Name: Determinación de zona óptica transversal muscular de los músculos de vuelo indirectos adultos de Drosophila Melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Aprende a cuantificar el área muscular en músculos de vuelo indirectos de Drosophila melanogaster mediante secciones transversales. Este método permite evaluar indirectamente la masa muscular y estudiar la atrofia en modelos de distrofia miotónica.

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Los autores desean agradecer a los miembros del grupo de genómica traslacional y Kathryn J Hanson para el feed-back y las mejoras de este protocolo. Este proyecto fue realizado con la beca de investigación SAF2015-64500-R, que incluye fondos europeos de Desarrollo Regional, otorgado a R.A por el Ministerio de Economia y Competitividad.

1. fijación y embebido de resina
<ol><li>Anestesiar las moscas con dióxido de carbono (CO2) o a través de hipotermia usando un bloque de hielo. Utilice un microscopio de disección (con ampliación baja para ver la marcha entera) y las tijeras para quitar las patas, alas, cabeza y la parte terminal del abdomen para facilitar la penetración del fijador. El tratamiento cuidadoso de los cadáveres es necesario en este paso para evitar la deformación del tórax. Nota: Comience con al menos 12 moscas por genotipo para asegurar un número suficiente de individuos correctamente procesados al final del procedimiento.</li>
	<li>Traslado de los cadáveres a un tubo de 1,5 mL en hielo (colocación de un máximo de 6 personas por tubo) que contiene 200 μL de solución 1. Nota: Las canales no pueden permanecer en la solución 1 durante más de 20 minutos.<ol>
<li>Solución 1, mezclar los componentes en las proporciones de volumen: ¼ paraformaldehído al 4%, glutaraldehído 8% ¼, ¼ 0,2 M de Na2HPO4 y ¼ 0,2 M NaH2PO4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 200 μL de solución 2 e incubar en hielo durante 30 minutos.<ol>
<li>Solución 2: Solución de mezcla 1 y OsO4 en una proporción de 1:1 (v/v). PRECAUCIÓN: OsO4 es extremadamente tóxico. Manipular en una campana de humos con medidas adecuadas de seguridad y disposición.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eliminar todo el líquido. Añadir 200 μL de solución 2 e incubar en hielo durante 1-2 h.</li>
	<li>Retirar la solución y deshidratan las muestras a través de una serie gradual de etanol como sigue: una vez en 30%, 50%, 70%, 90% y dos veces en etanol absoluto; 5 minutos cada uno. Añadir 1 mL de etanol para cubrir las muestras. Nota: Una vez que el tejido se coloca en etanol al 90%, los pasos posteriores pueden realizarse a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar las muestras dos veces en óxido de propileno por 10 min cada incubación. PRECAUCIÓN: El óxido de propileno es tóxico, utilizarlo en una campana de humos.</li>
	<li>Sustituir el óxido de propileno por una mezcla de 1:1 (v/v) de epoxy resina y propileno óxido e incubar a temperatura ambiente durante la noche. PRECAUCIÓN: La resina es extremadamente tóxica en estado líquido. La resina está disponible como un conjunto de cuatro componentes (A, B, C y D).<ol>
<li>Para la resina de epoxy, agregue en un vaso desechable de 54 g de resina (A), 44,5 g de catalizador (B), 2,5 g de acelerador (C) y 10 g de plastificante (D). Combinar todos los componentes de la resina en una campana de humos. Almacenar la resina en alícuotas a-20 ° C (hasta 6 meses) o a-80 ° C (varios años).</li>
		<li>Para descartar la resina, la Hornee a 70 ° C por 24 h porque resina sólida no es tóxica. Deseche todas las soluciones anteriores en el grupo de los metales pesados según los procedimientos internacionales apropiados, porque las soluciones pueden contener rastros de OsO4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vuelva a colocar la mezcla anterior con resina 100% e incubar las muestras durante 4 horas.</li>
	<li>Traslado de los cadáveres para moldes de plástico conteniendo resina nuevo (un canal en cada pozo del molde). Utilizar un palo de madera afilado o una aguja de transferencia y orientar los cadáveres en los pozos y dejar la resina para polimerizar durante la noche en un horno de Pasteur a 70 ° C. Nota: Para asegurar la orientación apropiada de los cadáveres para el posterior corte y seccionamiento, los cadáveres deben estar acostado sobre su lado largo, con la parte anterior de la canal muy cerca del borde del pozo.</li>
</ol>2. corte y seccionamiento de bloques
<ol><li>Retire los bloques de resina polimerizada de los moldes. Utilice hojas de afeitar recorte la resina, una forma trapezoidal que rodean el cadáver y dar orientación apropiada en el micrótomo. Inicio secciones todos los cadáveres después de la sutura transversal para obtener resultados comparables. Nota: La sección debe ser perpendicular al eje anteroposterior de las DLMs para cortar correctamente la muestra ( figura 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> Figura 3 . Secciones dorsoventral de toracico adulto embebido en resina de la distrofia Myotonic modelo moscas. En (A), el ajuste de la muestra no era correcto que la sección en la parte dorsal derecha de la imagen no era totalmente transversal a los músculos. Como consecuencia, los paquetes de tres del músculo en la parte superior derecha parecen más grandes que los de la izquierda. Este error daría lugar a una sobreestimación de la zona muscular. (B) sección de un bloque de resina correctamente ajustado. Barra de escala: 200 μm.
<ol><li>Corte 1.5 μm secciones gruesas con un ultramicrótomo y transferir las secciones en gotas de agua sobre diapositivas gelatinizados.<ol>
<li>Obtener las secciones del segmento mesothorax para todas las muestras obtener resultados comparables.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque las diapositivas que contienen las secciones de un bloque de calentamiento a 70-80 ° C hasta que se evapore el H2O. En este punto, se observan las muestras con el OsO4 contraste (Figura 4A).</li>
</ol>3. tinción de secciones IFM
<ol><li>Cubrir las secciones con suficiente toluidina azul de aproximadamente 30 s en el bloque de calefacción.<ol>
<li>Solución de azul de toluidina, disolver el 1% de azul de toluidina y el 1% de borax en H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjuague con H2O y deja el portaobjetos sobre una placa caliente para evaporar el agua. Repetir la tinción con toluidina azul si el contraste debe ser mejorada (Figura 4B).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> Figura 4 . Secciones dorsoventral de toracico adulto embebido en resina con diferente contraste los stainings. Ambos paneles muestran imágenes de DM1 modelo moscas alimentados con Abp1 como en la Figura 2D. (A) imagen de una sección del OsO4 contraste. (B) corte teñido con toluidina azul permite mejor visualización de los haces musculares. Barra de escala: 200 μm.
4. montaje de secciones IFM
<ol><li>Seque el portaobjetos con el bloque calefactor hasta que se evapore el H2O.</li>
	<li>Poner 1 o 2 gotas de medio de montaje en las secciones y poner en un cubreobjetos. PRECAUCIÓN: Realizar este paso en una campana de humos porque el medio de montaje es tóxico.</li>
</ol>5. adquisición de imágenes y la cuantificación del área del músculo del
<ol><li>Tomar las imágenes en baja magnificación para que todo el conjunto de músculos DLM está en foco. Normalmente usamos 10 X.<ol>
<li>Para el análisis estadístico de al menos 5 imágenes seriales por mosca y analizar por lo menos 5 moscas por grupo experimental.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione la imagen que contiene los músculos enteros (figura 5A). Revise el eje o la orientación de la sección y deseche las muestras con orientación inadecuada, lo que distorsionaría los resultados (Comparar figuras 3A / 3B distinguir entre mal y bien orientada, respectivamente).</li>
	<li>Utilice el software ImageJ para seleccionar un área (en píxeles) que contiene sólo el DLMs (figura 5A/5B). Para la comparación entre los diferentes grupos experimentales, el área de referencia a utilizarse sería siempre la mosca con los músculos más grandes. En todas las imágenes de los diferentes genotipos para comparar, seleccione un área que contiene DLMs de iguales dimensiones a la zona de referencia (figura 5B).</li>
	<li>Binarize las imágenes con el comando Image-J: Proceso/binario/hace binario y eliminar las áreas o píxeles que no corresponden a los músculos de interés (figura 5).<ol>
<li>En el caso que artefactual puntos negros aparecen en áreas distintas de músculo, borrar con el comando herramientas de dibujo y seleccione el símbolo de la goma de borrar.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> Figura 5 . Procedimiento de análisis para la determinación de área muscular de la imagen. (A) sección transversal del modelo de la distrofia miotónica tipo 1 volar el tórax con un rectángulo que contiene el DLM. (B) área seleccionada con sólo los músculos de vuelo indirectos y el intestino (*). (C) Binarized imagen. Las áreas negras corresponden a los músculos de interés. El intestino ha sido borrado para una cuantificación exacta del área del músculo. Barra de escala: 200 μm.
<ol start="5"><li>Cuantificar el porcentaje de píxeles correspondiente a tejido muscular (pixeles negros) con el comando total: Análisis y medición y seleccione la opción fracción de área. Este porcentaje de la superficie es una estimación de la masa muscular de DLM de cada mosca.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li>
<li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+%28DLM%29+of+Drosophila%3A+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li>
<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/00atlas.htm">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li>
<li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Platin+Met+Rev%22%5BJournal%5D)">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li>
<li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1165/">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li>
<li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li>
<li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscleblind%2C+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li>
<li>García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li>
<li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184(2010).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223(2014).</li>
</ol>

No hay conflicto de interés declarado.

Se ha demostrado que la Drosophila melanogaster es un modelo útil para estudiar enfermedades neuromusculares humanas7,10,11, incluyendo distrofias miotónica, que se caracterizan por la aparición de atrofia muscular. El protocolo presentado aquí es una herramienta útil para la cuantificación de la degeneración muscular causada por la aparición o progresión de una enfermedad particular en un modelo de mosca. Por ejemplo, ...

El tórax de la mosca de la fruta contiene dos clases diferentes de los músculos de vuelo, que son funcionalmente, fisiológicamente y anatómicamente distintas. Estos músculos son: controlan de los músculos de vuelo indirectos (IFM), que se componen de dorso-longitudinales (DLM) y los músculos dorso-ventral (DVM) (figura 1) y el vuelo síncrono músculos1,2. Juntos, estos músculos generan la elevada potencia mecánica requerida para el vuelo. El tamaño, distribución y disposición rostro caudal de las IFMs permiten una fácil orientación para seccionamiento transversal3 (figura 2A). Por esta razón, hemos seleccionado estos músculos para el estudio de la atrofia muscular en Drosophila melanogaster.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> Figura 1. Diagrama del tórax de la mosca de la fruta que muestra los músculos de vuelo indirectos (IFMs) arreglo. (Izquierda) representa una visión lateral y (derecha) representa un corte transversal del tórax. El IFMs se componen de los músculos Dorso-longitudinales (DLM) (en rojo) y Dorso-ventral (DVM) de los músculos (en verde).
Preservación de la estructura del tejido y el control sobre la orientación del eje dorso-ventral de las secciones histológicas son críticos para garantizar la correcta evaluación de área transversal del músculo. Para preservar la estructura muscular se utilizó una mezcla de fijación modificada de Tomlinson et al. 4 . Por otra parte, porque los músculos son los tejidos internos, la impermeabilidad del exoesqueleto de Drosophilaes un problema como fijación mezclas no pueden penetrar a los tejidos de destino. Para evitar este problema, hemos eliminado la cabeza volar, patas, alas y los dos últimos segmentos del abdomen para crear agujeros que permiten la mezcla de fijación entrar. Como parte del Protocolo de fijación que se incluyeron tratamiento con tetróxido de osmio (OsO4)5, que utiliza extensivamente debido a su capacidad para fijar las grasas, incluyendo triglicéridos. OsO4 conserva la mayoría de las estructuras muy bien, especialmente a nivel citológico y al mismo tiempo proporciona contraste a la imagen. Después de la fijación, Drosophila toracico fueron embebida en resina para transversal semi-delgadas seccionamiento (1,5 μm). Para mejor contraste, tejido puede ser además teñido con toluidina azul. Imágenes de toracico completo se tomaron 10 X y área del músculo se cuantificó por binarizing imágenes (de dimensiones iguales) y cuantificar el porcentaje de píxeles correspondiente a tejido muscular (pixeles negros) de total, con el software ImageJ.
Modificaciones en las mezclas de preparación y fijación de tejidos, como el aumento de la concentración de OsO4 glutaraldehído solución, en este protocolo, permitieron la única preservación del tejido muscular. Esto es porque el protocolo evita la degradación y deformación del tejido, haciendo el análisis posterior de las muestras más confiable incluso en condiciones altamente atróficas asociadas a enfermedades degenerativas NEUROMUSCULARES como la distrofia miotónica (DM). En su forma más común, DM tipo 1, este trastorno genético poco común es provocada por repeticiones CUG ampliadas en las transcripciones de la proteína quinasa de distrofia miotónica (DMPK). Agregados de ARN mutante de DMPK focos de ribonuclear de forma que secuestran las proteínas de unión a RNA nucleares Muscleblind-como (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) en Drosophila)6. Hemos generado un modelo de Drosophila de la distrofia Myotonic expresando 250 repeticiones CTG en el promotor de la cadena pesada de miosina muscular (Mhc-Gal4). Moscas modelo eran incapaces de volar con un fenotipo típico 'celebró hasta las alas' y tenían graves musculares atrofia en sus IFMs (figura 2B). Estudios previos realizados en nuestro laboratorio han demostrado que la determinación de la zona muscular de IFMs es un método fiable para cuantificar los efectos de diferentes modificadores químicos o genéticos de la atrofia muscular en estas moscas modelo del7. Por ejemplo, la sobreexpresión de la isoforma de la Mbl C en moscas expresando la CTG 250 repeticiones en el músculo, consigue un rescate del área del músculo, como agotamiento de Mbl por secuestro es el factor desencadenante en la patogenesia de DM18 (figura 2). Área del músculo también fue rescatado después de alimentar el modelo DM vuela con Abp1, un hexapéptido con anti-DM1 probada actividad9 (Figura 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> Figura 2. Cuantificación de secciones dorsoventral de toracico adulto embebido en resina. Los músculos de vuelo indirectos (A-d) de Drosophila melanogaster con los genotipos correspondientes indicados. (A) control de moscas (PA). (B) expresión de 250 CTG no codificante se repite en el músculo (UAS-CTG(250)x) provocó una reducción del área del músculo en el DLMs en comparación con el control de moscas. (C) este fenotipo de atrofia muscular fue rescatado por la sobreexpresión de Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS MblC) y (D) alimentación las moscas modelo con hexapéptido Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). En todas las imágenes el lado dorsal es en la parte superior. Los transgenes fueron conducidos a los músculos mediante un promotor de la cadena pesada de miosina (Mhc)-Gal4. E cuantificación del porcentaje de área muscular en relación con las moscas de control confirma que las diferencias fueron significativas. El histograma muestra los medios ± SEM **p< 0.01 y * p < 0.05 (prueba de t de Student´s). Barra de escala: 200 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El método aquí registrado serán de interés a los investigadores centrarse en desarrollo muscular, mantenimiento y envejecimiento, patología de la enfermedad y las pruebas de drogas ya que proporciona información confiable sobre cómo el tejido muscular responde a factores endógenos y externos.

<table><tbody><tr><td>Software Image-J</td>, <td>Institutos Nacionales de Salud</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Ultramicrótomo</td><td>Leica</td><td>Leica UC6</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica</td><td>Leica MZ6</td><td>Técnica de campo claro.</td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>71970</td><td>Existen varios proveedores alternativos.</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>World Precision World</td><td>14003</td><td>Existen varios proveedores alternativos.</td></tr><tr><td>Moldes de incrustación</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>70900</td><td>Existen varios proveedores alternativos.</td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Fluka (Sigma)</td><td>49624</td><td>tóxico.</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>Polyscience</td><td>0972A</td><td>Extremadamente tóxico.</td></tr><tr><td>Óxido de propileno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82320-250ML</td><td>Extremadamente tóxico.</td></tr><tr><td>resina (Durcupan)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44611-44614</td><td>Carcinógeno cuando no está polimerizado.</td></tr><tr><td>Azul de toluidina</td><td>Panreac</td><td>251176</td><td>tóxico.</td></tr><tr><td>Medio de montaje (DPX)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44581</td><td>Peligroso.</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Nocivo.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Panreac</td><td>122507</td><td>dilución de 0,2 M.</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Panreac</td><td>121677</td><td>dilución de 0,2 M.</td></tr><tr><td>Bórax</td><td>Panreac</td><td>3052</td><td>tóxico.</td></tr></tbody></table>

determinación de zona óptica transversal muscular de los músculos de vuelo indirectos adultos de drosophila melanogaster

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Masa muscular atrofia, atrofia muscular, es un fenotipo común en modelos de Drosophila de enfermedades neuromusculares. Hemos utilizado los músculos de vuelo indirectos (IFMs) de las moscas, específicamente los músculos dorso-longitudinales (DLM), como el experimental sujeto a medida el fenotipo atrófico provocado por diferentes causas genéticas. En este protocolo, se describe cómo incrustar los músculos tórax mosca para seccionar fino semi, cómo obtener un buen contraste entre el músculo y el tejido circundante y cómo procesar imágenes de microscopio óptico para semiautomática adquisición de datos cuantificables y Análisis. Se describen tres aplicaciones específicas de la tubería metodológica. En primer lugar, mostramos cómo se puede aplicar el método para cuantificar la degeneración del músculo en un modelo de mosca de la distrofia miotónica; en segundo lugar, la medición del área transversal del músculo puede ayudar a identificar genes que promoverán o evitar la atrofia muscular o degeneración muscular; en tercer lugar, este protocolo puede ser aplicado para determinar si un compuesto candidato es capaz de modificar de manera significativa un determinado fenotipo atrófico inducido por una mutación enfermedad-que causano por un disparador ambiental.

Cuantificar si la sobreexpresión de MblC o la administración de Abp1 tenía cualquier efecto en el fenotipo atrófico del modelo mosca distrofia miotónica que nos centramos en el DLMs, que forman parte de IFMs (figura 1). Se determinó que el modelo vuela, que expresan 250 repeticiones CTG no codificante en toda la musculatura por el promotor de la miosina de cadena pesada (Mhc)-Gal4, tuvieron una reducción del 50% del área del músculo en comparación co...

Se presenta un método para cuantificar el área del músculo, que es un método indirecto para determinar la masa muscular en adultos del Drosophila . Demostramos la aplicación de nuestra metodología, analizando el vuelo indirecto los músculos en un modelo de Drosophila de la enfermedad de la distrofia miotónica.

Determinación de zona óptica transversal muscular de los músculos de vuelo indirectos adultos de Drosophila Melanogaster

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar el área muscular en los músculos adultos de Drosophila como un medio para cuantificar indirectamente la masa muscular y determinar correctamente el tamaño de la generación o la atrofia muscular. Con este fin, nos centramos en los músculos dorsolongitudinales debido a su tamaño, distribución y también porque, en esta posición, presentan una orientación baja y sencilla para el corte transversal. Uno, fijación e inclusión en resina.El primer paso del procedimiento consiste en anestesiar las moscas con CO₂ y, con ayuda de tijeras y pinzas, eliminar las patas, las alas y la parte terminal del abdomen. En segundo lugar, transfiera cuidadosamente los cadáveres, para evitar la deformación del tórax, a un tubo de un punto cinco mililitros sobre hielo, colocando un máximo de seis individuos por tubo que contenga 200 microlitros de la solución uno. Los cadáveres no pueden permanecer en esta solución por más de 20 minutos.Finalmente, agregue 200 microlitros de la solución dos e incube en hielo durante 30 minutos. Después de la incubación, elimine todo el líquido, agregue 200 microlitros de la solución dos e incube las carroñas en hielo durante una a dos horas. El siguiente paso consiste en eliminar la solución y deshidratar las muestras mediante una serie de etanol graduada.Incube las muestras dos veces en óxido de propileno durante diez minutos cada incubación. Luego, sustituya el óxido de propileno por una mezcla de 500 microlitros de resina y 500 microlitros de óxido de propileno e incube las muestras a temperatura ambiente durante la noche. Al día siguiente, reemplace la mezcla por resina al 100 % e incube las muestras durante cuatro horas.Posteriormente, transfiera las carroñas a moldes de plástico que contengan resina nueva, asegurándose de colocar una carroña en cada pocillo del molde. Con un palillo de madera, oriente las carroñas dentro de los pocillos y deje que la resina polimerice durante la noche en una estufa de Pasteur a 70 grados Celsius. Para desechar la resina, hornéela a 70 grados Celsius durante 24 horas, ya que la resina sólida y horneada no es tóxica.Dos, recorte y seccionado de los bloques. Con ayuda de hojas de afeitar, retire la resina y forme una forma trapezoidal alrededor del cadáver para lograr la orientación adecuada en el micrótomo. Verifique en el microscopio que los músculos estén perfectamente orientados.Después de esto, corte secciones de un grosor de un punto cinco micrómetros con un ultramicrotomo y transfiera las secciones a gotas de agua sobre portaobjetos gelatinizados. Finalmente, coloque los portaobjetos que contienen las secciones sobre un bloque calefactor a 70-80 grados Celsius hasta que se evapore toda el agua. Tres, tinción de secciones de MIF.Cubra los cortes con azul de toluidina durante aproximadamente 30 segundos en la placa calefactora. Luego, enjuague con varios cambios de agua y deje las laminillas sobre una placa tibia para que se evapore el agua. Cuarto, montaje de los cortes de MFI.Tomando los portaobjetos, coloque una o dos gotas de medio de montaje sobre las secciones y coloque un cubreobjetos largo. Cinco, adquisición de imágenes y cuantificación del área muscular. Utilice el software ImageJ para seleccionar un área que contenga únicamente los DLM.Tomando como control las dimensiones de la imagen de la mosca con el área muscular más grande, delinee las imágenes y elimine las áreas o píxeles que no correspondan a los músculos de interés. Cuantifique el porcentaje de píxeles correspondientes al tejido muscular respecto al total mediante el comando analizar, medición, y seleccione la opción fracción de área. Este porcentaje de área es una estimación de la masa muscular DLM de cada mosca.Resultados representativos. Determinamos que las moscas modelo, que expresan 250 repeticiones no codificantes CTG en todo el músculo, controladas por el promotor de miosina pesada, MhC Gal cuatro, presentaron una reducción del 50 por ciento en el área muscular en comparación con las moscas control. En contraste, la coexpresión de muscle blind C y repeticiones CTG expandidas con el mismo promotor suprimió fuertemente dicho fenotipo y el área transversal del músculo fue del 70 por ciento respecto a las moscas control.La administración del hexapéptido Abp1 en el medio nutritivo suprimió de manera similar el fenotipo atrófico, y las moscas modelo que habían ingerido el compuesto mostraron aproximadamente el 60 por ciento del área muscular normal, en lugar del 50 por ciento, que es típico de las moscas DF1. Conclusiones. El protocolo presentado aquí es una herramienta útil para cuantificar la degeneración muscular provocada por el inicio o la progresión de una enfermedad específica en un modelo de mosca. Finalmente, este método también está optimizado para detectar pequeñas diferencias en el área muscular, o incluso para cuantificar el área de diferentes estructuras, como los nefrocitos.Gracias por ver.

optical-cross-sectional-muscle-area-determination-drosophila

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Identificación de los mecanismos que subyacen a daño muscular es crucial. Aquí se presenta la técnica histológica para la preparación de parafina y las secciones congeladas de los músculos torácicos Drosophila. Esto permite el análisis de la morfología del músculo y la localización de las proteínas y otros componentes de la célula muscular.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

Los músculos de vuelo de Drosophila se utilizan como sistema modelo para el desarrollo muscular y la fisiología. Este video describe la musculatura de vuelo de los adultos y destaca un protocolo para diseccionar músculos de vuelo indirecto en desarrollo que son adecuados para la secuenciación de ARN de pupas.

Drosophila Disección del músculo de vuelo indirecto (IFM) de la pupa tardía: un método para la recolección de tejido de alto rendimiento

C. elegans tiene dos tipos de músculos, sarcómero simple y sarcómero múltiple, o músculos estriados. Este video describe la disposición de los músculos estriados de la pared del cuerpo, que son responsables de la locomoción de un gusano, e incluye un protocolo de muestra para medir la morfología muscular utilizando un software de análisis de imágenes.

Mediciones del área muscular de C. elegans: un método estandarizado para cuantificar la morfología del músculo estriado

En este protocolo, demostramos la aplicación de la tomografía electrónica serie-sección para dilucidar la estructura mitocondrial en músculo de vuelo indirecto de Drosophila .

3D ultraestructura mitocondrial del músculo de vuelo indirecto de Drosophila revelado por tomografía electrónica serie-sección

Aquí, presentamos un método fácil de usar y versátil para realizar en proyección de imagen de procesos de desarrollo en general y músculo-Tendinosas de la morfogénesis en particular en la vida de pupas de Drosophila .

En Vivo Proyección de imagen del músculo-tendón morfogénesis en Drosophila pupa

El músculo de vuelo drosofífia es un modelo potente para estudiar la regulación transcripcional, el empalme alternativo, el metabolismo y la mecanobiología. Presentamos un protocolo para la disección del músculo de vuelo con etiqueta fluorescente a partir de pupas vivas para generar muestras altamente enriquecidas ideales para la proteómica y la secuenciación profunda. Estas muestras pueden ofrecer importantes perspectivas mecanicistas sobre diversos aspectos del desarrollo muscular.

Disección de los músculos de vuelo de Drosophila melanogaster para los enfoques de Omics

Se presenta un protocolo que permite la visualización de Drosophila melanogaster intacta en cualquier etapa de desarrollo mediante tomografía microinformada.

Imágenes en animales enteros de Drosophila melanogaster mediante tomografía microcomputada

Describimos una técnica de disección que preserva la arquitectura de la unión neuromuscular y permite un estudio inmunocitoquímico detallado de las neuronas motoras en la pierna adulta de Drosophila .

Disección e inmunohistoquímica de la pierna adulta de Drosophila para detectar cambios en la unión neuromuscular de una neurona motora identificada

Drosophila es un modelo bien establecido para estudiar moléculas clave que regulan la miogénesis. Sin embargo, los métodos actuales son insuficientes para determinar la dinámica transcripcional del ARNm y la distribución espacial dentro de los sincitios. Para abordar esta limitación, optimizamos un método de hibridación in situ de fluorescencia de ARN que permite la detección y cuantificación de ARNm a escala de una sola molécula.

Estudio de la dinámica transcripcional muscular a escalas de una sola molécula en Drosophila

Aquí, presentamos un flujo de trabajo rápido y de bajo costo para obtener imágenes de alta resolución de ojos de Drosophila adultas para cuantificar los patrones y los defectos de crecimiento. Describimos nuestro protocolo para la preparación de muestras mediante montaje en punto, adquisición de imágenes de alta resolución y análisis de imágenes.

Un flujo de trabajo rápido y sencillo para la cuantificación de estructuras externas de Drosophila adulta

Drosophila es un modelo poderoso para comprender los mecanismos fundamentales de la miogénesis. Este protocolo para la disección y preparación de hemisecciones de tórax permite el análisis microscópico del músculo de vuelo indirecto tanto de la etapa de pupa como de la adulta. Este protocolo permite obtener imágenes confocales de la morfología celular, la localización de proteínas, la estructura muscular y muchos otros aspectos de la miogénesis.

Disección de los músculos de vuelo indirecto de Drosophila melanogaster para enfoques de microscopía

Aprende a cuantificar el área muscular en músculos de vuelo indirectos de Drosophila melanogaster mediante secciones transversales. Este método permite evaluar indirectamente la masa muscular y estudiar la atrofia en modelos de distrofia miotónica.

Determinación de zona óptica transversal muscular de los músculos de vuelo indirectos adultos de Drosophila Melanogaster

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