavados, los cerebros pueden almacenarse durante la noche a cuatro grados Celsius en PTN. Después de eliminar el último lavado con PTN, incube los cerebros en 0.5 mililitros de solución bloqueante durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente y con agitación suave.Después de eliminar la solución bloqueante, agregue los anticuerpos primarios diluidos en la solución bloqueante e incube los cerebros a cuatro grados Celsius durante dos días con agitación suave. Retire el anticuerpo primario utilizando el régimen de lavado con PTN de cinco lavados. Luego, aplique los anticuerpos secundarios.Deje que estos anticuerpos incuben con los tejidos durante tres horas a temperatura ambiente, protegidos de la luz y con agitación. Después de incubar los cerebros en la solución de anticuerpo secundario, aplique el régimen de lavado con PTN. Cubra las muestras con papel de aluminio tras cada lavado y finalice eliminando la mayor cantidad posible de tampón.A continuación, agregue 75 microlitros de medio de montaje fluorescente con agente anti-fade, y pase los cerebros y el medio dentro y fuera de la punta de pipeta una sola vez. El tubo puede envolverse entonces con papel de aluminio y almacenarse a cuatro grados Celsius durante varios días, aunque lo ideal es proceder inmediatamente con el montaje. Para montar los cerebros, construya un portaobjetos puente.Coloque dos cubreobjetos base aproximadamente a 1 centímetro de distancia sobre un portaobjetos con carga positiva. Asegúrese de que el lado con carga positiva esté hacia arriba. Luego, adhiera los cubreobjetos al portaobjetos con esmalte de uñas y deje que el esmalte se seque completamente antes de continuar.A continuación, coloque el portaobjetos bajo un microscopio estereoscópico y pipetee los cerebros y el medio al espacio entre las cubetas. Asegúrese de ajustar la iluminación para mejorar la visualización de los cerebros. A continuación, aspire el medio de montaje sobrante del portaobjetos, teniendo cuidado de evitar los cerebros.A continuación, retire mediante absorción el medio de montaje excedente restante. Esto permitirá posicionar los cerebros con mayor precisión. Ahora, utilizando pinzas, coloque los cerebros en un patrón de cuadrícula, con sus lóbulos antenales orientados hacia arriba.Luego, coloque un cubreobjetos sobre los cerebros y use esmalte de uñas para sellar los bordes del cubreobjetos superior que están unidos a los cubreobjetos base. Ahora, cargue la cavidad central con medio de montaje fresco gota a gota, permitiendo que el medio sea arrastrado debajo del cubreobjetos por acción capilar. Cuando la cavidad esté llena, séllela completamente utilizando esmalte de uñas transparente.El método descrito puede utilizarse para visualizar casi cualquier estructura dentro del cerebro adulto, incluyendo los cuerpos fungiformes. Esta región del cerebro es necesaria para el aprendizaje y la memoria. Los cuerpos fungiformes pueden visualizarse fácilmente mediante anticuerpos que reconocen la proteína fasciculina 2.Esta proteína se expresa altamente en los lóbulos alfa y beta, así como en el cuerpo elipsoidal ubicado centralmente. Esta técnica ha permitido la identificación de múltiples procesos celulares necesarios para la correcta guía axonal de las neuronas del cuerpo de la seta. La alteración de estos procesos provoca una diversidad de fenotipos mutantes, como proyecciones axonales inapropiadas a través de la región de la línea media del cerebro y lóbulos alfa ausentes.Estos fenotipos mutantes suelen tener penetrancia incompleta y, por lo tanto, requieren el examen de múltiples cerebros. Con el fin de examinar el papel autónomo de una proteína en la guía axonal, también se puede utilizar la técnica de Markham para visualizar las decisiones de orientación axonal de neuronas individuales mutantes o de tipo salvaje positivas para GFP en un fondo no fluorescente de tipo salvaje. El método descrito aquí permite la visualización fiable y reproducible de prácticamente cualquier región del cerebro adulto de Drosophila.Aquí, nos centramos en las neuronas del cuerpo de la seta. En la versión textual de este protocolo, también hemos demostrado la visualización de los lóbulos ópticos. Otros estudios han utilizado técnicas similares para visualizar la pars intercerebralis, las neuronas reloj y las neuronas proyectoras del lóbulo antenal, entre muchas otras.Una vez dominada, cada cerebro puede disecarse en 3 a 5 minutos, si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar estabilizar los brazos cerca del microscopio. También es fundamental moverse lentamente y retirar pequeños fragmentos de cutícula uno a la vez.Moverse demasiado rápidamente podría causar daños no deseados al tejido cerebral subyacente. Además de utilizar cerebros diseccionados para experimentos de microscopía basados en inmunofluorescencia, el tejido cerebral también puede emplearse para otros experimentos adicionales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este artículo se muestra cómo disecar el sistema nervioso central del tercer estadio las larvas de Drosophila.

La disección del sistema nervioso central de larvas de Drosophila melanogaster

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

La disección e inmunohistoquímica de larva, pupa y adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

Este video describe un método para montar cerebros intactos de moscas adultas debajo de un portaobjetos de puente y muestra el protocolo realizado en cerebros inmunoteñidos para microscopía fluorescente.

Montaje de cerebros adultos de Drosophila: un método para preparar portaobjetos para la obtención de imágenes confocales

Este video describe cómo diseccionar y aislar el cerebro adulto de Drosophila, un procedimiento necesario para visualizar el órgano, que de otro modo estaría oscurecido por la cutícula, el ojo y el tejido traqueal. El protocolo de ejemplo muestra una demostración detallada que produce preparaciones de alta calidad que se pueden utilizar para la inmunotinción y los métodos de imagen en la neurobiología de Drosophila.

Drosophila Disección del cerebro de adultos: un método en neurobiología de moscas

Este video muestra un protocolo detallado de inmunotinción para visualizar defectos fenotípicos en los cuerpos de hongos de cerebros de Drosophila mutantes. El protocolo consiste en el uso de anticuerpos contra Fas2, una proteína implicada en la guía axonal que facilita el correcto desarrollo morfológico y funcional del cuerpo del hongo.

Visualización de neuronas del cuerpo de hongo en cerebros de Drosophila mediante inmunotinción

Las estructuras adultas de Drosophila se derivan de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. El análisis de estos discos proporciona información sobre muchos procesos de desarrollo, incluida la determinación de tejidos, el establecimiento de límites de compartimentos, la proliferación celular, la especificación del destino celular y la polaridad celular plana. Este protocolo se utiliza para preparar discos imaginales para microscopía óptica/fluorescente.

La disección y la inmunotinción de imaginal discos de Drosophila melanogaster

El adulto de Drosophila cerebro es un sistema valioso para el estudio de los circuitos neuronales, las funciones cerebrales superiores, y los trastornos complejos. Un método eficaz para diseccionar el tejido cerebral entera de la cabeza pequeña mosca que facilitará los estudios basados ​​en el cerebro. Aquí se describe un protocolo de disección simple, de un solo paso de cerebros adultos con una morfología bien conservada.

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em&gt; Drosophila</emLos cerebros&gt;

Aquí, proporcionamos protocolos para realizar tres ensayos simples de degeneración de axón inducida por lesiones (muerte por axón) en Drosophila melanogaster para evaluar la preservación morfológica y funcional de los axones cortados y sus sinapsis.

Evaluación morfológica y funcional de los axónyis y sus sinapsis durante la muerte de Axon en Drosophila melanogaster

Este protocolo describe tres pasos para preparar los lóbulos ópticos de larvas y adultos de Drosophila para la obtención de imágenes: 1) disecciones cerebrales, 2) inmunohistoquímica y 3) montaje. Se hace hincapié en el paso 3, ya que se requieren distintas orientaciones de montaje para visualizar estructuras específicas de lóbulos ópticos.

Disección, inmunohistoquímica y montaje de cerebros de larvas y adultos de Drosophila para la visualización del lóbulo óptico

Este estudio presenta un protocolo simplificado para el procesamiento de tejidos que involucra decapitación, fijación, criosección, tinción de fluorescencia, inmunotinción e imágenes, que puede extenderse a imágenes confocales y multifotónicas. El método mantiene una eficacia comparable a las disecciones complejas, evitando la necesidad de habilidades motoras avanzadas. El análisis cuantitativo de imágenes ofrece un amplio potencial de investigación.

Criosección directa de cabezas de Drosophila para mejorar la tinción de fluorescencia cerebral y la inmunotinción

Aprende a diseccionar y realizar inmunofluorescencia en cerebros adultos de Drosophila melanogaster para estudiar neuronas del cuerpo seta y fotorreceptoras. Este protocolo permite visualizar defectos morfológicos en regiones específicas del cerebro.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

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