Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la actividad citotóxica de las células NK humanas. Este método puede utilizarse para monitorear pacientes con deficiencia de células NK funcional o clásica. Las principales ventajas de esta técnica basada en citometría de flujo son su sensibilidad, reproducibilidad y mayor rapidez en comparación con los métodos estándar de evaluación de la función de las células NK, como el ensayo de liberación de cromo radiactivo.

Este método puede utilizarse para probar terapias novedosas dirigidas a las células NK, así como para realizar análisis citométricos de flujo multiparamétricos en profundidad de la biología de las células NK, análisis que anteriormente no eran alcanzables. Comience utilizando la separación por gradiente de densidad para aislar las células mononucleares de la sangre periférica, o PBMC, a partir de muestras de sangre total según protocolos estándar. El uso de PBMC en lugar de células NK purificadas es altamente beneficioso al trabajar con especímenes clínicos.

Diluya las células aisladas hasta una concentración de cinco veces 10 a la sexta células por mililitro en medio completo y recolecte inmediatamente las células diana K562 mediante centrifugación. Re-suspenda cinco veces 10 a la quinta células K562 en 500 microlitros de medio fresco suplementado con un uno por ciento de FBS. A continuación, marque las células diana con 500 microlitros de la solución de trabajo de CFSE y mezcle suavemente la suspensión celular pipeteando de tres a cinco veces.

Después de 10 minutos a 37 grados Celsius protegido de la luz, detenga la reacción de marcado con 10 mililitros de medio completo durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Al final de la incubación de detención, recoja las células por centrifugación y re-suspenda la paleta de células diana marcadas en un mililitro de medio completo para el recuento. Luego, diluya las células hasta una concentración de un por diez a la quinta células por mililitro de medio completo fresco y coloque las células diana en un incubador húmedo a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono.

Para un ensayo exitoso, reduzca al mínimo el estrés de las células diana y pruebe las células efectoras lo antes posible después de su recolección. Dentro de los 30 minutos posteriores a la marcación de las células diana, marque una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con fondo en U según la tabla. A continuación, agregue 100 microlitros de medio completo a los pocillos con las relaciones de células efectoras a células diana de 25 a 1, 12,5 a 1 y 6,25 a 1, así como a los pocillos que contienen solo células diana y a los que contienen solo células efectoras.

Añada 100 microlitros de células efectoras a los pozos de control de citotoxicidad y a los pozos con relaciones de células efectoras a células diana de 50:1 y 25:1. Luego, comenzando con el pozo de relación 25:1 de células efectoras a células diana, transfiera 100 microlitros de células al pozo con la siguiente concentración más baja de relación celular para los dos siguientes pozos, saltándose los pozos que contienen solo células diana, mezclando bien entre cada transferencia celular y añadiendo los últimos 100 microlitros de células a los pozos que contienen únicamente células efectoras. Añada 100 microlitros de la solución de trabajo 2X al 0,2 por ciento de Tween al pozo de control positivo de muerte de K562 con solo Tween.

Agregue 30 microlitros de la solución de trabajo del vial dos a los pozos de control positivo de citotoxicidad de las células NK. Luego, agregue 1 × 10⁵ células diana K562 marcadas por mililitro en 100 microlitros de medio completo a todos los pozos, excepto a los pozos con solo células efectoras. Una vez que todas las células hayan sido sembradas, mezcle todos los pozos con la pipeta multicanal.

Sequiar las células mediante una breve centrifugación y colocar la placa en el incubador de cultivo celular durante cuatro horas. Al final de la incubación, colocar la placa sobre hielo o sobre una plataforma fría, y añadir 50 microlitros de tinción recién preparada para células muertas a cada pocillo. A continuación, mezclar suavemente todos los pocillos y analizar las células mediante citometría de flujo.

El análisis por citometría de flujo de CSFE y la tinción de células muertas tras cuatro horas de cultivo en frío, como se acaba de demostrar, revela que las células en los pocillos con solo células diana presentan una muerte celular del 15 % o menor. No se detecta señal de CSFE en los pocillos con solo células efectoras si se observa menos del cinco por ciento de muerte celular en estos pocillos. Mientras tanto, la muerte celular en los pocillos de muerte de células diana mediada por Tween es típicamente superior al 85 %. En pacientes con un defecto en la función de las células NK, se observa una actividad citolítica reducida en la mayoría o en todas las proporciones ensayadas en comparación con individuos sanos, lo que demuestra que las células NK de estos pacientes exhiben una reducción diferencial de la citotoxicidad que se correlaciona con una disminución en la relación de células efectoras a células diana.

Una vez dominada, esta técnica puede completarse en seis horas y media, incluyendo las dos horas de preparación y siembra, cuatro horas de incubación y 30 minutos de adquisición. Al intentar este procedimiento, es importante recordar preparar las células diana y efectoras en paralelo para minimizar el tiempo de retraso entre la preparación celular y el inicio de la co-incubación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la actividad citotóxica de las células NK humanas frente a células diana marcadas con fluorescencia mediante citometría de flujo.