Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

El objetivo general de este protocolo de disección del cerebro de Drosophila es obtener cerebros intactos de moscas adultas que puedan utilizarse en una amplia gama de aplicaciones, como la inmunofluorescencia, la localización de proteínas marcadas con GFP y los experimentos de cultivo ex vivo. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en los campos de la biología del desarrollo y la neurociencia, como las funciones de proteínas específicas y las vías de señalización y el establecimiento de patrones de conectividad neuronal durante el desarrollo del cerebro. La principal ventaja de esta técnica es que, una vez dominada, proporciona un método rápido y eficaz para identificar inmunológicamente defectos morfológicos en regiones específicas del cerebro adulto.

Este procedimiento puede ser difícil de aprender, porque quitar el exoesqueleto de la cabeza de la mosca puede requerir mucho cuidado y práctica. Sus movimientos deben ser lentos y deliberados, y los brazos del disector deben estar bien apoyados para mantenerse firme. Es una buena idea practicar con moscas de ojos rojos y luego con moscas de ojos blancos antes de diseccionar genotipos de interés para experimentos reales.

Para preparar la disección, coloque las moscas anestesiadas de interés en una almohadilla de metal fría o en una placa de Petri colocada sobre hielo. Alternativamente, use una almohadilla para moscas que emita dióxido de carbono. A continuación, coloque una pequeña cantidad de PTN en el centro de la placa de disección para crear una burbuja de PTN.

Luego, bajo un microscopio estereoscópico, llene el campo de visión con la burbuja PTN bajo iluminación uniforme. Ahora, manipule las moscas para que queden boca arriba y transfiera una por el abdomen a la PTN. Sumerja completamente al animal en el PTN y realice toda la disección sumergido en el PTN.

Con un segundo par de pinzas, agarre la probóscide y retire la cabeza del cuerpo. Ocasionalmente, se extirpará la probóscide, pero la cabeza permanecerá unida al cuerpo. Si esto ocurre, agarre el borde medial de una retina y aplique fuerza lateral para quitar la cabeza.

Deseche el abdomen y el tórax. Es fundamental mantener la cabeza en el PTN durante este paso. Claramente, las conexiones desde el cerebro central hasta la VNC no se pueden analizar con este método.

A continuación, agarre el borde medial de la retina izquierda en el borde del orificio central de la cutícula y separe lentamente las pinzas directamente entre sí para evitar el desgarro del lóbulo óptico, que es la estructura opaca cubierta por una tráquea blanca y fibrosa. A medida que la retina se disocia, habrá una ligera disminución de la tensión. Para evitar que el cerebro se desgarre, es de vital importancia agarrar el borde medial de cada ojo y separar muy lentamente las pinzas.

Moverse demasiado rápido puede provocar una alteración de la morfología cerebral o daños en el tejido cerebral. Como se muestra aquí, agarre la cutícula con cada par de pinzas y tire de ellas muy lentamente en direcciones opuestas. Si se hace correctamente, la cutícula debe separarse del tejido cerebral, dejando el cerebro intacto.

Se necesitan pinzas muy afiladas para este paso. A continuación, retire con cuidado la cutícula circundante pieza por pieza. Al eliminar la cutícula obstinadamente adherida, puede ayudar a asegurar el cerebro agarrando el VNC restante para evitar aplastar el cerebro.

Por último, utilice una pipeta P200 para transferir los cerebros disecados a un pocillo de una placa llena de PTN para su fijación e inmunotinción. Bajo el microscopio, use una pipeta P200 para transferir de 10 a 15 cerebros disecados del mismo genotipo a un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros lleno de paraformaldehído al 4% diluido en PTN. Luego, incube los cerebros durante 20 minutos con balanceo lento a temperatura ambiente.

Después de la fijación, deje que los cerebros se asienten en el fondo del tubo, luego retire el fijador. A continuación, realice dos lavados rápidos con 500 microlitros de PTN por lavado. Intercambie el PTN tan pronto como el cerebro se asiente en el tubo.

A continuación, realice tres lavados largos con PTN utilizando una agitación suave a temperatura ambiente. Después de estos lavados, los cerebros pueden almacenarse durante la noche a cuatro grados centígrados en PTN. Después de retirar el último lavado de PTN, incubar los sesos en 0,5 mililitros de solución bloqueante durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente y con una agitación suave.

Después de retirar la solución de bloqueo, agregue los anticuerpos primarios diluidos en la solución de bloqueo e incube los cerebros a cuatro grados centígrados durante dos días con una agitación suave. Elimine el anticuerpo primario utilizando el régimen de lavado PTN de cinco lavados. Y luego, aplicar los anticuerpos secundarios.

Permita que estos anticuerpos se incuben con los tejidos durante tres horas a temperatura ambiente mientras se protegen de la luz con el balanceo. Después de incubar los cerebros en la solución secundaria de anticuerpos, aplique el régimen de lavado PTN. Cubra las muestras con papel de aluminio después de cada lavado y termine eliminando la mayor cantidad de tampón posible.

A continuación, añada 75 microlitros de medio de montaje fluorescente antidecoloración y haga fluir el cerebro y el medio dentro y fuera de la punta de la pipeta una sola vez. A continuación, el tubo puede envolverse en papel de aluminio y almacenarse a cuatro grados centígrados durante varios días, pero lo ideal es proceder directamente con el montaje. Para montar los cerebros, construye un tobogán de puente.

Coloque dos deslizadores de cubierta de base a aproximadamente 1 centímetro de distancia en un portaobjetos cargado positivamente. Asegúrese de que el lado cargado positivamente esté boca arriba. Luego, adhiera los cubreobjetos al portaobjetos con esmalte de uñas y deje que el esmalte se seque por completo antes de continuar.

A continuación, coloque el portaobjetos bajo un microscopio estereoscópico y pipetee los cerebros y el medio en el espacio entre los cubreobjetos. Asegúrese de ajustar la iluminación para mejorar la visualización de los cerebros. A continuación, aspire el medio de montaje adicional de la corredera, teniendo cuidado de evitar los cerebros.

A continuación, absorba el exceso de medios de montaje restantes. Esto permitirá que los cerebros se posicionen con mayor precisión. Ahora, usando fórceps, oriente los cerebros en un patrón de cuadrícula, con sus lóbulos antenales hacia arriba.

Luego, coloque un cubreobjetos sobre los sesos y use esmalte de uñas para sellar los bordes del cubreobjetos superior que están unidos a los cubreobjetos de la base. Ahora, cargue la cavidad central con medios de montaje nuevos gota a gota, permitiendo que los medios se extraigan debajo del deslizamiento de la cubierta por acción capilar. Cuando la cavidad esté llena, séllala completamente con esmalte de uñas transparente.

El método descrito se puede utilizar para visualizar casi cualquier estructura dentro del cerebro adulto, incluidos los cuerpos de los hongos. Esta región del cerebro es necesaria para el aprendizaje y la memoria. Los cuerpos de los hongos se pueden visualizar fácilmente utilizando anticuerpos que reconocen la proteína fasciculina 2.

Esta proteína se expresa en gran medida en los lóbulos alfa y beta, así como en el cuerpo elipsoide situado en el centro. Esta técnica ha permitido la identificación de múltiples procesos celulares necesarios para la correcta guía de los axones de las neuronas del cuerpo del hongo. La interrupción de estos procesos provoca una amplia gama de fenotipos mutantes, como la proyección inapropiada de los axones a través de la región de la línea media del cerebro y la falta de lóbulos alfa

Estos fenotipos mutantes son a menudo incompletamente penetrantes y, por lo tanto, requieren el examen de múltiples cerebros. Con el fin de examinar el papel autónomo de una proteína en la búsqueda de rutas de axones, la técnica de Markham también se puede utilizar para visualizar las decisiones de guía de los axones de neuronas mutantes o de tipo salvaje positivas para GFP individuales en un fondo de tipo salvaje no fluorescente. El método descrito aquí permite la visualización fiable y reproducible de prácticamente una región del cerebro de Drosophila adulta.

Aquí, nos centramos en las neuronas del cuerpo de los hongos. En la versión de texto de este protocolo, también hemos demostrado la visualización de los lóbulos ópticos. Otros estudios han utilizado técnicas similares para visualizar la pars intercerebralis, las neuronas reloj y las neuronas de proyección del lóbulo antenal, entre muchas otras.

Una vez dominado, cada cerebro puede ser diseccionado en 3 a 5 minutos, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar estabilizar los brazos cerca del microscopio. También es importante moverse lentamente y quitar los pequeños trozos de cutícula de uno en uno.

Moverse demasiado rápido podría causar daños no deseados en el tejido cerebral subyacente. Además de usar cerebros disecados para experimentos de microscopía basados en inmunofluorescencia, el tejido cerebral también se puede usar para experimentos adicionales.