Inducción de parálisis y lesión del sistema Visual en ratones por T las células específicas para el Optica del Neuromyelitis Autoantigen Acuaporina-4

Los objetivos generales de este protocolo son inducir enfermedades autoinmunes del sistema nervioso central o del SNC mediante la transferencia adoptiva de células T específicas de acuaporina-4, y monitorizar los efectos resultantes en el SNC y el sistema visual dinámico. Este método ayudará a responder preguntas clave sobre el papel de las células T específicas de la acuaporina 4, comúnmente conocida como AQP4, en la neuromielitis óptica, así como en otros trastornos visuales inflamatorios. La principal ventaja de la tomografía de coherencia óptica es la capacidad de realizar un seguimiento longitudinal de la lesión retiniana de forma no invasiva.

Sharon Sagan, investigadora asociada de mi laboratorio, y Andreas Cruz Harans, miembro del Laboratorio RE Greens, demostrarán el procedimiento. Comience conectando una llave de paso de nailon de tres vías con dos conexiones de bloqueo Luer macho a una jeringa de bloqueo Luer de vidrio sin el émbolo. Cambie la palanca de la llave de paso hacia la jeringa para cerrarla y coloque la jeringa con el extremo abierto hacia arriba.

Después del vórtice, agregue un volumen uno a uno de péptido y la solución adyuvante completa de Freund a la jeringa y vuelva a insertar el émbolo de vidrio en la jeringa. Sosteniendo el émbolo en su lugar, invierta la jeringa de modo que la llave de paso quede hacia arriba y cambie la palanca a la conexión hembra no utilizada. Presione con cuidado el émbolo para eliminar el exceso de aire de la jeringa.

La solución llenará la segunda conexión de bloqueo Luer macho de la llave de paso. A continuación, conecte una segunda jeringa de vidrio con el émbolo completamente insertado en la segunda conexión de bloqueo Luer macho. Para crear una emulsión, presione alternativamente los émbolos para pasar la solución entre las dos jeringas durante unos dos minutos y enfríe la solución durante unos 10 minutos hasta que haya un cambio visible en la viscosidad de la solución.

Cuando se forme una emulsión blanca muy rígida, transfiera toda la solución a una de las jeringas y reemplace la jeringa vacía con una nueva jeringa Luer lock de un milímetro. Llene la jeringa nueva con la emulsión. Retire la jeringa de la llave de paso y coloque una aguja de calibre 25.

Para probar la consistencia de la emulsión, expulse una gota de la emulsión en un plato pequeño con agua. Si la emulsión no se dispersa, es apta para inyección. A continuación, inyecte por vía subcutánea a cada ratón AQP4 donante una vez en cada lado de la parte inferior del abdomen y en cada lado de la pared torácica medial a la axila.

De 10 a 12 días después de la vacunación, haga una incisión en la línea media de la piel desde la ingle hasta el cuello, y bajando por cada pata del primer ratón. Retira la piel del peritoneo y asegúrala firmemente a la tabla. A continuación, recoja los ganglios linfáticos inguinales y axilares, y coloque los tejidos en un colador de células dentro de una placa de Petri que contenga medio completo.

Cuando se hayan recolectado todos los ganglios linfáticos, coloque el filtro de células en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga medio completo fresco en hielo y use el extremo plano de un émbolo de jeringa estéril de cinco mililitros para presionar las células de los ganglios linfáticos a través de la malla del filtro. Enjuague la malla con 20 a 30 mililitros de medio completo para facilitar la recuperación de la célula, seguido de dos lavados por centrifugación. Después de la segunda centrifugación, vuelva a suspender el pellet en medio de células T para contar.

Agregue las concentraciones apropiadas de antígeno, interleucina de ratón recombinante 23 e IL-6 de ratón recombinante a las células, y agregue dos mililitros de células por pocillo en esta mezcla polarizadora Th17 en cada pocillo de una placa de 12 pocillos. A continuación, coloque la placa en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 5%CO2 durante 72 horas. Al tercer día de polarización, triture los cultivos en cada pocillo unas cuantas veces para desalojar las células polarizadas y aglomere en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo para contar.

Después de dos lavados en PBS, diluya las células a una concentración de una vez 10 a la octava célula por mililitro en PBS, y mezcle suavemente la suspensión celular girando. Dentro de una hora de su recolección, transfiera las células a una jeringa de un mililitro y entregue 200 microlitros de células a cada animal receptor por vía intravenosa a través de la vena de la cola. A continuación, inyecte a cada ratón por vía intraperitoneal inmediatamente y dos días después 200 nanogramos de toxina B pertussis diluidos en 200 microlitros de PBS.

Para la obtención de imágenes de la retina in vivo de los animales receptores mediante tomografía de coherencia óptica, cinco minutos antes de la obtención de imágenes, dilate las pupilas con una gota de tropicamida al 1% por ojo y encienda la estera térmica. Coloque el ratón en el cilindro de imagen y redirija el flujo de anestesia en consecuencia. Proteja los ojos con 0,3% de hidroxipropilmetilcelulosa para mantenerlos húmedos y garantizar la continuidad de la refracción, y coloque una lente de contacto personalizada en el ojo que se va a examinar.

Guiado por la imagen infrarroja del fondo de ojo, dirija el láser al ojo cubierto por la lente, teniendo cuidado de que el haz esté centrado en la cabeza del nervio óptico. Realice 25 escaneos B en modo de alta resolución y rasterice las imágenes de 30 escaneos A promedio. Después de obtener imágenes de ambos ojos, reemplace la lente de contacto con gel oftálmico y coloque al ratón en una jaula de recuperación tibia.

Para analizar las imágenes adquiridas utilizando el software de imágenes modulares para la segmentación automatizada, primero corrija manualmente los segmentos correspondientes a la membrana limitante interna y la capa plexiforme interna para representar los límites de las capas internas de la retina. A continuación, verifique que las capas de fibras nerviosas de la retina y de células ganglionares residan dentro de los límites de la capa interna de la retina y que no se superpongan. La inmunización subcutánea con péptidos AQP4 que contienen epítopos de células T patógenas provoca fuertes respuestas proliferativas de células T en los ganglios linfáticos drenantes de ratones knockout de AQP4 en comparación con las respuestas de células T de tipo salvaje.

Los análisis de citometría de flujo de la expresión beta V individual demuestran que las células T específicas para los péptidos AQP4 que contienen epítopos de células T patógenas utilizan repertorios TCR únicos y demuestran una hiperproliferación selectiva que indica que las respuestas de las células T patógenas a estos determinantes normalmente están reguladas por la selección tímica negativa. Aproximadamente de seis a nueve días después de la inyección de células T polarizadas, casi todos los ratones receptores desarrollaron signos clínicos de enfermedad autoinmune del SNC, incluida la cola flácida y la parálisis de las extremidades traseras. Con linfocitos T específicos de AQP4 polarizados Th17 que inducen una enfermedad clínica más grave que los linfocitos T específicos de AQP4 polarizados Th1.

Por ejemplo, este ratón desarrolló una parálisis completa de las extremidades traseras después de la administración de células T específicas del péptido AQP4 polarizado Th17. La enfermedad clínica inducida por las células Th17 específicas del péptido AQP4 también se asocia con una infiltración de células mononucleares en el parénquima y las meninges del SNC, así como con la inflamación del nervio óptico, como lo demuestra una hinchazón y un aumento del grosor de la capa interna de la retina que vuelve a la línea de base a medida que los ratones se recuperan de la enfermedad. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir y monitorear la autoinmunidad dirigida a AQP4, lo que permitirá realizar más estudios para comprender cómo participan las células T en la neuromielitis óptica.