Name: Desactivaciones reversibles inducida por enfriamiento a estudiar contribuciones corticales a la memoria de obstáculo en el gato caminando (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprende a usar desactivaciones reversibles por enfriamiento para estudiar el papel de la corteza parietal en la memoria de obstáculos durante la locomoción en gatos. Este método permite evaluar contribuciones corticales con control individual.

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Agradecemos el apoyo de los institutos canadienses de investigación en salud, ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC) y la Fundación de Canadá para la innovación. C.W. fue apoyado por un Alexander Graham Bell Canadá postgrado becas (NSERC).

Todos los procedimientos se llevaron a cabo en cumplimiento de la guía del Consejo de investigación nacional para el cuidado y uso de animales de laboratorio (octava edición, 2011) y el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal guía para el cuidado y uso de animales experimentales (1993) aprobado por la Subcomisión de uso Animal de Universidad de Ontario Occidental del Consejo Universitario en el cuidado Animal.
El siguiente procedimiento se puede aplicar a experimentos que estudian las contribuciones corticales para control de aparato locomotor en el gato caminando.
1. el aparato
<ol><li>Construir el aparato para evaluar memoria de obstáculo. Nota: El aparato consiste en un 2,43 m largo, 29 cm ancho paseo rodeado de altos muros acrílico transparente de 18 cm (figura 1). Una ranura estrecha a la mitad a lo largo del aparato permite un 25,8 cm ancho x 3 mm espesor obstáculo se levantó en o fuera de la pasarela usando una palanca de montado debajo de la superficie que camina.</li>
	<li>Para asegurar que la atención del animal se mantiene sobre la alimentación, evitar el uso de la mano para subir o bajar el obstáculo. En su lugar, el obstáculo puede ser subir o baja con pierna del experimentador para mover la palanca por debajo de la pasarela, que permite al experimentador seguir alimentando el animal.</li>
	<li>Mantener adecuadamente el sistema de palanca para asegurar que el obstáculo puede ser levantado o bajado silencioso.</li>
	<li>Utilizar una plataforma pequeña elevada (23 cm largo x 23 cm ancho x 16 cm de alto) sobre que alimento blando se coloca, para guiar los movimientos del animal.</li>
	<li>Registrar todos los ensayos con una cámara de ethernet (54 fotogramas/s) montada sobre un trípode de 1,85 metros de la línea media de la calzada.</li>
</ol>2. capacitación procedimientos
Nota: Para la adquisición de datos exitosa, un período de entrenamiento anterior a la prueba conductual garantiza que cada animal es adecuadamente aclimatado a la sala de pruebas y aparatos. La exposición repetida a un entorno nuevo se ayuda a reducir comportamientos estresantes sorprendentes u otros.  Aclimatación puede variar entre los animales y puede requerir 1-2 meses de entrenamiento. Sesiones de aclimatación inicial pueden ser hasta 5 min en longitud dependiendo del enfoque y la motivación del animal para comer. Sesiones posteriores deben procurar aumentar la duración de tiempo que el animal está motivado para trabajar (típicamente alrededor 20-25 min).
<ol><li>Adquirir maduro (> 6 meses de edad) los gatos domésticos de pelo corto de un criador comercial laboratorio de cualquier peso o sexo. Nota: Motivación para trabajar para el alimento y una disposición cooperativa comprenden los criterios de selección al considerar que los animales deben ser incluidos en el estudio.</li>
	<li>Adapte cada animal al uso de un arnés que se une una correa larga de 1 m. Ancla de la correa a un estante encima de la pasarela sobre el punto medio de la calzada. Nota: Esto permite al animal a caminar a lo largo de la porción central del aparato sin ninguna tensión, fomentando con ello el animal a permanecer dentro de esta porción del aparato. Establecimiento de estos límites es útil para trabajar con un sujeto en prueba de movimiento.</li>
	<li>Coloque el animal en la calzada, lo que le permite comer de la plataforma sobre la cual se coloca comida blanda. Nota: Uno de los objetivos de este entrenamiento inicial es asegurar que el animal sigue fácilmente la plataforma de alimentos cuando se movió hacia delante y puede caminar cómodamente con el arnés y la correa. El uso de alimentos blandos como refuerzo positivo estimula al animal a permanecer centrado a lo largo de cada sesión de entrenamiento o prueba y promueve un ambiente de trabajo cómodo.</li>
	<li>Asegúrese de que el animal es cómodo con el manejo, incluyendo casos donde el animal debe moverse a la zona de salida de la pasarela.</li>
</ol>3. comportamiento de formación y protocolos
Nota: La memoria de obstáculo se evalúa en dos paradigmas: una tarea de memoria visual dependiente obstáculo y una tarea de memoria táctil-dependiente del obstáculo. Ambos paradigmas deben utilizarse durante la formación inicial y las pruebas subsecuentes.
<ol><li>
Memoria de obstáculo visual
	<ol>
<li>Para evaluar la memoria de obstáculo visual, levantar el obstáculo sobre el paseo (figura 2A). Coloque la plataforma en el otro lado del obstáculo. Coloque el animal en la zona de salida de la pasarela.</li>
		<li>Permitir que el animal a la comida, paso a paso sobre el obstáculo con sólo sus patas delanteras para comer de la plataforma.</li>
		<li>Mientras el animal come, baje el obstáculo que se convierte al ras de la calzada para evitar que algunas entradas más visuales o táctiles.</li>
		<li>Tras un periodo de retardo variable, mover el alimento hacia delante otra vez para animar al animal a volver a caminar; este retraso puede ser inferior a 1 s a más de 2 minutos.</li>
		<li>Lo importante es realizar los ensayos donde el obstáculo existe para evitar la habituación al obstáculo y al desarrollo de una respuesta de evitación aprendida. En dichos ensayos ausencia de obstáculo visuales, asegúrese de que el obstáculo no está levantado sobre el paseo antes de colocar el animal en la zona de salida de la pasarela.</li>
		<li>Observe hindleg en ensayos obstáculo presente y ausencia de obstáculo para verificar comportamientos típicos del aparato locomotoras y memoria de obstáculo visual intacto antes de la refrigeración. Asegúrese de que el animal puede despejar el obstáculo sin contacto, y dicha versión de las cuatro patas es significativamente elevado en ensayos de obstáculo presente. Nota: Viendo videos de los ensayos de entrenamiento puede ayudar a esta verificación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Memoria táctil obstáculo
	<ol>
<li>Para evaluar la memoria táctil de obstáculo, asegúrese de que el obstáculo no está levantado sobre el paseo antes de colocar el animal en la zona de salida de la calzada (figura 2B).</li>
		<li>Permitir que el animal a caminar hacia la plataforma de alimentos colocada en el extremo de la ranura del obstáculo.</li>
		<li>Como el animal come, levantar el obstáculo en la calzada bajo el plato de comida, evitando cualquier entrada visual del obstáculo.</li>
		<li>Como el alimento se mueve hacia adelante, tenga en cuenta que el animal debe póngase en contacto con el obstáculo con sus patas delanteras antes de caminar sobre él.</li>
		<li>Permitir que el animal a seguir comiendo mientras a caballo entre el obstáculo entre su delantera y patas. Durante este tiempo, baje el obstáculo para que sea al ras de la calzada para evitar que algunas entradas más visuales o táctiles.</li>
		<li>Tras un periodo de retardo variable, mueva el alimento remite una vez más a los animales para continuar caminando.</li>
		<li>Lo importante es realizar los ensayos donde el obstáculo está ausente y se produce sin contacto de la pata delantera para evitar la habituación al obstáculo y al desarrollo de una respuesta de evitación aprendida.<ol>
<li>En estos ensayos ausencia de obstáculo táctiles, enfoque animal y comer desde la plataforma de alimentos, como se describe en el paso 3.2.1. Sin embargo, subir y bajar el obstáculo (paso 3.2.2) antes de pasar los alimentos hacia adelante en el paso 3.2.3. Asegúrese de que un período de retraso similar donde el animal puedo seguir comiendo (paso 3.2.4) precede la continuación final de locomoción (paso 3.2.5).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Observar la hindleg en los ensayos obstáculo presente y ausencia de obstáculo para verificar los comportamientos normales de aparato locomotoras y memoria de obstáculo visual intacto antes de la refrigeración.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. vídeo análisis
Nota: Para evaluar la memoria de obstáculo, análisis durante la formación inicial y las pruebas subsecuentes después de la implantación de bucle de enfriamiento implican cuantificar la altura de pico, espacio libre de paso y la distancia horizontal entre el dedo del pie y el obstáculo en el pico de cada paso para paradigmas visuales y táctiles (figura 2).
<ol><li>Analizar los videos mediante secuencias de comandos personalizadas escritas.</li>
	<li>Para cada ensayo, seguimiento de cada pie por marcar la posición del dedo del pie más cercano a la cámara a lo largo de cada paso.</li>
	<li>Medir la altura de pico como la distancia perpendicular entre el dedo del pie y la superficie de la calzada en el punto más alto en la trayectoria de cada paso (figura 2).</li>
	<li>En los ensayos de obstáculo presente, mida el paso como la altura de paso directamente sobre la ranura del obstáculo restada por la altura del obstáculo.</li>
	<li>Además, medir la distancia horizontal entre el dedo del pie y el obstáculo en el pico de cada paso en los ensayos de obstáculo presente.</li>
	<li>Confirmar que las capacidades de memoria de obstáculo están intactas antes de la implantación de bucle de enfriamiento verificando que es elevada la altura de pico en los ensayos de obstáculo al presente en comparación con la versión en los juicios de ausencia de obstáculo.</li>
</ol>5. implantación de bucle (Cryoloop) de enfriamiento
<ol><li>Implante cryoloops bilateral sobre áreas 5 y 7 según procedimientos quirúrgicos previamente divulgados8 (figura 3).</li>
	<li>En Resumen, para cada hemisferio, realizar una craneotomía y durotomía de Horsley-Clarke coordenadas20 A15 a A25 para exponer la Unión de los surcos laterales y ansate.</li>
	<li>Posición individual de enfriamiento bucles en forma de tubo hipodérmico de acero inoxidable de calibre de 23 con el lazo en contacto directo con la superficie cortical del área parietal 5 o 7.</li>
	<li>Asegure la base de cada cryoloop al cráneo con acrílico dental anclado a los tornillos de acero inoxidable.</li>
	<li>Cerrar las craneotomías con acrílico dental adicional; establecer los márgenes de la piel hasta los bordes de acrílico y sutura juntos.</li>
</ol>6. Protocolo de refrigeración cortical
<ol><li>
Disposición experimental Nota: Antes de llevar el animal a la sala de pruebas, el circuito de refrigeración está preparado y probado. El circuito de refrigeración consta de un depósito de metanol con un tubo de entrada (3,2 mm D.E., 1,6 mm de diámetro interior), una bomba de pistón reciprocante y hielo seco baño conectado mediante tubos de politetrafluoretileno (1,6 mm D.E., 0,5 mm de diámetro interior; Figura 4). Además, se requiere un termómetro digital.<ol>
<li>Añadir 500 cc seco hielo a 200 mL de metanol en el baño de hielo. Extremos de tubería ajuste cómodamente sobre la entrada y salida de un maniquí cryoloop para completar el circuito de refrigeración.</li>
		<li>Conecte el conector del termopar a un termómetro digital para temperatura continua de control usando un cable compuesto por dos conectores de termopar masculino y un alambre del termopar. Asegúrese de que la longitud de este cable es suficiente para alcanzar la cabeza del animal cuando se enchufa un extremo en el termómetro.</li>
		<li>Encienda la bomba de pistón con el interruptor. Nota: Metanol debe elaborarse desde el depósito, pasado a través de la bomba para el baño de hielo seco donde el metanol que fluye en la tubería será ser enfriado a-75 ° C. El metanol frío luego salir el baño de hielo y atraviesan la cryoloop adjunto antes de regresar al depósito de metanol.</li>
		<li>Asegurar que la bomba, longitud de la tubería en el baño de hielo y longitud de la tubería del baño de hielo a los lazos simulados son óptimas tales que la temperatura simulada cryoloop puede alcanzar un estado estacionario alrededor de-5,00 ° C. Nota: Las temperaturas en esta configuración inicial son a menudo suficientes para alcanzar las temperaturas de prueba de 3.0 ± 1.0 ° C cuando se utiliza el mismo sistema para enfriar un cryoloop implantado. Dificultad en lograr suficiente enfriamiento puede resolverse ajustando la velocidad de la bomba, aumentando la longitud de la tubería sumergida en el baño de hielo, o reduciendo al mínimo la longitud de la tubería del baño de hielo a la cryoloop.</li>
		<li>Si es necesario, alargar una sección de tubería roscando el extremo del tubo a través de una conexión de extremo de tubo y brida en el extremo del tubo con una herramienta de rebordear. Fije el tubo de una longitud deseada con una brida de manera similar utilizando un conector.</li>
		<li>Verificar que todas las conexiones estén bien ajustadas y que no haya fugas están presentes. Una vez que esté satisfecho con la configuración inicial, apagar la bomba y retire la cryoloop dummy; el circuito está preparado ahora para un animal de prueba.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pruebas de comportamiento
	<ol>
<li>Coloque el animal en el aparato de prueba. Deslice el arnés sobre la cabeza y asegure la correa tanto como sea posible en el animal. Coloque la correa.</li>
		<li>Retire la tapa protectora de la cryoloop implantado para exponer los tubos de entrada y salida. Ajuste de extremos de la tubería perfectamente en los tubos de entrada y salida de la cryoloop. Conecte el enchufe del termopar para el termómetro digital.</li>
		<li>Comenzar la sesión de evaluación con una visual (paso 3.1) o táctiles (paso 3.2) obstáculo memoria ensayo. Seguir con pruebas adicionales de los cuatro tipos (visual obstáculo presente, visual ausencia de obstáculo, táctil obstáculo presente, táctil obstáculo-ausente) al azar. Nota: Una sesión de prueba típica consiste en un bloque 'caliente' de los ensayos, donde se observa la evitación del obstáculo guiado por la memoria en ausencia de refrigeración para establecer medidas de referencia.</li>
		<li>Encienda la bomba de pistón y espere la cryoloop alcancen una temperatura de 3.0 ± 1.0 ° C (1-2 min). A continuación, ejecutar un bloque 'cool' de los ensayos después de encendida la bomba de pistón. Durante este bloque de ensayos, si es necesario, evaluar las contribuciones de la zona enfriada a memoria-dirigida. Asegurar que se mantenga la temperatura de la cryoloop a 3.0 ± 1.0 ° C a lo largo de todo el bloque. Nota: Los cuatro tipos de ensayo deben ser entremezclados aleatoriamente a lo largo del bloque.</li>
		<li>Ejecutar un bloque de 'recalentar' final de los ensayos después de haber apagado la bomba de pistón, y la cryoloop ha regresado a su temperatura original. Nota: Comportamiento escalonamiento de línea de base se restablece durante este bloque. Otra vez, los cuatro tipos de ensayo deben ser entremezclados aleatoriamente a lo largo del bloque.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Limpiar
	<ol>
<li>Cuando concluye la prueba conductual, quitar el tubo de los tubos de entrada y salida. Ser consciente de metanol residual que puede gotear de los extremos de la tubería y puede irritar al animal.</li>
		<li>Asegúrese de que se sustituye la tapa de protección. Quite la correa y el arnés antes de regresar el animal a la Colonia. Recorte los extremos de la tubería (3-4 mm) usando un cortador de tubo para evitar conexiones con fugas al día siguiente de la prueba.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. verificar el grado de enfriamiento
<ol><li>Al final de la prueba conductual, confirman que el grado de desactivación está restringido a la región de la corteza directamente debajo de cada cryoloop utilizando técnicas previamente divulgados8. Nota: Esto puede ser verificado con la termoclina asignación12 o con un térmico de cámara13,14,19.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El paradigma descrito emplea desactivaciones inducida por enfriamiento de áreas corticales discretas usando la cryoloop para estudiar la locomoción obstáculo memoria-dirigida en el gato. Los paradigmas de la memoria de obstáculos visuales y táctiles son bastante simples para animales ejecutar como explotan naturalistas comportamientos locomotores que se producen con el mínimo esfuerzo cuando un animal está motivado para seguir una fuente de alimentación móvil. Así, la mayor parte del período de formación se dedica a acli...

En terreno desigual, naturalista, información sensorial sobre un obstáculo, que puede ser adquirido a través de la visión o el tacto, puede modificar rápidamente locomoción para la evitación. Esta coordinación cuidadosa de los movimientos paso a paso involucra varias regiones corticales1,2. Por ejemplo, las áreas de la corteza de motor3,4 y corteza parietal5,6,7 han sido implicadas en tareas complejas locomotoras como la evitación del obstáculo. En los animales cuadrúpedos, modulaciones de paso necesarios para la evitación del obstáculo deben extenderse a las patas delanteras y posteriores. Si se retrasa la locomoción hacia adelante entre el franqueamiento de obstáculos de la pata delantera y hindleg (que puede presentarse como un animal peldaños cuidadosamente a través de una presa de acecho entorno complejo y naturalista), información sobre el obstáculo en la memoria se utiliza para guiar se reanuda el hindleg paso a paso sobre el obstáculo una vez caminando.
Técnicas experimentales encaminadas a desactivar zonas corticales discretas pueden utilizarse para estudiar las contribuciones corticales a la locomoción de obstáculo guiado por la memoria. Desactivación cortical inducida por enfriamiento proporciona un método reversible, confiable y reproducible para evaluar contribuciones corticales a una abierta conducta8. Cryoloops de tubería de acero inoxidable son en forma específica para el área cortical de interés, asegurando desactivación altamente selectiva y discreta de loci. Una vez implantado, metanol frío bombeado a través del lumen de una cryoloop enfría la región de la corteza directamente debajo del bucle a < 20 ° C. Debajo de esta temperatura crítica, se inhibe la transmisión sináptica en la región de la corteza directamente debajo del lazo. Dicha desactivación se puede revertir simplemente por dejar el flujo de metanol. Este método se ha utilizado para estudiar las contribuciones corticales de procesamiento sensorial y comportamientos9,10,11,12,13,14,15 , 16 , 17, así como el control motor de los movimientos de ojo sacádicos18 y memoria-dirigida obstáculo locomoción19.
El propósito de este protocolo es utilizar bajas reversibles inducida por enfriamiento para evaluar la participación de las áreas corticales parietales coordinación locomotriz en el gato. Específicamente, locomoción obstáculo memoria-dirigida fue examinado con o sin corteza parietal activa. Estos métodos se han utilizado para demostrar con éxito el papel del área parietal 5 en evitación del obstáculo memoria-dirigida en el pie de gato19.

<table><tbody><tr><td>Cámara</td><td>IDS Imaging Development Systems GmbH</td><td>Modelo: UI-5240CP-C-HQ</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de admisión</td><td>Restek</td><td>25306</td> El <td>extremo sin brida se sumerge en el depósito de metanol, mientras que el extremo con brida se conecta a la bomba</td></tr><tr><td>Pump</td><td>Fluid Metering, Inc.</td><td>Modelo: QG 150</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de vacío Nalgene Dewar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9401</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de teflón</td><td>Ezkem</td><td>A051754</td><td></td></tr><tr><td>Termómetro de microsonda</td><td>Physitemp</td><td>Modelo: BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>Accesorios de extremo de tubo con brida</td><td>Valco Instruments Co. Inc.</td><td>CF-1BK</td><td>Colores variados disponibles para codificación de colores. Los paquetes incluyen el mismo número de arandelas que accesorios</td></tr><tr><td>Arandelas Valco</td><td>Instruments Co. Inc.</td><td>CF-W1</td><td>Arandelas adicionales</td></tr><tr><td>Kit de rebordeado</td><td>Pro Liquid GmbH</td><td>201553</td><td></td></tr><tr><td>Conector de tubo</td><td>Restek</td><td>25323</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de tubos</td><td>Restek</td><td>25069</td><td></td></tr><tr><td>Conector de termopar macho</td><td>Omega</td><td>SMPW-T-M</td><td>Se utiliza para hacer la conexión del cable al termómetro</td></tr><tr><td>Cable de termopar</td><td>Omega</td><td>PP-T-24S</td><td>Se utiliza para hacer conexión de cable al termómetro</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

desactivaciones reversibles inducida por enfriamiento a estudiar contribuciones corticales a la memoria de obstáculo en el gato caminando

Reversible Cooling-induced Deactivations to Study Cortical Contributions to Obstacle Memory in the Walking Cat

En terreno complejo, naturalista, información sensorial sobre un obstáculo ambiental puede utilizarse para ajustar rápidamente los movimientos locomotores para evitar. Por ejemplo, en el gato, puede modular información visual sobre un obstáculo inminente paso a paso para la evitación. Adaptación del aparato locomotor también puede ocurrir independiente de la visión, como repentinas entradas táctiles a la pierna por un obstáculo que pueden modificar la versión de las cuatro patas para la evitación. Dicha coordinación locomotriz complejo implica estructuras supraspinal, tales como la corteza parietal. Este protocolo describe el uso de desactivación cortical inducida por enfriamiento, reversible para evaluar las contribuciones de la corteza parietal a la locomoción de obstáculo memoria-dirigida en el gato. Bucles de enfriamiento pequeño, conocidos como cryoloops, son formados especialmente para desactivar regiones discretas de interés evaluar sus contribuciones a una conducta manifiesta. Tales métodos se han utilizado para aclarar el papel del área parietal 5 en evitación del obstáculo memoria-dirigida en el gato.

Este protocolo se ha utilizado con éxito para examinar las contribuciones de la corteza parietal a memoria de obstáculos en el caminar del gato19. En este estudio, se implantaron cryoloops bilateral parietales áreas 5 y 7 de cada tres adultos (> 6 meses de edad) gatos hembra (figura 5A). Los animales fueron evaluados en el paradigma de memoria táctil obstáculo en la ausencia de enfriamiento (calor, condición de control), o cuando era b...

Locomoción compleja en ambientes naturalistas que requiere la coordinación cuidadosa de las extremidades consiste en las regiones de la corteza parietal. El siguiente protocolo describe el uso de desactivación reversible inducida por enfriamiento para demostrar el papel del área parietal 5 en evitación del obstáculo memoria-dirigida en el gato caminando.

Desactivaciones reversibles inducida por enfriamiento a estudiar contribuciones corticales a la memoria de obstáculo en el gato caminando

On complex, naturalistic terrain, sensory information about an environmental obstacle can be used to rapidly adjust locomotor movements for avoidance. For ...

El objetivo general del uso de desactivaciones inducidas por enfriamiento en este estudio es evaluar las contribuciones corticales a la memoria de obstáculos en el gato que camina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del control locomotor, como si la corteza parietal está involucrada en la evitación de obstáculos guiada por la memoria. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de revertir la desactivación.Esto permite que cada animal sirva como su propio control. Para comenzar, construya el aparato mostrado aquí según se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, coloque al animal en el aparato de prueba utilizando el arnés de prueba, para que el animal se acostumbre a la configuración.Esta orientación de la correa permite que el animal camine a lo largo de la porción central del aparato sin ninguna tensión, lo que favorece que el animal permanezca dentro de esta sección del aparato. Establecer límites de este tipo es útil cuando se trabaja con un sujeto de prueba en movimiento. Coloque alimento blando sobre la plataforma de comida y luego coloque al animal sobre la pasarela, permitiéndole comer desde la plataforma.Asegúrese d

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Investigación

JoVE Journal

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Comportamiento

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T-laberinto alternancia forzada y la izquierda-derecha para la evaluación de las tareas de discriminación y de trabajo de la memoria de referencia en ratones

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Desactivaciones reversibles inducida por enfriamiento a estudiar contribuciones corticales a la memoria de obstáculo en el gato caminando

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