Inducción de parálisis y lesión del sistema Visual en ratones por T las células específicas para el Optica del Neuromyelitis Autoantigen Acuaporina-4

Los objetivos generales de este protocolo son inducir una enfermedad autoinmune del sistema nervioso central o SNC mediante la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos para la acuaporina 4, y monitorear los efectos resultantes sobre el SNC y el sistema visual dinámico. Este método ayudará a responder preguntas clave sobre el papel de los linfocitos T específicos para la acuaporina 4, comúnmente conocida como AQP4, en la neuromielitis óptica, así como en otros trastornos inflamatorios visuales. La principal ventaja de la tomografía de coherencia óptica es la capacidad de realizar un monitoreo longitudinal de la lesión retiniana de manera no invasiva.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Sharon Sagan, asociada de investigación en mi laboratorio, así como de Andreas Cruz Harans, becario en el Laboratorio de RE Greens. Comience por sujetar una llave de paso de nylon de tres vías con dos conexiones macho tipo Luer lock a una jeringa de vidrio con conexión tipo Luer lock, sin el émbolo. Gire la palanca de la llave de paso hacia la jeringa para cerrarla y coloque la jeringa con el extremo abierto orientado hacia arriba.

Después de agitar mediante vortex, agregue un volumen igual de péptido y solución de adyuvante de Freund completo a la jeringa, y vuelva a insertar el émbolo de vidrio en la jeringa. Sosteniendo el émbolo en su lugar, invierta la jeringa de modo que la llave de paso quede mirando hacia arriba, y cambie la palanca a la conexión hembra no utilizada. Presione cuidadosamente el émbolo para eliminar el exceso de aire de la jeringa.

La solución llenará la segunda conexión macho Luer lock del grifo. A continuación, conecte una segunda jeringa de vidrio con el émbolo completamente insertado en la segunda conexión macho Luer lock. Para crear una emulsión, presione alternativamente los émbolos para hacer pasar la solución entre las dos jeringas durante aproximadamente dos minutos, y enfríe la solución durante unos 10 minutos hasta que se observe un cambio visible en la viscosidad de la solución.

Cuando se forme una emulsión blanca muy rígida, transfiera toda la solución a una de las jeringas y sustituya la jeringa vacía por una nueva jeringa Luer lock de un milímetro. Llene la jeringa nueva con la emulsión. Retire la jeringa de la llave de paso y coloque una aguja de calibre 25.

Para probar la emulsión en agua y verificar su consistencia, expulse una gota de la emulsión en un pequeño recipiente con agua. Si la emulsión no se dispersa, es adecuada para la inyección. A continuación, inyecte una vez por vía subcutánea a cada ratón donador knockout para AQP4 en cada lado del abdomen inferior y en cada lado de la pared torácica, medial a la axila.

De 10 a 12 días después de la inmunización, realice una incisión media en la piel desde la ingle hasta el cuello, y hacia abajo por cada pata del primer ratón. Separe la piel del peritoneo y fíjela firmemente al tablero. Luego, recoja los ganglios linfáticos inguinales y axilares, y coloque los tejidos en un filtro celular dentro de una placa de Petri que contenga medio completo.

Una vez recolectados todos los ganglios linfáticos, coloque el colador celular sobre un tubo cónico de 50 mililitros que contenga medio completo fresco sobre hielo, y utilice el extremo plano del émbolo de una jeringa estéril de cinco mililitros para presionar las células de los ganglios linfáticos a través de la malla del filtro. Enjuague la malla con 20 a 30 mililitros de medio completo para facilitar la recuperación celular, seguido de dos lavados por centrifugación. Después de la segunda centrifugación, re suspenda el precipitado en medio para linfocitos T para el conteo.

Añada las concentraciones apropiadas de antígeno, interleucina recombinante de ratón 23 y IL-6 recombinante de ratón a las células, y agregue dos mililitros de células por pocillo en esta mezcla polarizadora de Th17 a cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Luego, coloque la placa en un incubador humedecido a 37 grados Celsius con 5% CO2 durante 72 horas. Al tercer día de polarización, triture los cultivos en cada pocillo varias veces para desprender las células polarizadas y reúnalas en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo para su conteo.

Después de dos lavados en PBS, diluya las células hasta una concentración de un por diez a la octava células por mililitro en PBS, y mezcle suavemente la suspensión celular agitando en círculos. Dentro de una hora de su recolección, transfiera las células a una jeringa de un mililitro y administre 200 microlitros de células a cada animal receptor por vía intravenosa a través de la vena de la cola. Luego, inyecte a cada ratón inmediatamente y dos días después por vía intraperitoneal 200 nanogramos de toxina de B pertussis diluidos en 200 microlitros de PBS.

Para la imagenología retiniana in vivo de los animales receptores mediante tomografía de coherencia óptica, cinco minutos antes de la imagenología, dilate las pupilas con una gota de tropicamida al 1 % por ojo, y encienda la alfombra calefactora. Coloque al ratón sobre el cilindro de imagenología, y redirija el flujo de anestesia en consecuencia. Proteja los ojos con hidroxipropil metilcelulosa al 0,3 % para mantenerlos húmedos y garantizar la continuidad de la refracción, y coloque una lente de contacto personalizada sobre el ojo que se va a examinar.

Guiado por la imagen de fondo infrarrojo, dirija el láser hacia el ojo cubierto con lente, teniendo cuidado de que el haz esté centrado en la cabeza del nervio óptico. Realice 25 escaneos B en modo de alta resolución y rasterice las imágenes a partir de 30 escaneos A promediados. Después de obtener imágenes de ambos ojos, reemplace la lente de contacto por gel oftálmico y coloque al ratón en una jaula de recuperación cálida.

Para analizar las imágenes adquiridas utilizando el software modular de imágenes para la segmentación automatizada, primero corrija manualmente los segmentos correspondientes a la membrana limitante interna y a la capa plexiforme interna para representar los límites de las capas retinianas internas. Luego, verifique que las capas de fibras nerviosas retinianas y de células ganglionares se encuentren dentro de los límites de la capa retiniana interna y que no se superpongan. La inmunización subcutánea con péptidos de AQP4 que contienen epítopos de células T patógenos provoca fuertes respuestas proliferativas de células T en los ganglios linfáticos drenantes de ratones knockout para AQP4 en comparación con las respuestas de células T de tipo silvestre.

Los análisis citométricos de flujo de la expresión individual de V beta demuestran que las células T específicas para péptidos de AQP4 que contienen epítopos de células T patógenos utilizan repertorios únicos de TCR y muestran una hiperproliferación selectiva, lo que indica que las respuestas de células T patógenas frente a estos determinantes están normalmente reguladas por la selección negativa tímica. Aproximadamente entre seis y nueve días después de la inyección de células T polarizadas, casi todos los ratones receptores desarrollaron signos clínicos de enfermedad autoinmune del SNC, incluyendo cola flácida y parálisis de las extremidades posteriores. Las células T específicas para AQP4 polarizadas hacia Th17 inducen una enfermedad clínica más grave que las células T específicas para AQP4 polarizadas hacia Th1.

Por ejemplo, este ratón desarrolló parálisis completa de las extremidades posteriores tras la administración de linfocitos T específicos para el péptido AQP4 polarizados a Th17. La enfermedad clínica inducida por células Th17 específicas para el péptido AQP4 también se asocia con una infiltración de células mononucleares en el parénquima y las meninges del SNC, así como con inflamación del nervio óptico, evidenciada además por una hinchazón y un aumento del grosor de la capa interna de la retina, que vuelve a los niveles basales cuando los ratones se recuperan de la enfermedad. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir y monitorear la autoinmunidad dirigida contra AQP4, lo que permitirá estudios adicionales para comprender cómo los linfocitos T participan en la neuromielitis óptica.