Name: Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Aprende a evaluar la citotoxicidad de células NK humanas mediante citometría de flujo. Este método sensible y reproducible permite diagnosticar deficiencias de NK y probar terapias dirigidas sin radiactividad.

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Nos gustaría agradecer a Jill Narciso, centro de inmunogenética de UCLA, por su asistencia con la preparación del manuscrito.

Las muestras se recolectaron de acuerdo con las pautas éticas establecidas por el Programa de Protección de la Investigación Humana de UCLA y aprobadas por el IRB.
1. Preparación de reactivos
NOTA: A menos que se indique lo contrario, se debe permitir que todos los reactivos se equilibren a temperatura ambiente antes de su uso. Todos los reactivos deben permanecer estériles.
<ol>
	<li>Prepare una solución de trabajo 2 veces mayor de Tween-20 (es decir, 0,2%) añadiendo 10 μL de solución de Tween-20 a 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin calcio y magnesio con una pipeta p20.
	<ol>
		<li>Dada la alta viscosidad de Tween-20, siga los siguientes pasos para garantizar la precisión: recoja lentamente para evitar la formación de burbujas, no sumerja toda la punta para evitar el arrastre y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces en PBS para lavar todo Tween-20 de la punta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Agregue 2 μL de solución madre de IL-2 (2.1E6 UI/mL) a 198 μL de medio completo (es decir, dilución 1:100), que es RPMI con 1% de penicilina-estreptomicina y 10% de suero fetal bovino (FBS), luego proceda a una dilución adicional 1:100 agregando 2 μL de solución intermedia de IL-2 a 198 μL de medio completo para preparar una solución de trabajo 7x (210 UI/mL).</li>
	<li>Agregue 2 μL de solución madre de CFSE (5 mM) a 500 μL de medio simple (RPMI). Vortex, gire hacia abajo para eliminar las gotas de la tapa, luego proceda con una dilución adicional 1:20 agregando 50 μL de la solución intermedia CFSE a 950 μL de RPMI simple para obtener una solución de trabajo 2x de 1 μM. Vortex bien y manténgalo protegido de la luz.</li>
</ol>
2. Aislamiento de PBMCs como células efectoras
NOTA: Este ensayo ha sido validado para su uso efectivo con PBMC totales de controles sanos. Sin embargo, se recomienda que el contenido de células NK se verifique con cada preparación de PBMC (Figura 1). Además, el volumen de sangre entera para la recolección se basa en la frecuencia de células NK en la sangre total periférica y esto puede variar de una persona a otra, particularmente entre donantes sanos y pacientes.
<ol>
	<li>Recolectar un mínimo de 4 mL de sangre humana entera en tubos de recolección de sangre heparinizada con sodio o litio. Almacene las muestras de sangre a temperatura ambiente en el momento de la recolección y utilícelas dentro de las 30 horas posteriores a la recolección.</li>
	<li>Diluya la sangre entera con 4 mL de PBS (es decir, el mismo volumen de PBS que la sangre entera).</li>
	<li>Agregue 4 mL de solución de gradiente de densidad (ver tabla de materiales) a un tubo cónico de 15 mL. Cubra cuidadosamente la sangre entera diluida sobre la solución de gradiente de densidad inclinando el tubo.</li>
	<li>Centrifugar a 650 x g durante 24 min con el freno apagado.</li>
	<li>Recoja cuidadosamente la capa de células mononucleares, que es la capa blanca delgada debajo de la capa superior de plasma y plaquetas, en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Lleve el volumen a 15 mL con PBS.</li>
	<li>Centrifugar a 450 x g durante 10 min con el freno puesto. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 0,5 mL de medio completo.</li>
	<li>Utilice un contador de células automatizado o un hemocitómetro para contar las células y ajuste la concentración de PBMC a 5x106 células/mL con medios completos.</li>
	<li>Compruebe el contenido de células NK mediante citometría de flujo (ver paso 4).</li>
	<li>Comience el ensayo dentro de los 30 minutos. Mantenga las células a temperatura ambiente durante un máximo de 10 minutos, o colóquelas en una incubadora humidificada con 5% deCO2 a 37 °C hasta que estén listas para usar.</li>
</ol>
3. Aislamiento de células NK como células efectoras
NOTA: Esta parte del protocolo es una alternativa al uso de PBMCs totales como células efectoras. El rendimiento típico de 4 mL de sangre entera de un individuo sano es de aproximadamente 4x105 células NK, o aproximadamente 5-15% de PBMC, aunque esta frecuencia varía entre donantes 21. Se recomienda realizar un control de pureza después del aislamiento.
<ol>
	<li>Recolectar un mínimo de 4 mL de sangre humana entera en tubos de recolección de sangre heparinizada con sodio o litio. Tome 50 μL de sangre entera para teñir como muestra previa al enriquecimiento.</li>
	<li>Añadir el cóctel de enriquecimiento a las muestras de sangre a 50 μL/mL (ver tabla de materiales). Mezclar bien e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Agregue un volumen igual de PBS + 2% de FBS para diluir la muestra y mezcle suavemente bien.</li>
	<li>Agregue 4 mL de solución de gradiente de densidad a un tubo cónico de 15 mL. Superponga cuidadosamente la muestra diluida sobre el medio de gradiente de densidad.</li>
	<li>Centrifugar a 1.200 x g durante 10 min con el freno apagado.</li>
	<li>Recoja cuidadosamente la capa de células enriquecidas en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Lave las células elevando el volumen hasta 50 mL con PBS + 2% FBS.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante y repita el lavado.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 0,5 mL de medio completo.</li>
	<li>Usando un contador de células automatizado o un hemocitómetro, cuente las células y ajuste la concentración a 5x105 células/mL. Tome 50 μL de suspensión celular purificada para teñir como muestra posterior al enriquecimiento.</li>
	<li>Mantenga las células a temperatura ambiente durante un máximo de 10 minutos, o colóquelas en una incubadora humidificada con 5% deCO2 a 37 °C hasta que estén listas para usar.</li>
</ol>
4. Inmunofenotipado para la evaluación del contenido de células NK
<ol>
	<li>Usando 50 μl de PBMC aisladas totales, sangre entera previa al enriquecimiento o células NK purificadas, tinción con anticuerpo conjugado con fluorocromo anti-CD56 como marcador de células NK. También se pueden incluir marcadores para otros tipos de células y linajes (es decir, células T CD3+, células B CD19+) para evaluar el origen de la contaminación, si la hubiera.</li>
	<li>Incubar durante 20 min a 4 °C y lavar añadiendo 2 mL de PBS + 2% de FBS.</li>
	<li>Centrifugar a 450 x g durante 5 min.</li>
	<li>En el caso de las células PBMC o NK, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 100 μL de PBS + 2% de FBS.</li>
	<li>Para muestras de sangre completa, realice la lisis de glóbulos rojos (RBC):
	<ol>
		<li>Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y volver a suspender en 2 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (31,75 g de cloruro de amonio + 4,16 g de Tris base + 6,65 g de EDTA, disuelto en 5000 mL de agua desionizada).</li>
		<li>Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Repetir el lavado dos veces, aspirar el sobrenadante y volver a suspender la muestra lisada en 100 μL de PBS + 2% FBS. 
		NOTA: La lisis de glóbulos rojos también se puede realizar antes de la tinción.</li>
		<li>Proceda con el análisis de citometría de flujo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Descongelación, cultivo y recolección de células objetivo K562
<ol>
	<li>Aliquot 10 mL de medio completo en un tubo cónico de 15 mL y dejar calentar en un baño de agua a 37 °C. Para la descongelación y el cultivo de células K562, utilice únicamente medios precalentados a 37 °C para todos los pasos.</li>
	<li>Coloque un vial de células K562 congeladas en el baño de agua a 37 °C hasta que se descongele la mayor parte.</li>
	<li>Transfiera las células K562 semidescongeladas al medio completo, precalentado a 37 °C, en el tubo cónico de 15 ml. Lave el interior del vial criogénico con algunos medios precalentados y agregue el lavado al tubo de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar a 140 x g durante 7 min con el freno puesto. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio completo.</li>
	<li>Alícuota una cantidad apropiada de suspensión celular para contar células usando un contador de células automatizado o un hemocitómetro.</li>
	<li>Ajustar la concentración a 1x10 5-2x105 células/mL y cultivar en una incubadora humidificada de CO2 al 5% a 37 °C durante al menos 2 días antes de su uso. Mantenga el cultivo en este rango de densidad durante no más de 3 meses, luego descongele una nueva alícuota. Nunca exceda una concentración celular de 1x106 células/mL en cultivo.</li>
	<li>Para su uso en el ensayo, mezcle bien el cultivo celular K562 con una pipeta serológica de 10 ml y extraiga una alícuota para contar y evaluar la viabilidad celular utilizando un contador celular automatizado o un hemocitómetro y tinción con azul de tripano.
	<ol>
		<li>Si la viabilidad es inferior al 85%, proceda con los siguientes pasos de eliminación de células muertas.
		<ol>
			<li>Agregue 15 mL de solución de gradiente de densidad a tubos cónicos de 50 mL, según sea necesario. Recoja todas las células del cultivo y superponga lentamente la suspensión celular sobre la solución de gradiente de densidad inclinando el tubo.</li>
			<li>Centrifugar a 650 x g durante 24 min con el freno desactivado. Recoja cuidadosamente la capa de células vivas en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Lleve el volumen a 50 ml con PBS.</li>
			<li>Centrifugar a 450 x g durante 10 min con el freno puesto. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio completo. Cuente las celdas y verifique la viabilidad de las celdas (como en 5.7).</li>
			<li>Cultivo en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37 °C durante al menos 2 días antes de su uso.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Recoja 5x105 células objetivo K562 y centrifuga a 140 x g durante 7 min. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la célula en 500 μL en medios con FBS al 1%.</li>
</ol>
6. Etiquetado de las células objetivo K562
NOTA: Asegúrese de que las celdas K562 estén bien resuspendidas antes de agregar la solución de trabajo CFSE.
<ol>
	<li>Pipetear 500 μL de la solución de trabajo CFSE a los 500 μL de células K562 para una concentración final de 0,5 μM. Usando la misma punta de 1000-1250 μL, mezclar inmediatamente pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 3-5 veces.</li>
	<li>Incubar en el baño de agua a 37 °C o en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37 °C durante 10 min en la oscuridad. 
	NOTA: Dado que el tiempo de retraso de equilibrio de temperatura es más largo en la incubadora en comparación con el baño de agua, es posible que sea necesario ajustar el tiempo de incubación especialmente para volúmenes > 1 mL.</li>
	<li>Apague la reacción de etiquetado con 10 mL de medio completo durante 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar las células K562 marcadas a 140 x g durante 7 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en 1 mL de medio completo.</li>
	<li>Cuente las células utilizando un contador de células automatizado o un hemocitómetro y lleve la concentración a 1x105 células/mL en medios completos.</li>
	<li>Coloque las células en una incubadora humidificada de CO2 al 5% a 37 °C hasta que estén listas para su uso. Las células pueden mantenerse a temperatura ambiente durante un máximo de 10 minutos, o en una incubadora deCO2 humidificada a 37 °C hasta que estén listas para su uso. No refrigerar.</li>
</ol>
7. Enchapado
NOTA: Si las células NK son limitantes, la concentración de las células K562 y NK puede reducirse a la mitad, de modo que la mitad de las células queden sembradas en el ensayo. El ensayo produce resultados comparables con la mitad de la cantidad de células (siempre que las proporciones se mantengan consistentes).
<ol>
	<li>Si se utilizan PBMC totales, etiquete una placa tratada con cultivo de tejidos de 96 pocillos, fondo en U, para las siguientes condiciones por pocillo: (1) Efector (E) : Objetivo (T) = 50 : 1 + IL-2 - control positivo para la citotoxicidad de las células NK; (2) E : T = 50 : 1; (3) E : T = 25 : 1; (4) E : T = 12,5 : 1; (5) E : T = 6,25 : 1; (6) T - solo células diana - control negativo para la muerte de K562; (7) E - células efectoras solamente; (8) T + Tween - Control positivo para la muerte de K562</li>
	<li>Si se utilizan células NK purificadas, etiquete una placa tratada con cultivo de tejidos de 96 pocillos, con fondo en U, para las siguientes condiciones por pocillo: (1) Efector (E) : Objetivo (T) = 5: 1 + IL-2 - control positivo para la citotoxicidad de las células NK; (2) E : T = 5 : 1; (3) E : T = 2,5 : 1; (4) E : T = 1,25 : 1; (5) E : T = 0,625: 1; (6) T - solo células diana - control negativo para la muerte de K562; (7) E - células efectoras solamente; (8) T + Tween - control positivo para la muerte por K562</li>
	<li>Añada 100 μL de medio completo a las condiciones 3, 4, 5, 6, 7. Para este y todos los pasos posteriores, (recomendado) utilice una pipeta multicanal.</li>
	<li>Añadir 100 μL de células efectoras (PBMC a 5x106 células/mL o células NK purificadas a 5x105 células/mL) a las condiciones 1, 2, 3. Agregue celdas efectoras para las condiciones 4-7 por dilución en serie. No cambie las puntas de una condición a otra.
	<ol>
		<li>Mezcle la condición 3, tome 100 μL y transfiéralo a la condición 4.</li>
		<li>Mezcle la condición 4, tome 100 μL y transfiera a la condición 5.</li>
		<li>Mezclar la condición 5, tomar 100 μL y transferir a la condición 7; La condición 6 no tiene células efectoras.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Añadir 100 μL de solución de trabajo preparada 2x 0,2% Tween a la condición 8 (concentración final: 0,1% Tween-20); la condición 8 no tiene células efectoras.</li>
	<li>Añadir 30 μL de solución de trabajo de IL-2 a la condición 1. La IL-2 debe añadirse a la suspensión de la célula efectora antes de la adición de la suspensión de la célula diana (concentración final: 27 UI/mL).</li>
	<li>Agregue 100 μL de células diana (células K562 marcadas a 1x105 células/mL) a las condiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8. La condición 7 no tiene celdas objetivo.</li>
	<li>Mezclar todos los pocillos con una pipeta multicanal y centrifugar la placa a 120 x g durante 2 min.</li>
	<li>Incubar en una incubadora humidificada deCO2 a 37 °C durante 4 h. Al final de la incubación, coloque la placa en hielo y proceda a la tinción de viabilidad dentro de los 30 minutos.</li>
</ol>
8. Tinción para viabilidad y adquisición
<ol>
	<li>Prepare la tinción de células muertas (ver tabla de materiales) añadiendo 3 μL de la solución madre de 5 μM a 600 μL de PBS.</li>
	<li>Añada 50 μL de tinción de células muertas diluida a cada pocillo para obtener un volumen final de 250 μL y una concentración final de 0,005 μM. Mezclar bien con una pipeta multicanal.</li>
	<li>Proceda con el análisis de citometría de flujo. Usando un citómetro de flujo, recoja al menos 1.000 eventos en la puerta de la célula objetivo (Figura 2) para obtener resultados estadísticamente significativos.</li>
</ol>

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<li>Zons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+europium+and+chromium+release+assays%3A+cytotoxicity+in+healthy+individuals+and+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).</li>
<li>Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+sex%2C+menstrual+cycle%2C+and+oral+contraceptives+on+the+number+and+activity+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells.</a> Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).</li>
<li>Laue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+NK+cell+function+in+obese+healthy+humans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Obes%22%5BJournal%5D)">Altered NK cell function in obese healthy humans.</a> BMC Obes. 2, 1(2015).</li>
<li>Hazeldine, J., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+ageing+on+natural+killer+cell+function+and+potential+consequences+for+health+in+older+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults.</a> Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflictos de interés financiero.

El método descrito aquí proporciona una alternativa sencilla y rentable para el ensayo de lanzamiento tradicionales 51Cr para evaluar la actividad citotóxica de células NK. Este método es sensible, reproducible y menos desperdiciador de tiempo que los anteriores métodos estándar, como CRA y puede ser utilizado para ambas clínicas y aplicaciones de investigación.
Mientras que el ensayo trabaja con total PBMCs y enriquecida de las células NK, la opción de usar PBMCs sin la necesidad d...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56191/a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk">A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity</a>. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
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<img alt="Target cell death vs effector ratio graph; healthy donor vs patient comparison, percent cell death." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">
to:
<img alt="Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">

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Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Células de naturales del asesinas (NK) son un subconjunto sofisticado de linfocitos innatos humanos críticamente implicados en la eliminación de las células viralmente infectadas, las células transformadas y otras amenazas patógenas 1,2. Casa de gránulos líticos de la célula NK proteínas citotóxicas, como perforin y granzymes. Tras la activación, las células NK forman una interacción compleja con sus objetivos conocidos como sinapsis inmunológica, por el que estas moléculas citolíticas se liberan localmente, dando por resultado la lisis de la célula objetivo directo y apoptosis, junto con liberación de citoquinas y quimioquinas y en última instancia en la inducción de un inflamatorio estado 1,3,4.
Activación de la célula NK involucra una compleja cadena de activación y las interacciones inhibitorias entre NK célula receptores y ligandos expresadas en la superficie de las células de la blanco, formando un sistema fuertemente regulado. Uno de los mecanismos más estudiados de la activación de células NK es la "falta". De hecho, falta de detección de clase en que mayor complejo de histocompatibilidad (MHC), o moléculas de leucocito humano antígeno (HLA), infectados o transformado citotoxicidad celular de células desencadenantes NK. Tumorales y células infectadas por virus generalmente regular a la baja estos antígenos para escapar de la inmunidad mediada por células T, convirtiéndose en principal NK célula objetivos 1,3,4.
Evaluación de la función de la célula NK se categoriza principalmente en degranulación o citotoxicidad ensayos. Sin embargo, ensayos de degranulación, como detección de citometría de flujo del degranulation asociados marcador CD107a, sólo son indicativos de la activación de células NK y no de su función final, la muerte directa de las células objetivo 5,6,7,8. Por lo tanto, esta limitación ha dibujado los investigadores ensayos de citotoxicidad como alternativa más directa y más revelador.
El largo plazo "gold standard" para evaluar la actividad citotóxica mediada por células de las células T y NK es el ensayo de liberación de cromo (CRA). CRA implica radiactivo etiquetado de células diana con 51Cr y co los incuban con las células efectoras. Este ensayo se empapa en el principio que lisis celular resulta en la liberación de proteína determinada 51Cr en el sobrenadante, que puede ser medido contando gamma. Este ensayo, al mismo tiempo eficaz, es problemático para una variedad de razones: altos costos de material, manejo y disposición de radiactivo 51Cr, lanzamiento espontáneo de 51Cr y difícil estandarización - lo que en conjunto práctico 9,10.
Un número de ensayos no radiactivo, con etiquetado fluorescente, liberación de enzima e incluso bioluminiscencia, desde entonces se han desarrollado como alternativas a la CRA 11,12,13,14. Aquí describimos un método basado en la citometría de flujo para medición de NK célula actividad citotóxica en las células K562 objetivo simple, sensible y reproducible. Células K562 son una células erythroleukemic humana la línea con menor expresión de HLA clase I y una mayor expresión de ligandos para receptores NK activatory, que los hace particularmente susceptibles a NK Citotoxicidad mediada por células 15. En este ensayo, las células K562 están marcadas previamente con carboxyfluorescein diacetato succinimidyl éster (CFSE) y cultivan conjuntamente en diferentes proporciones con cualquiera células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o purificaron de células NK 1. CFSE es un colorante fluorescente estable, proteínas de Unión que permite la discriminación de las células de la blanco del efectoras NK células 16,17. Después de la incubación Co, una mancha de ácido nucleico, específicamente impregnando la membrana de las células muertas, se utiliza para identificar las células de la blanco matado (véase tabla de materiales). Las muestras entonces se adquieren en un citómetro de flujo para determinar el porcentaje de muertos (es decir, mancha +) CFSE + células diana.
Este ensayo puede utilizarse como una investigación rutinaria de diagnóstico para defectos monogénicas, que afectan el compartimiento de células NK, que son aproximadamente 30 defectos conocidos que causan deficiencia de células NK ya sea funcional o clásica, y para el lymphohistiocytosis hemophagocytic primario o secundario. También es útil para investigar la actividad de células NK en pacientes con infecciones virales herpes recurrente, grave, para evaluar la reconstitución inmune tras el trasplante de células hematopoyéticas o post inmunomoduladores terapia 18,19,20y de una serie de aplicaciones de la investigación básica.

<table><tbody><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (1x, sin Ca2+ y Mg2+)</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino inactivado por calor</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td>Solución madre a 10.000 U/mL</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>R& D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>Liofilizado a partir de un 0,2 &mu; m solución filtrada en acetonitrilo y TFA con BSA como proteína transportadora. Reconstituir con 500 ul a 100 &mu; g/mL en ácido acético estéril de 100 mM que contiene al menos un 0,1% de albúmina sérica bovina (2,1x10E6 UI/ml)</td></tr><tr><td>Células K562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>Línea celular cancerosa&nbsp;</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular T-75</td><td>Corning</td><td>431464</td><td></td></tr><tr><td>Kit de proliferación celular CFSE</td><td>Life Technologies (CellTrace)</td><td>C34554</td><td>Vial Reconstituir I con DMSO de 18 ul para preparar una solución madre de 5 mM. No congelar/descongelar.</td></tr><tr>La solución madre <td>de Sytox Red</td><td>Life Technologies</td><td>S34859</td><td>se proporciona a las 5 &mu; M en 1 mL DMSO. La solución de DMSO puede someterse a múltiples ciclos de congelación-descongelación sin degradación del reactivo.</td></tr><tr><td>Tubos de extracción de sangre con heparina de sodio/litio</td><td>BD</td><td>02-687-95</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos con fondo en</td><td>U Pipetas</td><td></td> serológicas Corning CLS3897 <td></td></tr> BD <tr><td></td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de fondo redondo (5 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>14959-5</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubo cónico de polipropileno</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubo cónico de polipropileno</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Depósito de reactivos</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de enriquecimiento de células NK</td><td>humanas StemCell Technologies (RosetteSep)</td><td>15065</td><td></td></tr></tbody></table>

un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células nk humanas

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Dentro del sistema inmune innato, los linfocitos efectores conocidos como células de naturales del asesinas (NK) juegan un papel esencial en la defensa del huésped contra las células aberrantes, especialmente eliminando tumoral y viralmente infectadas las células. Aproximadamente 30 defectos monogénicas conocidos, junto con una serie de otras condiciones patológicas, deficiencia funcional o clásico NK célula, que se manifiesta en reducción o ausencia de actividad citotóxica. Históricamente, se ha investigado la citotoxicidad con métodos radiactivos, que son engorrosos, costosos y potencialmente peligrosos. Este artículo describe un método basado en la citometría de flujo aerodinámico, clínicamente aplicable para cuantificar la actividad citotóxica de células NK. En este ensayo, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o preparaciones de células NK purificadas son co se incubó a relaciones diferentes con una línea de células de tumor objetivo sabida que es sensible a la citotoxicidad mediada por células NK (NKCC). Las células diana son las marcadas con un colorante fluorescente para permitir la discriminación de las células efectoras (células NK). Después del período de incubación, las células diana mataron son identificadas por una mancha de ácido nucleico, que impregna específicamente células muertas. Este método es susceptible de diagnóstico y aplicaciones de investigación y, gracias a las capacidades de múltiples parámetros de la citometría de flujo, tiene la ventaja añadida de que potencialmente permite un análisis más profundo del fenotipo de la célula NK y la función.

Antes de establecer el ensayo, se recomienda evaluar contenido de células NK en la población de efector de elección. La figura 1 muestra una típica coloración CD56 antes (azul claro) y después de enriquecimiento de células NK (rojo). Las células NK constituyen hasta un 15% de PBMCs y deben ser por lo menos 80% de pureza después de enriquecimiento.
El análisis cytometric del flujo en este ensayo impl...

Aquí se muestra un método basado en la citometría de flujo para determinar cuantitativamente la actividad citotóxica de las células de asesino naturales humanas.

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la actividad citotóxica de las células NK humanas. Este método puede utilizarse para monitorear pacientes con deficiencia de células NK funcional o clásica. Las principales ventajas de esta técnica basada en citometría de flujo son su sensibilidad, reproducibilidad y mayor rapidez en comparación con los métodos estándar de evaluación de la función de las células NK, como el ensayo de liberación de cromo radiactivo.Este método puede utilizarse para probar terapias novedosas dirigidas a las células NK, así como para realizar análisis citométricos de flujo multiparamétricos en profundidad de la biología de las células NK, análisis que anteriormente no eran alcanzables. Comience utilizando la separación por gradiente de densidad para aislar las células mononucleares de la sangre periférica, o PBMC, a partir de muestras de sangre total según protocolos estándar. El uso de PBMC en lugar de células NK purificadas es altamente beneficioso al trabajar con especímenes clínicos.Diluya las células aisladas hasta una concentración de cinco veces 10 a la sexta células por mililitro en medio completo y recolecte inmediatamente las células diana K562 mediante centrifugación. Re-suspenda cinco veces 10 a la quinta células K562 en 500 microlitros de medio fresco suplementado con un uno por ciento de FBS. A continuación, marque las células diana con 500 microlitros de la solución de trabajo de CFSE y mezcle suavemente la suspensión celular pipeteando de tres a cinco veces.Después de 10 minutos a 37 grados Celsius protegido de la luz, detenga la reacción de marcado con 10 mililitros de medio completo durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Al final de la incubación de detención, recoja las células por centrifugación y re-suspenda la paleta de células diana marcadas en un mililitro de medio completo para el recuento. Luego, diluya las células hasta una concentración de un por diez a la quinta células por mililitro de medio completo fresco y coloque las células diana en un incubador húmedo a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono.Para un ensayo exitoso, reduzca al mínimo el estrés de las células diana y pruebe las células efectoras lo antes posible después de su recolección. Dentro de los 30 minutos posteriores a la marcación de las células diana, marque una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con fondo en U según la tabla. A continuación, agregue 100 microlitros de medio completo a los pocillos con las relaciones de células efectoras a células diana de 25 a 1, 12,5 a 1 y 6,25 a 1, así como a los pocillos que contienen solo células diana y a los que contienen solo células efectoras.Añada 100 microlitros de células efectoras a los pozos de control de citotoxicidad y a los pozos con relaciones de células efectoras a células diana de 50:1 y 25:1. Luego, comenzando con el pozo de relación 25:1 de células efectoras a células diana, transfiera 100 microlitros de células al pozo con la siguiente concentración más baja de relación celular para los dos siguientes pozos, saltándose los pozos que contienen solo células diana, mezclando bien entre cada transferencia celular y añadiendo los últimos 100 microlitros de células a los pozos que contienen únicamente células efectoras. Añada 100 microlitros de la solución de trabajo 2X al 0,2 por ciento de Tween al pozo de control positivo de muerte de K562 con solo Tween.Agregue 30 microlitros de la solución de trabajo del vial dos a los pozos de control positivo de citotoxicidad de las células NK. Luego, agregue 1 × 10⁵ células diana K562 marcadas por mililitro en 100 microlitros de medio completo a todos los pozos, excepto a los pozos con solo células efectoras. Una vez que todas las células hayan sido sembradas, mezcle todos los pozos con la pipeta multicanal.Sequiar las células mediante una breve centrifugación y colocar la placa en el incubador de cultivo celular durante cuatro horas. Al final de la incubación, colocar la placa sobre hielo o sobre una plataforma fría, y añadir 50 microlitros de tinción recién preparada para células muertas a cada pocillo. A continuación, mezclar suavemente todos los pocillos y analizar las células mediante citometría de flujo.El análisis por citometría de flujo de CSFE y la tinción de células muertas tras cuatro horas de cultivo en frío, como se acaba de demostrar, revela que las células en los pocillos con solo células diana presentan una muerte celular del 15 % o menor. No se detecta señal de CSFE en los pocillos con solo células efectoras si se observa menos del cinco por ciento de muerte celular en estos pocillos. Mientras tanto, la muerte celular en los pocillos de muerte de células diana mediada por Tween es típicamente superior al 85 %. En pacientes con un defecto en la función de las células NK, se observa una actividad citolítica reducida en la mayoría o en todas las proporciones ensayadas en comparación con individuos sanos, lo que demuestra que las células NK de estos pacientes exhiben una reducción diferencial de la citotoxicidad que se correlaciona con una disminución en la relación de células efectoras a células diana.Una vez dominada, esta técnica puede completarse en seis horas y media, incluyendo las dos horas de preparación y siembra, cuatro horas de incubación y 30 minutos de adquisición. Al intentar este procedimiento, es importante recordar preparar las células diana y efectoras en paralelo para minimizar el tiempo de retraso entre la preparación celular y el inicio de la co-incubación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la actividad citotóxica de las células NK humanas frente a células diana marcadas con fluorescencia mediante citometría de flujo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describe un método para expandir de manera eficiente y purificar una gran cantidad de células NK humanos y evaluar su función.

Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

Este video demuestra la actividad lítica de las células asesinas naturales contra las células diana teñidas con fluorescencia. El método permite la medición de la citotoxicidad inducida por células NK mediante la tinción de células muertas y el uso de un citómetro de flujo para cuantificar las células diana vivas y muertas.

Ensayo de citotoxicidad mediada por células asesinas naturales Preparación de muestras para análisis de citometría de flujo

Este protocolo describe un ensayo de citotoxicidad sensible basado en células. Al enumerar la disminución de la frecuencia de linfocitos T CD4+ diana vivos en presencia de un número cada vez mayor de linfocitos T CD8+ efectores, este ensayo permite la evaluación directa de la actividad citolítica de los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno.

Ensayo de citometría de flujo basado en células para medir la actividad citotóxica

Un método sencillo y fiable se describe aquí para analizar un conjunto de funciones de las células NK, tales como la desgranulación, de citoquinas y la producción de quimioquinas dentro de los diferentes subconjuntos de células NK.

Ensayo de citometría de flujo de base para la supervisión de funciones de las células NK

Este trabajo describe un flujo de trabajo avanzado para la determinación precisa y rápida del recuento de células NK (Natural Killer) y la citotoxicidad de las células NK en muestras de sangre humana.

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

La evasión de la erradicación mediada por células mortales por asesinos naturales (NK) por las células cancerosas es importante para la iniciación y progresión del cáncer. Aquí, presentamos dos protocolos no basados en la radiactividad para evaluar la citotoxicidad mediada por células NK hacia las células tumorales hepáticas. Además, se presenta un tercer protocolo para analizar la migración de células NK.

Medición de la citotoxicidad y migración mediadas por células asesinas naturales en el contexto de las células tumorales hepáticas

Aquí se describe un protocolo para estudiar los eventos impulsados por FcγRIIIa por anticuerpos terapéuticos en células asesinas naturales humanas. Esta plataforma de estimulación artificial permite el interrogatorio de funciones efectoras aguas abajo, como la degranulación, la producción de quimiocinas / citoquinas y las vías de señalización mediadas por las porciones FcγRIIIa y Fc de anticuerpos involucrados en la unión.

Evaluación de los eventos de células asesinas naturales humanas impulsados por la participación de FcγRIIIa en presencia de anticuerpos terapéuticos

Este protocolo describe un método sin etiquetas para el análisis rápido de células individuales del recuento y la actividad de las células asesinas naturales (NK) utilizando tecnología de imágenes de sombra sin lentes. Este método cuantifica los cambios morfológicos en células NK individuales mediante el análisis computarizado de sus patrones de difracción.

Plataforma de imágenes sin lentes desplegable en campo para un análisis rápido sin etiquetas de la activación de células asesinas naturales

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo estandarizado in vitro. para la medición consistente de la citotoxicidad natural, mediada por receptores de antígenos quiméricos y dependiente de anticuerpos en células humanas natural killer mediante imagen de células vivas y citometría de flujo.

Cuantificación de la citotoxicidad de células NK potenciada por receptores de antígenos quiméricos y anticuerpos terapéuticos mediante imagen de células vivas y citometría de flujo

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Aprende a evaluar la citotoxicidad de células NK humanas mediante citometría de flujo. Este método sensible y reproducible permite diagnosticar deficiencias de NK y probar terapias dirigidas sin radiactividad.

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

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