Name: Inducción de parálisis y lesión del sistema Visual en ratones por T las células específicas para el Optica del Neuromyelitis Autoantigen Acuaporina-4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda a inducir enfermedad autoinmune del SNC mediante transferencia de células T específicas para AQP4 en ratones. Este método permite monitorear lesiones retinianas de forma no invasiva usando tomografía de coherencia óptica.

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Se prestó apoyo a S.S.Z. por el Instituto Nacional de salud (AI073737 to1 y to1 NS092835-01), sociedad nacional de esclerosis múltiple (4768 RG y RG 5179 5180 RG), Fundación de Maisin y Jackson Guthy Charitable Foundation.

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Sagan S.A. A. Cruz-Herranz, C.M. Spencer, P.P. Ho, L. Steinman, A.J. Green y R.A. Sobel no informan revelaciones. S.S. Zamvil es Editor adjunto de Neurología, Neuroinmunología y neuroinflamación y es miembro del Comité Consultivo de la sociedad internacional de Neuroinmunología. Él ha servido en el Consejo Editorial de la Revista de investigación clínica, El diario de la inmunología y La revista de ciencias neurológicasy ha sido miembro del Comité de examen de beca de los institutos nacionales de Neuroinmunología clínica de la salud (NIH) y tumores de cerebro (CNBT) estudio de la sección y la sociedad nacional de esclerosis múltiple (NEM). Él ha servido como consultor y recibió honorarios de Biogen Idec, EMD Serono, Genzyme, Novartis, Roche/Genentech y Teva Pharmaceuticals, Inc., ha servido y sirve en tableros de control de seguridad datos de Lilly, BioMS, Teva y terapéutica de Opexa. Actualmente, Dr. Zamvil recibe apoyo de la beca de investigación de los NIH, NEM, la Fundación de Maisin, Biogen y Celgene.

AQP4 fue identificado como el objetivo principal de IgG de la NMO en 20053. Entonces, se reconoció que sería importante establecer un modelo animal de AQP4-dirigido de la autoinmunidad de la CNS. Tal modelo podría ser útil para investigar cómo las células T específicas de AQP4 y B participan en el desarrollo de la autoinmunidad de la CNS y prueba terapéutica de candidato para NMO. Aunque el reconocimiento específico de AQP4 T epítopos de tipo salvaje ratones primero fue divulgado en 201013, las células T en respuesta a los epitopos no causó enfermedad clínico o histológico14,17. La incapacidad para generar un modelo de autoinmunidad CNS basado en la reactividad inmune a AQP4 seguía siendo un enigma hasta 2015 cuando Jones, et al. 25 descubrió que el donante AQP4 p135-153-preparado las células T de ratones- / - AQP4 eran capaces de provocar signos clínicos e histologic de la autoinmunidad de la CNS en los ratones WT. De interés, AQP4 p135-153 se predice para MHC II (I-Ab) se unen con alta afinidad17. Solamente un otro AQP4 secuencia de aminoácidos, 201-220, se prevé enlazar-Ab con alta afinidad similar. De hecho, observamos AQP4 p135-153 y p201-220 ambos provocan proliferación sólida de AQP4- / -, pero no peso, ratones. Aquí, hemos mostrado cómo se puede aislar y ampliar encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 y p201-220-reactiva las células de T de los ratones- / - AQP4. Cuando transfieren a ratones receptores WT, las células Th17 AQP4 reactiva donante inducida por parálisis, que fue acompañada por la célula mononuclear infiltra en la médula espinal y del nervio óptico. Lesión del sistema visual aferente es bien conocido en pacientes con AQP4 seropositivos NMOSD26. Aquí, observamos que la inflamación del nervio óptico inducida por las células Th17 MOG-reactiva y AQP4 reactivo era distinta. Mientras que las células Th17 específicas AQP4 inducen perineuritis óptica, las células Th17 MOG-específicos inducidos por neuritis óptica severa. También hemos descrito las técnicas utilizadas para controlar la inflamación del nervio óptico inducida por células específicas de AQP4 y T MOG-específicos por OCT serial. Otros investigadores ahora deben ser capaces de aplicar los protocolos descritos aquí para avanzar en sus estudios se centró en los mecanismos patogénicos de ATCA.
Fácilmente uno puede evitar tres escollos potenciales en nuestro protocolo. Primera transferencia adoptiva de ATCA requiere uso AQP4 específicos de células de T de los ratones de AQP4- / - donante. En concreto, las células donantes WT AQP4 p135-153-específico T no causó ATCA en receptoras ratones WT. En segundo lugar, es importante realizar una "prueba de agua" con una gota de la emulsión de péptido/CFA antes de inmunización de AQP4- / - ratones (protocolo paso 1.5). La emulsión no debe dispersarse en agua cuando es conveniente para la inyección s.c.. Si la emulsión dispersa, uno debe mezclar la emulsión una vez más, descansar otra vez y repita la prueba de agua. Por último, las células de T del antígeno específico activado donantes CNS inducen autoinmunidad CNS más eficientemente que la reclinación de las células T. Uno debe inspeccionar visualmente las culturas bajo el microscopio de luz antes de la cosecha de las células de T del donante para la transferencia adoptiva. Rápidamente dividiendo las células puede formar racimos, que son fácilmente identificables. También, cuando las culturas contienen muchas células T activadas, los medios de comunicación pueden transición de color rosado naranja o amarillo, debido a la reducción en el pH. También se puede evaluar activación de las células de ganglio AQP4 preparado T donantes de proliferación por la incorporación de 3H-timidina, tal como se describe en el protocolo de paso 3.
El descubrimiento que los epitopos de células T AQP4 patógenos dos son (1) predice para MHC II se unen con alta afinidad y (2) provocar potentes respuestas proliferativas en AQP4- / -, pero no peso, ratones sugieren que las células T dirigidas a los determinantes son normalmente controlado por selección negativa tímica17. El repertorio TCR para reconocimiento de AQP4 p135-153 y p201-220 en ratones- / - AQP4 es únicas (Figura 2), que también es consistente con la canceladura clónica mediada por las células epiteliales medulares tímicas. Otros mecanismos de tolerogénicas normalmente pueden limitar inmunorespuestas a AQP4. Después de nuestro informe inicial17, otro grupo también demostró que la AQP4 p201-220 contiene un encephalitogenic determinante de la célula de T27. Cuando ratones α/β (TCRα- / -) deficiencia de la célula de T fueron reconstituidos con AQP4- / - CD4+ T las células fue posible provocar una respuesta de células T encephalitogenic AQP4 específicos, pero no una AQP4 específica respuesta humoral, lo que implica que en Los ratones WT respuestas de células B de AQP4 específicas, similares a respuestas de células T específicas de AQP4, son objeto de selección negativa. De hecho, la pérdida de axones de la médula espinal y RGCs, que no se observó en los ratones WT con ATCA inducida por las células T específicas de AQP4 solo, puede requerir participación de anticuerpos patógenos específicos de AQP4. Está claro que modelos murinos de autoinmunidad CNS dirigido AQP4 continuará evolucionando conforme aprendemos más sobre los mecanismos de tolerogénicas normalmente controlan AQP4 específicos de la célula T y célula de B de la inmunidad.
Otros modelos de autoinmunidad CNS dirigido AQP4 también están siendo desarrollados6,16,28,29,30. Cada uno puede ofrecer ventajas para el estudio de determinados aspectos que son relevantes para la patogenesia NMO. Se han identificado linfocitos T específicos de AQP4 en WT ratas6,16,29. Esas células T específicas de AQP4 causaron cambios histologic de la autoinmunidad de la CNS, pero similar a las observaciones en los ratones, las de células T específicas de AQP4 rata WT no causan señales significativas de enfermedad clínica. Por lo tanto, los mecanismos de tolerancia restringiendo la célula de T y células B específicas de AQP4 las respuestas inmunitarias en ratones WT funcionan también en ratas. A pesar de todo, uno no debe subestimar el poder en el uso de modelos de ratón para el estudio de mecanismos implicados en la patogenia de la enfermedad. La riqueza de knock-out, transgénico y ratones reportero puede ser ventajosa. También debe reconocerse que varios descubrimientos fundamentales en la autoinmunidad se hicieron usando modelos de ratón EAE. Por ejemplo, demostración que T cell clones específicos para un antígeno de uno mismo puede mediar enfermedad autoinmune31,32, identificación de la función de coestimulación de la célula de T en autoinmunidad33 y el descubrimiento de la Desarrollo vía de diferenciación Th1734 primero fueron descritos usando modelos de ratón EAE. Usando el modelo del ratón del ATCA que hemos desarrollado, uno ahora tiene los medios para estudiar el desarrollo y la regulación de patógenos específicos de AQP4 inmunorespuestas en vivo, que debe proporcionar penetraciones importantes relacionadas con la patogénesis de la NMO.

Neuromielitis óptica (NMO) es una enfermedad desmielinizante inflamatoria autoinmune de sistema nervioso central (SNC) que causa episodios recurrentes de parálisis y pérdida de la visión lleva a discapacidad neurológica permanente1. NMO es considerado sobre todo al ser una enfermedad autoinmune humoral2 se asocia con anticuerpos (Igs) contra Acuaporina-4 (AQP4), un canal de agua que se expresa abundantemente en los astrocitos3,4. Sin embargo, la inflamación del CNS es un prerrequisito para la entrada del CNS de AQP4 Ig5,6. Por lo tanto, no ha sido posible establecer un modelo de NMO por la transferencia de anti-AQP4 Igs solamente. Las conclusiones que (1) patógenos Igs específicas de AQP4 en pacientes NMO son IgG11,2, un Ig de dependiente de la célula de T en NMO lesiones8,9 (3) NMO se identifican células de T de subclase7 (2) se asocia con ciertos genes de MHC II (por ejemplo, HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10y proinflamatorias (4) Dr. AQP4 reactiva-Th17 restringida que las células se expanden en la NMO pacientes11,12 todos indican que las células T específicas de AQP4 tienen un papel clave en la patogenia de la NMO. Por lo tanto, es importante desarrollar modelos animales para determinar cómo las células T específicas de AQP4 pueden contribuir a la patogenesia NMO.
Hace varios años, se identificaron múltiples epitopos de células T de AQP4 en wild-type (WT) ratones13,14 y ratas15. Mientras que se observó que las células T reactivas con AQP4 podrían inducir inflamación opticospinal en ingenuo receptor ratas15,16, no se observaron signos clínicos significativos de la enfermedad del CNS. Del mismo modo, dirigir la inmunización de los ratones WT con los péptidos que contienen AQP4 T célula epitopos14,17, o transferencia de células proinflamatorias T dirigidas a los determinantes17, no provocó signos clínicos o histologic evidencia de autoinmunidad de la CNS.
Recientemente, se observó que inmunización de ratones C57BL/6 AQP4-deficientes (AQP4- / -) con AQP4 péptido (p) 135-153 o p201-220, dos determinantes predijo a MHC II (I-Ab) se unen con alta afinidad18, sacó fuerte CD4 + De las respuestas de células T17. Por el contrario, estos dos péptidos produce solamente modestas respuestas proliferativas en ratones WT. Además, el repertorio de T cell receptor (TCR) utilizado para el reconocimiento de estos determinantes por las células T de ratones- / - AQP4 era único. Colectivamente, estos resultados indican que la célula de T reconocimiento de AQP4 es regulada por tímica selección negativa. AQP4 p135-153-p201-220-específicos o células Th17 de AQP4- / - ratones donantes inducida por parálisis en casi el 100% de ratones de peso receptoras ingenuo; Esto se asoció con opticospinal infiltrados de células T, linfocitos B y monocitos. Serie opticospinal tomografía de la coherencia (OCT) demostró la implicación del sistema visual dinámico. Ratones con autoinmunidad mediada por células T dirigida AQP4 CNS (ATCA) se recuperaron de la parálisis y lesión del sistema visual. En contraste con EAE inducida por myelin oligodendrocyte glicoproteína (MOG) p35-55-linfocitos T específicos, que condujo a la enfermedad clínica persistente, ATCA inducida por las células T sólo no se asoció con pérdida axonal o la reducción en las células ganglionares de la retina (RGCs). Nuestros resultados han demostrado claramente que hay determinantes patógenos múltiples de la célula T de AQP4. Este nuevo modelo de ATCA es útil para el estudio de mecanismos que controlan el desarrollo de patógenas específicos de AQP4 las células T, aprendiendo cómo las células inducen inflamación del CNS y cómo puede cooperar con las células B específicas de AQP4 y anticuerpos para promover la patogenesia de la NMO .
En el presente informe, se describen los protocolos utilizados para inducir y evaluar inducida por células T ATCA. Comenzamos con las técnicas utilizadas para que inmunización, cultivo de células de T y polarización Th17 para generar patógenas células T específicos de AQP4, análisis de citometría de flujo para confirmar la polarización y transferencia adoptiva de las células T. A continuación describimos los métodos utilizados para evaluar enfermedad clínica e histologic y el uso de OCT serial para controlar lesiones del sistema visual en los ratones receptores.

<table><tbody><tr><td>M. tuberculosis H37Ra</td><td>BD Difco</td><td>231141</td><td>desecado, asesinado M. tuberculosis</td></tr><tr><td>Adyuvante de Freund incompleto</td><td>BD Difco</td><td>263910</td><td></td></tr><tr><td>AQP4 péptido p135-153</td><td>Genemed</td><td></td><td>Secuencia de péptidos de síntesis personalizada: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN</td></tr><tr><td>Péptido AQP4 p201-220</td><td></td><td>Secuencia de péptidos de síntesis personalizada genética: HLFAINYTGASMNPARSFGP</td><td></td></tr><tr><td>Péptido MOG p35-55</td><td>Genemed / Auspep</td><td>Secuencia de péptidos de síntesis personalizada: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td><td></td></tr><tr><td>Llave de paso de 3 vías</td><td>Kimble</td><td>420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Suero bovino fetal (caracterizado)</td><td>GE Ciencias de la Vida para el Cuidado de la Salud</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Ratón recombinante IL-23</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>1887-ML</td><td></td></tr><tr><td>Ratón recombinante IL-6</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>Ratón recombinante IL-12</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>419-ML</td><td></td></tr><tr><td>Timidina [Metil-3H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET027</td><td></td></tr><tr><td>Tapetes de filtro de fibra de vidrio</td><td>PerkinElmer</td><td>1450-421</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos anti-ratón</td><td>eBioscience (Affymetrix)</td><td>[varios]</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón TCR V&beta; Panel de cribado</td><td>BD Biosciences</td><td>557004</td><td></td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO Tinción de células muertas fijables</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>[varios]</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (16%)</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Kit de solución de fijación/permeabilización con GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Yomomicina (sal de calcio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Toxina de la tos ferina de B. pertussis</td><td>List Laboratorios Biológicos</td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica de flujo variable</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de biopsia de espuma, rectangulares</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-221</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia (isoflurano, USP)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td></td><td>050033 NDC : 11695-0500-2</td></tr><tr><td>Solución oftálmica de tropicamida, USP (1%)</td><td>Akorn</td><td></td><td>NDC: 17478-102-12</td></tr><tr><td>Plataforma de diagnóstico por imágenes Spectralis Heidelberg</td><td>Engineering</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inducción de parálisis y lesión del sistema visual en ratones por t las células específicas para el optica del neuromyelitis autoantigen acuaporina-4

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Si bien se reconoce que Acuaporina-4 (AQP4)-anticuerpos y células T específicas participan en la patogenia de la Neuromielitis óptica (NMO), una enfermedad desmielinizante autoinmune humana del sistema nervioso central (SNC), creación de un modelo objetivo de AQP4 con ambos manifestaciones clínicas e histologic de la autoinmunidad de la CNS ha demostrado ser un reto. Inmunización de ratones de tipo salvaje (WT) con péptidos de AQP4 produce proliferación de células T, aunque esas células de T no podían transferir la enfermedad a ratones receptores ingenuos. Recientemente, novela dos epítopos de células T de AQP4, péptido (p) 135-153 p201-220, se identificaron y al estudiar las respuestas inmunitarias de AQP4 en ratones deficientes de AQP4 (AQP4- / -), sugiriendo la reactividad de células T a estos epitopos es normalmente controlada por Timo selección negativa. AQP4- / - Th17 polarizado células T cebadas p135-153 o p201-220 inducido parálisis en receptoras ratones WT, que se asoció con predominante leptomeningeal inflamación de la médula espinal y nervios ópticos. Inflamación circundante los nervios ópticos y la participación de las capas retinianas internas (IRL) se manifiestan por cambios en la tomografía de coherencia óptica serial (OCT). Aquí, nos ilustran los enfoques utilizados para crear este nuevo modelo en vivo de la autoinmunidad de la CNS dirigido AQP4 (ATCA), que ahora puede ser empleada para estudiar mecanismos que permitan el desarrollo de patógenas células T específicas de AQP4 y cómo puede cooperar con B células en la patogénesis de la NMO.

En este protocolo, se utilizaron células de un donante T de AQP4 C57BL/6- / - ratones. Vacunación subcutánea de estos ratones con AQP4 p135-153 o p201-220, que contienen epítopos de células T patógenas, generó respuestas fuertes proliferativa de la célula T en nodos de linfa de drenaje (figura 1), mientras que estos dos péptidos inducido mucho más débil de la célula T proliferación de ratones WT. En comparación, la inmunización con AQP4 p91-110, que contiene una no patógena AQP4 T célula determinante13, o MOG p35-55, un péptido de mielina que activa las células T que causar encefalomielitis autoinmune experimental (EAE)22,23 ,24, inducida por la magnitud de la proliferación de células T en ratones WT AQP4- / - y similar. Análisis de la utilización de TCR manchando flujo cytometry de Vβ individuales o familias Vβ, demostrado que p135-153 y p201-220-T células específicas de AQP4- / - ratones utilizaron único repertorio TCR. Hiper proliferación selectiva de AQP4 p135-153 y p201-220 en ratones- / - AQP4, así como la utilización única de TCR (figura 2), indica que las respuestas de células T patógenas a estos determinantes normalmente es regulada por negativo tímico selección, destacando la importancia para el uso de células de donante T de AQP4- / - en el presente Protocolo.
Antes de la transferencia adoptiva para la inducción de ATCA, las células del nodo de linfa de AQP4 péptido preparado ratones fueron cultivadas in vitro en condiciones de polarización Th17 o Th1 durante tres días. El grado de polarización de donantes CD4+ T las células fue confirmada por citoquinas intracelulares tinción (ICS) y medido por citometría de flujo (figura 3). Ingenuo receptoras ratones fueron inyectados por vía intravenosa con 2 x 107 donantes AQP4 péptidos específicos de células T. Después de aproximadamente seis días, casi 100% de los ratones receptores desarrollaron signos clínicos de enfermedad autoinmune de la CNS, incluyendo parálisis flácida de la cola y extremidades (figura 4). Células T específicas de AQP4 polarización Th17 inducidos por una enfermedad clínica más severa que las células T específicas de AQP4 polarización Th1. Un ratón representante Th17 AQP4-péptido-específico y había desarrollado completa extremidades parálisis (paraplejia) se muestra en el Video 1. En contraste con los ratones que EAE se convirtió después de la administración de células Th17 MOG-específicos, ratones receptores recuperaron de clínica de la enfermedad inducida por las células Th17 específicas AQP4. En cuanto a EAE inducida por las células Th17 MOG p35-55-específicas, clínica de la enfermedad inducido por la AQP4 p135-153-específicas o las células Th17 p201-220-específicas se asoció con infiltración de células mononucleares en el parénquima de la CNS y meninges (figura 5). Las lesiones fueron más abundantes en las meninges que en la parenquimia de autoinmunidad CNS inducida por las células Th17 específicas AQP4.
Implicación del nervio óptico fue demostrada por la evaluación histológica y por serial OCT. AQP4 específicos y Th17 MOG-específicos de las células tanto inflamación inducida del nervio óptico, que se caracterizó por la presencia de células mononucleares. Mientras que las células Th17 específicas AQP4 causaron perineuritis óptica, las células Th17 MOG-específicos inducidos por neuritis óptica severa (figura 5). Usando OCT serial, inflamación del nervio óptico fue evidente por la hinchazón y mayor espesor de la capa retiniana interna (IRL) para clínica de la enfermedad inducida por AQP4 específicos o células Th17 MOG-específicos (figura 6). Para autoinmunidad inducida por la AQP4 Th17 CNS, grueso IRL regresado a los valores basales como ratones recuperado de la enfermedad clínica. En cambio, la persistencia de EAE inducida por MOG-específicos Th17 correspondió con adelgazamiento de la IRL y, como hemos demostrado anteriormente17, se asoció con pérdida de células ganglionares de la retina.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig1.jpg"> 
Figura 1 : AQP4 p135-153 y p201-220 provocan proliferación de robusta célula de T en ratones- / - AQP4, pero no ratones WT. Ratones fueron inmunizados s.c. con los péptidos indicados en CFA. Once días más tarde, los nodos de linfa fueron quitados y entonces cultivados con o sin antígeno, o con el péptido que se utiliza para la inmunización. Proliferación se midió por la incorporación de 3H-timidina (media ± SEM, representativo de 5 experimentos). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig2.jpg"> 
Figura 2 : Las células de T específicas AQP4 de AQP4- / - ratones utilizan repertorios TCR únicos. AQP4- / - y WT ratones fueron inmunizados con los péptidos indicados. Once días más tarde, los nodos de linfa fueron quitados y cultivados con el péptido que se utiliza para la inmunización. Las células se cosecharon. Utilización de TCR Vβ fue analizada por citometría de flujo (media ± SEM, n = 5). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig3.jpg"> 
Figura 3 : Polarización proinflamatorias de las células donantes específicos AQP4 T. Once días después de la inmunización con AQP4 p135-153 o p201-220, las células del nodo de linfa fueron cosechadas y cultivadas con el péptido que se utiliza para la inmunización en condiciones de no polarización, las condiciones de polarización Th1 o Th17. Polarización Th17 o Th1 fue examinado por el ICS y flujo cytometry para IL-17 o IFN-γ, respectivamente. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig4.jpg"> 
Figura 4 : Las células T específicas de AQP4 polarización Th17 inducen parálisis en ratones receptores WT. Ratones receptores WT recibieron 2 x 107 donantes AQP4 polarización Th17 p135-153 o p201-220-específicos de células T de ratones- / - AQP4. Las células de T de MOG-específicos polarización Th17 sirven como control positivo. Resultados son representativos de 8 experimentos (n = 5/Grupo). * p &#60; 0.05, ** p &#60; 0.01, *** p &#60; 0.001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig5.jpg"> 
Figura 5 : Las células Th17 específicas AQP4 inducen inflamación opticospinal en ratones WT. Receptoras ratones recibieron 2 x 107 donantes Th17 AQP4 p135-153 - o p201-220-cebada Th17 células de ratones- / - AQP4 o MOG Th17 p35-55-específico y se sacrificaron 10 días más tarde. Los tejidos de la médula espinal y del nervio óptico fueron preparados y teñidos con H &#38; E/LFB para evaluar evidencia de inflamación y desmielinización, respectivamente. Resultados son representativos de 5 ratones/grupo. Barra de escala = 50 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig5large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig6.jpg"> 
Figura 6 : Inflamación del nervio óptico inducida por las células Th17 AQP4 específicos puede controlarse por octubre retinianos longitudinales PESO receptoras ratones recibieron 2 x 107 donantes AQP4 polarización Th17 p201-220-específico o MOG p35-55-específicos de células T en el día 0. Fueron examinados por OCT en el día 0 (antes de la administración de células T) y luego en los días 4, 7, 8, 9 10, 11 14 y 21. Espesor de la IRL fue medido (media ± SEM). Las estadísticas indican una comparación con el control de ingenuo. Resultados son representativos de 3 experimentos (5 ratones/grupo). * p &#60; 0.05, ** p &#60; 0.01, *** p &#60; 0.001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, presentamos un protocolo para inducir inflamación parálisis y opticospinal por la transferencia de la Acuaporina-4 (AQP4)-células de T específicas de AQP4 ratones- / - en ratones WT. Además, se demuestra cómo utilizar la tomografía de coherencia óptica serial para controlar la disfunción del sistema visual.

Inducción de parálisis y lesión del sistema Visual en ratones por T las células específicas para el Optica del Neuromyelitis Autoantigen Acuaporina-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Los objetivos generales de este protocolo son inducir una enfermedad autoinmune del sistema nervioso central o SNC mediante la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos para la acuaporina 4, y monitorear los efectos resultantes sobre el SNC y el sistema visual dinámico. Este método ayudará a responder preguntas clave sobre el papel de los linfocitos T específicos para la acuaporina 4, comúnmente conocida como AQP4, en la neuromielitis óptica, así como en otros trastornos inflamatorios visuales. La principal ventaja de la tomografía de coherencia óptica es la capacidad de realizar un monitoreo longitudinal de la lesión retiniana de manera no invasiva.La demostración del procedimiento estará a cargo de Sharon Sagan, asociada de investigación en mi laboratorio, así como de Andreas Cruz Harans, becario en el Laboratorio de RE Greens. Comience por sujetar una llave de paso de nylon de tres vías con dos conexiones macho tipo Luer lock a una jeringa de vidrio con conexión tipo Luer lock, sin el émbolo. Gire la palanca de la llave de paso hacia la jeringa para cerrarla y coloque la jeringa con el extremo abierto orientado hacia arriba.Después de agitar mediante vortex, agregue un volumen igual de péptido y solución de adyuvante de Freund completo a la jeringa, y vuelva a insertar el émbolo de vidrio en la jeringa. Sosteniendo el émbolo en su lugar, invierta la jeringa de modo que la llave de paso quede mirando hacia arriba, y cambie la palanca a la conexión hembra no utilizada. Presione cuidadosamente el émbolo para eliminar el exceso de aire de la jeringa.La solución llenará la segunda conexión macho Luer lock del grifo. A continuación, conecte una segunda jeringa de vidrio con el émbolo completamente insertado en la segunda conexión macho Luer lock. Para crear una emulsión, presione alternativamente los émbolos para hacer pasar la solución entre las dos jeringas durante aproximadamente dos minutos, y enfríe la solución durante unos 10 minutos hasta que se observe un cambio visible en la viscosidad de la solución.Cuando se forme una emulsión blanca muy rígida, transfiera toda la solución a una de las jeringas y sustituya la jeringa vacía por una nueva jeringa Luer lock de un milímetro. Llene la jeringa nueva con la emulsión. Retire la jeringa de la llave de paso y coloque una aguja de calibre 25.Para probar la emulsión en agua y verificar su consistencia, expulse una gota de la emulsión en un pequeño recipiente con agua. Si la emulsión no se dispersa, es adecuada para la inyección. A continuación, inyecte una vez por vía subcutánea a cada ratón donador knockout para AQP4 en cada lado del abdomen inferior y en cada lado de la pared torácica, medial a la axila.De 10 a 12 días después de la inmunización, realice una incisión media en la piel desde la ingle hasta el cuello, y hacia abajo por cada pata del primer ratón. Separe la piel del peritoneo y fíjela firmemente al tablero. Luego, recoja los ganglios linfáticos inguinales y axilares, y coloque los tejidos en un filtro celular dentro de una placa de Petri que contenga medio completo.Una vez recolectados todos los ganglios linfáticos, coloque el colador celular sobre un tubo cónico de 50 mililitros que contenga medio completo fresco sobre hielo, y utilice el extremo plano del émbolo de una jeringa estéril de cinco mililitros para presionar las células de los ganglios linfáticos a través de la malla del filtro. Enjuague la malla con 20 a 30 mililitros de medio completo para facilitar la recuperación celular, seguido de dos lavados por centrifugación. Después de la segunda centrifugación, re suspenda el precipitado en medio para linfocitos T para el conteo.Añada las concentraciones apropiadas de antígeno, interleucina recombinante de ratón 23 y IL-6 recombinante de ratón a las células, y agregue dos mililitros de células por pocillo en esta mezcla polarizadora de Th17 a cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Luego, coloque la placa en un incubador humedecido a 37 grados Celsius con 5% CO2 durante 72 horas. Al tercer día de polarización, triture los cultivos en cada pocillo varias veces para desprender las células polarizadas y reúnalas en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo para su conteo.Después de dos lavados en PBS, diluya las células hasta una concentración de un por diez a la octava células por mililitro en PBS, y mezcle suavemente la suspensión celular agitando en círculos. Dentro de una hora de su recolección, transfiera las células a una jeringa de un mililitro y administre 200 microlitros de células a cada animal receptor por vía intravenosa a través de la vena de la cola. Luego, inyecte a cada ratón inmediatamente y dos días después por vía intraperitoneal 200 nanogramos de toxina de B pertussis diluidos en 200 microlitros de PBS.Para la imagenología retiniana in vivo de los animales receptores mediante tomografía de coherencia óptica, cinco minutos antes de la imagenología, dilate las pupilas con una gota de tropicamida al 1 % por ojo, y encienda la alfombra calefactora. Coloque al ratón sobre el cilindro de imagenología, y redirija el flujo de anestesia en consecuencia. Proteja los ojos con hidroxipropil metilcelulosa al 0,3 % para mantenerlos húmedos y garantizar la continuidad de la refracción, y coloque una lente de contacto personalizada sobre el ojo que se va a examinar.Guiado por la imagen de fondo infrarrojo, dirija el láser hacia el ojo cubierto con lente, teniendo cuidado de que el haz esté centrado en la cabeza del nervio óptico. Realice 25 escaneos B en modo de alta resolución y rasterice las imágenes a partir de 30 escaneos A promediados. Después de obtener imágenes de ambos ojos, reemplace la lente de contacto por gel oftálmico y coloque al ratón en una jaula de recuperación cálida.Para analizar las imágenes adquiridas utilizando el software modular de imágenes para la segmentación automatizada, primero corrija manualmente los segmentos correspondientes a la membrana limitante interna y a la capa plexiforme interna para representar los límites de las capas retinianas internas. Luego, verifique que las capas de fibras nerviosas retinianas y de células ganglionares se encuentren dentro de los límites de la capa retiniana interna y que no se superpongan. La inmunización subcutánea con péptidos de AQP4 que contienen epítopos de células T patógenos provoca fuertes respuestas proliferativas de células T en los ganglios linfáticos drenantes de ratones knockout para AQP4 en comparación con las respuestas de células T de tipo silvestre.Los análisis citométricos de flujo de la expresión individual de V beta demuestran que las células T específicas para péptidos de AQP4 que contienen epítopos de células T patógenos utilizan repertorios únicos de TCR y muestran una hiperproliferación selectiva, lo que indica que las respuestas de células T patógenas frente a estos determinantes están normalmente reguladas por la selección negativa tímica. Aproximadamente entre seis y nueve días después de la inyección de células T polarizadas, casi todos los ratones receptores desarrollaron signos clínicos de enfermedad autoinmune del SNC, incluyendo cola flácida y parálisis de las extremidades posteriores. Las células T específicas para AQP4 polarizadas hacia Th17 inducen una enfermedad clínica más grave que las células T específicas para AQP4 polarizadas hacia Th1.Por ejemplo, este ratón desarrolló parálisis completa de las extremidades posteriores tras la administración de linfocitos T específicos para el péptido AQP4 polarizados a Th17. La enfermedad clínica inducida por células Th17 específicas para el péptido AQP4 también se asocia con una infiltración de células mononucleares en el parénquima y las meninges del SNC, así como con inflamación del nervio óptico, evidenciada además por una hinchazón y un aumento del grosor de la capa interna de la retina, que vuelve a los niveles basales cuando los ratones se recuperan de la enfermedad. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir y monitorear la autoinmunidad dirigida contra AQP4, lo que permitirá estudios adicionales para comprender cómo los linfocitos T participan en la neuromielitis óptica.

induction-paralysis-visual-system-injury-mice-t-cells-specific-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El video demuestra la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón mediante la inyección de una combinación de glicoproteínas de oligodendrocitos de mielina y Mycobacterium tuberculosis inactivada. El modelo permite a los investigadores estudiar los mecanismos de la enfermedad y probar intervenciones terapéuticas.

Inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

Este video muestra el método para inducir encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inyectando péptidos derivados de mielina con un adyuvante para activar las células T autorreactivas, que migran al cerebro. La toxina de la tos ferina se administra para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que estas células T y otras células inmunitarias ingresen al cerebro. Estas células inmunitarias causan desmielinización, lo que conduce a una transmisión nerviosa...

Generación de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

En este video, se establece un modelo de ratón de esclerosis múltiple utilizando encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Al ratón se le inyecta una emulsión que contiene un péptido neuronal y un adyuvante, lo que desencadena una respuesta inmunitaria que activa las células T autorreactivas. A esto le sigue una inyección de toxina pertussis (PTX) para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que las células T autorreactivas se infiltren en el cerebro. Esta...

Este video muestra el procedimiento de inducción de parálisis mediante la transferencia de células Th17 activadas dirigidas a la acuaporina-4 a un modelo de ratón. En el sistema nervioso central, las células Th17 activadas interactúan con los astrocitos que expresan acuaporina-4, desencadenando una respuesta inmunitaria que conduce a la parálisis de la cola y las extremidades en el ratón.

Inducción de parálisis en un modelo de ratón mediante la transferencia de células Th17 específicas de acuaporina-4

Este video muestra el proceso de evaluación de la disfunción motora en un modelo de ratón mediante la administración de toxina de tos ferina y un inóculo que contiene péptidos y adyuvantes que imitan la mielina, seguido de pruebas en cinta rodante para evaluar la función motora y evaluar el daño nervioso resultante debido a la activación inmune y la desmielinización.

Evaluación de la función motora en un modelo experimental de ratón con neuritis autoinmune

Describimos un método para implantar y mantener ventanas de vidrio sobre la médula espinal expuesta de ratones adultos para estudiar la encefalomielitis autoinmune experimental. Estas ventanas proporcionan acceso óptico crónico a la médula espinal para monitorear la dinámica celular a nivel subcelular en animales vivos utilizando microscopía de dos fotones.

Implante de ventanas de vidrio de la médula espinal en ratones adultos con encefalomielitis autoinmune experimental

Este manuscrito describe los métodos para la inducción y puntuación del modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE), junto con la evaluación de la distribución de células inmunitarias y los niveles de citocinas de ARNm en ganglios linfáticos, bazo, sangre y médula espinal mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa, respectivamente, en varias fases de la enfermedad.

La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos

Este informe describe un enfoque simple para inducir con éxito neuritis autoinmune experimental (EAN) utilizando la mielina proteína cero (P0)180-199 péptido en combinación con adyuvante completo de Freund y toxina del pertussis. Presentamos un paradigma sofisticado capaz de evaluar con precisión la magnitud de los déficits funcionales y neuropatología que ocurren en este EAN.

Un enfoque Simple para inducir Neuritis Autoinmune Experimental en ratones C57BL/6 para las evaluaciones funcionales y Neuropathological

Ensayo basado en células es un método ampliamente utilizado para detectar la inmunoglobulina del suero de anti-Acuaporina-4 G. Este método podría aplicarse a diagnóstico clínico y las investigaciones científicas de los trastornos del espectro óptico de Neuromielitis óptica.

Suero humano Anti-Acuaporina-4 inmunoglobulina G detección por análisis Cell-based

El presente protocolo describe la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón utilizando glicoproteína oligodendrocitos de mielina y monitoreando el proceso de la enfermedad utilizando un sistema de puntuación clínica. Los síntomas experimentales relacionados con la encefalomielitis autoinmune se analizan mediante análisis de tomografía microcomputarizada de fémur de ratón y prueba de campo abierto para evaluar el proceso de la enfermedad de manera integral.

Inducción y diversos indicadores de evaluación de la encefalomielitis autoinmune experimental

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal de esclerosis múltiple (EM), que comparte con la enfermedad humana una respuesta autoinmune humoral robusta. En este trabajo presentamos un protocolo ELISA sencillo y flexible para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones inmunizados con EAE.

Cuantificación de anticuerpos autorreactivos en ratones tras encefalomielitis autoinmune experimental

Aprenda a inducir enfermedad autoinmune del SNC mediante transferencia de células T específicas para AQP4 en ratones. Este método permite monitorear lesiones retinianas de forma no invasiva usando tomografía de coherencia óptica.

Inducción de parálisis y lesión del sistema Visual en ratones por T las células específicas para el Optica del Neuromyelitis Autoantigen Acuaporina-4 (Video) | JoVE Journal

Inducción de parálisis y lesión del sistema Visual en ratones por T las células específicas para el Optica del Neuromyelitis Autoantigen Acuaporina-4

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