Protocolo para la síntesis en fase sólida de oligómeros de ARN que contiene un 2'- -tiofenilmetilo Modificación y caracterización mediante dicroísmo circular

El objetivo general de este informe es ilustrar el procedimiento para obtener oligonucleótidos de ARN a través de la síntesis en fase sólida. Se sintetizarán dodeámeros de ARN como modelos y también se demostrará su purificación y caracterización. A través de su componente visual, esta publicación ampliará el alcance de las metodologías y facilidades utilizadas por los investigadores en diversos campos.

Proporcionar una ayuda visual, junto con un pequeño protocolo, permitirá a los investigadores emplear estas técnicas. Una ventaja de esta técnica es su posibilidad de realizar una amplia gama de modificaciones. A medida que las aplicaciones actuales se vuelven más exigentes, es importante contar con un protocolo estándar.

La química de la fosforamidita está experimentando un resurgimiento debido a la robustez del método y su potencial para la obtención de oligonucleótidos para aplicaciones terapéuticas. Si bien la compra de oligonucleótidos es atractiva, el precio y la disponibilidad de las modificaciones cambian el interés hacia la preparación interna de estos oligómeros, lo que hace que este procedimiento sea de suma importancia. Para comenzar este procedimiento, pese cada fosforamidita en botellas ámbar de 10 mililitros secadas al horno y tape cada botella con un tabique previamente perforado con una aguja de calibre 20.

Coloque las botellas inmediatamente al vacío utilizando un desecador que contenga un agente secante. Después de llenar el desecador con argón seco, retire cada botella e inmediatamente agregue acetonitrilo anhidro antes de asegurarlo a un sintetizador de péptidos en fase sólida. A continuación, retire los septos de cada botella y colóquelos en el sintetizador mediante una función de cambio de botella.

Para configurar la síntesis en fase sólida, seleccione el icono de software. Seleccione el nombre del sintetizador y haga clic en Aceptar. A continuación, cree una nueva síntesis seleccionando Archivo y Nuevo orden de síntesis. A continuación, utilice la ventana de solicitud para introducir la fecha de ejecución, el cliente y el ID de ejecución. Seleccione el instrumento, el nombre de la secuencia y la secuencia.

En la pestaña Ciclo, asigne el método creado anteriormente. A continuación, elija el manual del procedimiento final, que deja el oligonucleótido unido a la resina CPG. Selecciona DMT desactivado.

Guarde el archivo seleccionando Archivo y Guardar como.A continuación, proporcione un nombre para el experimento y haga clic en Guardar. A continuación, envíe el archivo para comenzar la síntesis seleccionando Pedido y Enviar pedido al sintetizador. En la ventana de solicitud, seleccione una posición de columna y haga clic en Aceptar. En la ventana Sintetizador, seleccione Trityl Monitor.

Haga clic en Elegir función y Trityl Supervise cada paso escribiendo 1. Comience la síntesis seleccionando Sintetizador y Preparar para comenzar. Coloque las columnas con el extremo deseado de tres cebadores en las posiciones indicadas en el instrumento.

A continuación, haga clic en Inicio y No en el instrumento. Una vez completada la síntesis, retire la columna del instrumento y colóquela en un matraz de fondo redondo. Seque la columna a presión reducida durante aproximadamente 0,5 horas.

Transfiera la resina blanca de la columna a un tubo de centrífuga de 1,6 mililitros y agregue 0,5 mililitros de una solución acuosa de metilamina y amoníaco. Asegure la tapa del tubo de la centrífuga con parafilm y caliente el contenido a 60 grados centígrados durante una hora y media. Coloque un objeto pesado encima de los tubos para asegurarse de que la concentración se mantenga constante.

Después de enfriar a temperatura ambiente, centrifugar brevemente la muestra para reducir el contenido. Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga. Enfríe el tubo a 70 grados centígrados colocándolo en un baño de etanol de hielo seco durante cinco minutos y luego concéntrelo hasta que se seque con un concentrador de aspiradora rápida.

Ahora, vuelva a suspender los sólidos en 0,4 mililitros de una solución de trifluoruro de amina y trihidrafluoruro y luego asegure la tapa con una película de laboratorio. Calienta la solución a 60 grados centígrados durante una hora y media. Coloque un objeto pesado encima de los tubos para asegurar una concentración constante.

Después de enfriar la solución a temperatura ambiente, agregue 0,04 mililitros de una solución de acetato de sodio seguida de una mezcla suave con la punta de una pipeta. Agregue un mililitro de etanol y enfríe la solución a aproximadamente 70 grados centígrados con un baño de etanol de hielo seco durante 15 minutos. A continuación, centrifugar la solución a 15.000 rpm a cuatro grados centígrados durante diez minutos.

Utilice una pipeta para extraer el sobrenadante y seque el pellet resultante a presión reducida. Después del secado, vuelva a suspender el sólido obtenido y el tampón de carga, y mezcle hasta que la solución sea homogénea. A continuación, cargue la suspensión sobre un gel de poliacrilamida previamente preparado.

Aplique una corriente a través del gel hasta que el marcador azul de brometimol se encuentre entre la mitad y los dos tercios del gel. Después de retirar el gel del soporte, transfiera el contenido del gel del vidrio a la envoltura de plástico y colóquelo sobre una placa de cromatografía de capa delgada cubierta con sílice, para visualizar las bandas usando una lámpara UV. Use un marcador para delinear la posición donde se encuentra la banda superior y córtela con una cuchilla de afeitar.

Coloque el gel que contiene el ARN en un tubo cónico de 50 mililitros y tritúrelo en pedazos pequeños con una varilla de vidrio. Ahora, suspenda los residuos de gel en una solución acuosa de cloruro de sodio y agite la suspensión a 37 grados centígrados durante 12 horas. Transfiera la suspensión a un tubo de 15 mililitros y luego centrifugue a 3400 RPM durante diez minutos.

Para desalar la muestra con un cartucho C18 de fase reversa, primero lave el cartucho con acetonitrilo, agua, cloruro de amonio acuoso y la solución de ARN, dejando atrás los residuos de gel. Después de lavar con agua, eluir el ARN de la columna con tres mililitros de solución acuosa de metanol al 60% en tres tubos de ensayo diferentes. Enfríe los tubos a 70 grados centígrados en un baño de hielo seco durante cinco minutos y luego concentre el contenido hasta que se seque con un concentrador de aspiración rápida.

Después de concentrar el eluyente a presión reducida, vuelva a disolver el residuo en 0,3 mililitros de agua libre de RNasa. Después de diluir la solución, deposite un microlitro en el instrumento UV vis para medir el espectro UV vis entre 200 y 450 nanómetros. Para el análisis MALDI-TOF, primero lave una punta de pipeta C18 con acetonitrilo al 50 %.

Equilibre la punta de la pipeta con ácido trifluoroacético al 0,1 %. A continuación, cargue la punta de la pipeta con una solución que contenga de 100 a 150 picomoles de muestra. Después de lavar la punta de la pipeta con 0,1 % de TFA y agua, eluir la muestra en una solución que contenga la matriz deseada.

Deposite 0,9 microlitros de la solución en una placa MALDI y deje que la muestra se seque. Para el análisis de la estructura del ARN, transfiera la muestra que contiene ARN a una microcubeta y colóquela en el cambiador de muestras de un instrumento de dicroísmo circular. Abra el tanque de nitrógeno para proporcionar un flujo que mueva el flotador de aire ubicado en el instrumento a aproximadamente 40.

Luego, encienda la hielera. Ahora, enciende el instrumento. Abra el software haciendo clic en el icono del Administrador de espectro y, a continuación, abra la ventana de Adquisición haciendo clic en Medición del espectro.

Después de purgar el instrumento con nitrógeno, adquiera los espectros de dicroísmo circular seleccionando Medir y Parámetros. En la pestaña General, seleccione 200-350 nanómetros para el escaneo, CD y HT para los canales, 0,1 nanómetros para el tono de datos, 100 nanómetros por minuto para la velocidad de escaneo, un nanómetro para el ancho de banda y cinco para el número de acumulaciones. En la pestaña Unidad de celda, elija 20 grados centígrados.

En la pestaña Control, seleccione El obturador se abre y se cierra automáticamente. En la pestaña Información, introduzca el nombre de la muestra, el operador, la concentración y el disolvente. En la pestaña Datos, vaya a la carpeta deseada y haga clic en Aceptar. Adquiera los espectros haciendo clic en Medir y Medir muestra.

Finalmente, identifique las posiciones de las cubetas en el cambiador de muestras del uno al seis y haga clic en Aceptar. Las cuatro hebras de ARN se obtuvieron mediante síntesis en fase sólida y, tras la purificación, produjeron entre 300 y 700 nanomoles de cada oligonucleótido. Aquí se muestran los cromatogramas MALDI-TOF de los oligonucleótidos. No se observan diferencias importantes en los espectros UV vis normalizados al comparar la banda a 260 nanómetros y los oligonucleótidos canónicos y modificados, ya sea comparando muestras monocatenarias o estructuras dúplex.

Sin embargo, se observan cambios menores en la medición de sus espectros de dicroísmo circular. Además, las mediciones de Tm de las tres estructuras dúplex mostraron un valor distinto que era indicativo de la desestabilización inducida por la incorporación de las dos modificaciones principales de otio fenilmetilo en una de las hebras. Es importante recordar que el rendimiento de la síntesis en fase sólida depende de la pureza del reactivo.

La humedad tendrá un impacto negativo en cada paso, ya que la cantidad de agua presente debe ser reactiva en todo momento. La metodología reportada está destinada a servir como un recurso general para los científicos. La técnica puede variar en función de la modificación deseada, la instrumentación disponible o las limitaciones de tiempo.

El tipo de química empleada aquí representa una metodología muy robusta que ha estado en uso desde la década de 1980, y todavía se usa mucho en entornos académicos e industriales. Después de ver este vídeo, debería ser capaz de realizar la síntesis, purificación y caracterización de sus propios oligonucleótidos modificados o canónicos de ARN o ADN. No olvide que trabajar con los reactivos necesarios puede ser peligroso, y se debe usar equipo de protección como gafas de seguridad, guantes y batas de laboratorio en todo momento.

Todos los reactivos deben manipularse con cuidado y, cuando corresponda, dentro de una campana extractora.