Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

El objetivo general de este procedimiento es investigar los perfiles de unión de diferentes modificaciones de histonas, utilizando muestras embrionarias de baja abundancia para mejorar la anotación funcional de los genomas de los vertebrados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como cuáles son los potenciadores clave y los genes que definen la identidad de un tejido embrionario en particular. Las principales ventajas de estas técnicas son que requiere una cantidad limitada de material particular y también se puede utilizar tanto para análisis específicos locales como para análisis de todo el genoma.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación de la transcripción o la heterogeneidad celular con los tejidos embrionarios, también se puede aplicar a otros sistemas, como las muestras de patentes. Para obtener la etapa HH19, los embriones de gallina para este experimento, incubaron huevos fértiles de gallina Leghorn blanca en orientación horizontal a 37 grados centígrados y 80% de humedad durante tres días. Para empezar a aislar los embriones de HH19, hazlos accesibles extrayendo tres mililitros de albúmina con una jeringa de 10 milímetros para bajar el blastodermo.

Con el fin de eliminar las membranas embrionarias adicionales, use tijeras finas para hacer una pequeña abertura en el ojo. Agregue un mililitro de solución de bloqueo. Con la ayuda de una aguja doblada, añade 0,5 mililitros de tinta negra china.

Use tijeras quirúrgicas finas y pinzas para cortar la membrana embrionaria adicional que rodea al embrión. A continuación, transfiere el embrión con una cuchara perforada a una placa de Petri de 4,5 centímetros que contiene 20 mililitros de solución de PBS. Trabajando en hielo bajo un microscopio estereoscópico, use tijeras finas y pinzas para diseccionar y desechar el amnios y las partes restantes de la membrana embrionaria adicional.

A continuación, se corta el tubo neurológico espinal transverso o el segmento SNT a nivel braquial del embrión. Extienda la disección caudalmente en la región torácica para aislar el SNT. Para terminar, utiliza pinzas para extraer los tejidos que rodean lateral y ventralmente el SNT.

Después de aislar los SNT, sumerja cada segmento en una placa de Petri de 3,5 centímetros que contenga tripsina tibia a 37 grados centígrados. Cuando el aflojamiento de los tejidos no neurológicos alrededor del SNT sea visible bajo un microscopio estereoscópico, transfiera las muestras a PBS frío 1x. Para detener la tripsinización, transfiera las muestras a un nuevo plato con DMEM frío que contenga 10% de FBS.

Use fórceps para extraer manualmente los tejidos mesenquimales y ectodérmicos restantes del SNT. Transfiera esta sección limpia de SNT a un tubo de 1,5 mililitros y congélela rápidamente en nitrógeno líquido. A continuación, homogeneice el tejido según el protocolo de texto.

Añadir 13,5 microlitros de formaldehído al 37% e incubar a temperatura ambiente en un rotador durante 15 minutos. Para apagar el formaldehído, agregue 25 microlitros de glicina molar 2.5 molar al tubo e incube a temperatura ambiente en un rotador durante 10 minutos. Centrifugar el tubo y luego, lavar el pellet de acuerdo con el protocolo de texto.

Después de la reticulación, vuelva a suspender el pellet en 300 microlitros de tampón de lisis completo y helado por pipeteo. Incubar las muestras a cuatro grados centígrados en una plataforma oscilante durante 10 minutos. A continuación, sonique las muestras a cuatro grados centígrados.

Después de la sonicación, centrifugar las muestras a 16.000 x G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante o lisado a un tubo nuevo de 1,5 mililitros y deseche la pastilla de residuos celulares. Diluya el lisado de acuerdo con el protocolo de texto.

Luego, mantenga una pequeña alícuota de cada muestra como control de entrada y congele a 20 grados centígrados. Incubar las muestras restantes que se someterán a precipitación de cromatina o chip con los anticuerpos apropiados de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, añada 300 microlitros de cromatina unida a anticuerpos a las perlas magnéticas previamente lavadas.

Invierta los tubos para mezclar las muestras. Para unir los anticuerpos a las perlas, coloque los tubos en un rotador de tubos y gírelos verticalmente a cuatro grados centígrados durante un mínimo de cuatro horas. Para lavar las perlas unidas con cromatina, agregue un mililitro de tampón de lavado RIPA helado al tubo mantenido en hielo y mezcle invirtiendo o moviendo el tubo.

Después de colocar el tubo en el soporte magnético a temperatura ambiente, espere a que las cuentas se asienten en el costado. Vierte el líquido transparente y repite este lavado tres veces más. Después de agregar un mililitro de cloruro de sodio TE 50 milimolar al tubo, transfiera las perlas unidas a la cromatina en esta solución a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 milímetros.

Coloque el tubo en el soporte magnético y cuando las perlas se hayan asentado, vierta el líquido. A continuación, centrifugar las perlas a 900 x G a cuatro grados centígrados durante tres minutos en una centrífuga preenfriada. Una vez que las cuentas se hayan asentado en el soporte magnético, retire todo el TE restante con una punta de carga de gel.

Trabajando a temperatura ambiente, agregue 210 microlitros de tampón de elución a las perlas y vuelva a suspender agitando. Incube el tubo en un bloque de calor precalentado a 65 grados centígrados durante 15 minutos, mientras agita. Después de la incubación, centrifugar los tubos con las perlas a 16.000 x G a temperatura ambiente, durante un minuto.

Una vez que las perlas se hayan asentado en el soporte magnético, transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo. Descongele la muestra de control de entrada previamente congelada desde 20 grados centígrados hasta temperatura ambiente. Agregue 90 microlitros de tampón de elución a la muestra y mezcle mediante un breve vórtice.

Para revertir los enlaces cruzados, incube el chip y controle las muestras a 65 grados centígrados durante la noche. Trabajando a temperatura ambiente, agregue un volumen de tampón TE por tubo e invierta para mezclar. Para digerir el ARN, agregue la ARNasa A al control y corte las muestras hasta una concentración final de 0,2 miligramos por mililitro e invierta los tubos para mezclar.

Incubar los tubos en un bloque de calor precalentado a 37 grados centígrados durante dos horas. Para digerir la proteína para la posterior purificación del ADN, agregue proteasa K hasta una concentración final de 0,2 miligramos por mililitros a los tubos e invierta los tubos para mezclar. Incubar los tubos en un bloque de calor precalentado a 55 grados centígrados durante dos horas.

Extraiga y purifique el ADN de acuerdo con los materiales complementarios. Este ADN ahora se puede utilizar para la PCR cuantitativa y la preparación de bibliotecas de búsqueda de chips. La eficiencia de la sonicación, esencial para el éxito de un chip, se confirma mediante la electroforesis en gel de agarosa de las muestras de control de entrada.

En este ejemplo, utilizando secciones de tubo neural espinal de pollo o SNT, se utilizaron 11 ciclos de sonicación para obtener un tamaño de fragmento óptimo que oscila entre 200 y 500 pares de bases. El ADN astillado se analizó mediante PCR cuantitativa para medir los niveles de enriquecimiento de las marcas de histonas activadoras y represivas alrededor de las regiones promotoras de los genes que están activos e inactivos en el SNT del pollo. Esto demuestra que es posible evaluar la calidad del chip cuantificando solo unos pocos lados bajos sin perder mucho ADN para análisis posteriores.

Después de que las bibliotecas de búsqueda de chips se prepararon en secuencia, se muestra una langosta representativa para los datos de búsqueda de trimetilación de H3K27 y trimetilación de H3K4 generados en SNT de pollo. También se generaron con éxito perfiles de búsqueda de chips similares en diferentes tejidos embrionarios de pollo, como prominencias maxilares y embriones en estadio HH3. Esto demuestra que aquí se presenta el protocolo CHIP se puede utilizar para generar perfiles epigenómicos a partir de cantidades limitadas de varios tejidos embrionarios.

Al utilizar este protocolo para generar los perfiles de modificación de histonas en un tejido embrionario, es importante recordar que las señales provendrán de todos los diferentes tipos de células presentes en dicho tejido. Siguiendo este protocolo y utilizando más material biológico de partida, debería ser posible investigar los perfiles de unión de otras proteínas implicadas en la regulación transcripcional, como los factores de transcripción, los coactivadores o las subunidades de la ARN polimerasa 2. Una vez establecidos, estos protocolos permitirán a los investigadores en el campo de la biología del desarrollo o la genética médica mejorar la alteración funcional de los genomas de los vertebrados y obtener información importante sobre las bases moleculares de la miogénesis, la evolución y las enfermedades humanas.