Name: Análisis precisos, alto rendimiento de crecimiento bacteriano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprende a analizar el crecimiento bacteriano con precisión y alto rendimiento usando E. coli y otros microorganismos. Este método permite evaluar tasas de crecimiento y densidad poblacional simultáneamente.

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Los autores no tienen nada que revelar.

1. preparar el medio de crecimiento Nota: la composición química de M63 medio mínimo es el siguiente: 62 m m K 2 HPO 4, 39 m m KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4 1,8 μm FeSO 4, 15 μm tiamina-HCl, 0,2 mM MgSO 4 y 22 mM de glucosa. M63 se hace mezclando tres soluciones: solución X 5, 20% de glucosa y solución de MgSO 4 tiamina. Almacene todas las soluciones a 4 ° C.
<ol><li>Preparación de la solución de X 5 <ol><li>para preparar solución de FeSO 4, utilice una pipeta eléctrica y una pipeta serológica desechable para agregar ddH 2 O a un tubo de centrífuga de 50 mL. Utilizar un P-200 Añadir 0,06 mL de HCl para obtener 36 mg FeSO 4 0.01 M HCl. Añadir-7 H 2 O y mezcle bien.</li>
		<li>Medir 160 mL ddH 2 O en una probeta y añadir un vaso de precipitados de 500 mL. Agregue lo siguiente en este orden: 10,72 g K 2 HPO 4, 5,24 g KH 2 PO 4, 2.0 g de (NH 4) 2 SO 4 y 0,5 mL de solución de FeSO 4 (preparado en el paso 1.1.1).</li>
		<li>Usando un medidor de pH de precisión, ajustar el pH a 7.0 agregando 2 M KOH. Vierta la solución en una probeta y añadir ddH 2 O a un volumen total de 200 mL. Esterilizar la solución utilizando una unidad de filtración de 250 mL (PVDF, 0,22 μm).</li>
	</ol></li> <li>Preparación de la solución de glucosa 20% <ol><li>medir 200 mL ddH 2 O en una probeta y verter un vaso de precipitados de 500 mL. Mientras se mezcla con un agitador magnético, agregar 50 g de glucosa. Diluir la solución en una probeta hasta un volumen total de 250 mL. Esterilizar la solución como se describe en el paso 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>Preparación de la solución de MgSO 4 tiamina <ol><li>añadir 150 mL ddH 2 O un vaso de precipitados de 500 mL. Mientras se mezcla con un agitador magnético, agregar 1,0 g de tiamina-HCl y 10 g de MgSO 4-7 H 2 O. diluir la solución en una probeta hasta un volumen total de 200 mL. Esterilizar la solución como se describe en el paso 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>Preparación mínima M63 medio <ol><li>Coloque la solución de X 5, la solución de glucosa 20%, la solución de MgSO 4 tiamina, una pipeta electrónica, una pipeta P-200 y puntas de pipeta de 200 μL en un banco limpio.</li>
		<li>ML 155,8 ddH 2 O en una probeta y verter en un vaso de precipitados de 500 mL.</li>
		<li>Usando la pipeta electrónica y pipeta serológica desechable, agregar 40 mL de solución de 5 X y solución glucosa al de 20% 4 mL con el ddH medido 2 O. Luego, agregar 0,2 mL de solución de MgSO 4 tiamina con la P-200. Esterilizar la solución como se describe en el paso 1.1.3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparar el caldo glicerol cultura <ol><li>celular Nota: las cepas bacterianas (p. ej., W3110 y sus genomas reducidos) están disponibles de organizaciones Banco de tensión. Las cepas se obtienen generalmente en forma de colonias en placas de agar.
	<ol><li>Colocar cinco tubos de cristal esterilizado con tapones de goma de silicona, una pipeta electrónica, P-1,000, puntas de pipeta de 1.000 μl, P-200, puntas de pipeta de 200 μl y las cepas target (colonias en las placas) en un banco limpio.</li>
		<li>Exponga la boca del tubo de vidrio con un mechero de Bunsen antes de abrir el tapón de goma de silicona. Exponer el tapón de goma de silicona para la llama después de que se abre el tubo y luego ligeramente Coloque la tapa en el tubo de cristal.</li>
		<li>Utilice la pipeta electrónica y pipeta serológica desechable para añadir a uno de los tubos de vidrio y 4,5 mL M63 a los otros cuatro tubos 5 mL M63.</li>
		<li>Utilice la punta del P-200 una colonia y inocular en el tubo de vidrio que contiene 5 mL M63.</li>
		<li>El tubo de vórtice para hacer una suspensión. Entonces, la solución diluida 10 veces al transferir 0,5 mL de esta solución a uno de los cuatro tubos conteniendo 4,5 mL M63.</li>
		<li>Repetir el proceso descrito en el paso 2.1.5 para los tubos restantes. Una serie de diluciones con cinco concentraciones diferentes (diluciones de 1, 10, 100, 1000 y 10.000) ya está listo.</li>
		<li>Esterilizar las bocas de los tubos de vidrio y los tapones de goma de silicona como se describe en el paso 2.1.2. Los tubos con los tapones de la tapa. Evitar la contaminación por no arrugar los tapones de goma de silicona.</li>
		<li>Colocar cinco tubos en una incubadora con agitación a 37 ° C y se agita a 200 rpm. Incubar el cultivo durante la noche o para h. de 10 a 30</li>
	</ol></li> <li>Selección de la cultura para el stock de glicerol <ol><li>Coloque el medio precalentado temperatura M63, P-1,000, puntas de pipeta de 1.000 μl y una cubeta desechable en un banco limpio.</li>
		<li>Añadir 1000 μl M63 a una cubeta desechable con un P-1, 000. Coloque la cubeta desechable en un espectrofotómetro, iniciar el programa en una longitud de onda fija de 600 nm y medir el espacio en blanco.</li>
		<li>Hacia los tubos de vidrio de cinco de la incubadora sacude el Banco limpio.</li>
		<li>M63 descartar de la cubeta desechable y añadir 1.000 cultura μl a la misma cubeta desechable con un P-1, 000. Medir la turbidez óptica de la cultura de célula (OD 600) como se describe en el paso 2.2.2. 
		Nota: Para evitar cualquier contaminación y lograr una medición precisa, exponga los tubos de vidrio y los tapones de la llama como se describe y el vórtice de la cultura antes de muestreo. Para asegurar resultados confiables, se recomiendan mediciones repetidas, sobre todo cuando la densidad celular es baja.</li>
		<li>De los cinco cultivos celulares, elegir una que se encuentra en la fase temprana de crecimiento exponencial (OD 600 = 0.01 - 0.05) para el caldo glicerol. 
		Nota: Si varias culturas tienen densidades dentro de la gama óptima, el uno más cercano a 0,05 es comúnmente seleccionado.</li>
	</ol></li> <li>Hacer las poblaciones de glicerol por repetidas pruebas. 
	Nota: Esto se describe para la preparación de las diez poblaciones. Cantidades más grandes o más pequeños se pueden hacer según los requisitos experimentales.
	<ol><li>Coloque la solución de glicerina 60% esterilizada, diez esterilizar microtubos de 1,5 mL, P-1,000 y P-200, puntas de pipeta de 1.000 y 200 μl y un microtubo en un banco limpio.</li>
		<li>Añadir 250 μl esterilizada 60% solución de glicerol y 750 μl de la cultura de la celda seleccionada a los microtubos de 1,5 mL y mezclar mediante pipeteo. 
		Nota: El volumen de acciones es variable, pero siempre mantener una relación de 1:3 de 60% de glicerol para cultivo celular; Esto resulta en una concentración final de glicerol al 15%.</li>
		<li>Colocar los nueve microtubos restantes en el stand de microtubos y dispensar 100 μl de la mezcla preparada en el paso 2.3.2 a cada tubo. Ahora hay diez poblaciones de glicerol idénticos para su uso futuro.</li>
		<li>Almacenar las existencias en un congelador a -80 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 3. Adquisición de las curvas de crecimiento <ol><li>configurar el lector de microplacas. 
	Nota: Los términos que se muestra en las comillas muestran el fraseo específico utilizado en el lector de placa utilizado aquí (véase la tabla de materiales).
	<ol><li>Abrir el software. Abierto &#34; protocolos de &#34; en &#34; el administrador de tareas &#34; y elija &#34; crear nuevo &#34;. Elegir &#34; protocolo estándar &#34;.</li>
		<li>Abierta &#34; procedimiento &#34; y ajustar la configuración. Abierto &#34; temperatura &#34; y seleccione &#34; en la incubadora &#34;. Set &#34; temperatura &#34; a 37 ° C y &#34; gradiente &#34; a 0 ° C. Revise &#34; precalentamiento &#34; antes de continuar con el siguiente paso. Abierto &#34; empezar cinética &#34;, establecer &#34; tiempo de ejecución &#34; para 24:00:00 o 48:00:00, y &#34; intervalo de &#34; de 00:30:00 o 1:00. 
		Nota: Tarda aproximadamente 1 minuto para leer un entero 96 placa bien.</li>
		<li>Abierta &#34; Shake &#34; y &#34; modo de agitar &#34; como &#34; lineal &#34;. Compruebe &#34; Constitution Shake &#34; y &#34; frecuencia &#34; en 567 cpm. Abierto &#34; leer &#34;, compruebe &#34; absorbancia &#34;, &#34; punto final/cinética &#34;, y &#34; monocromadores. &#34; Set &#34; longitud de onda &#34; 600.</li>
		<li>Clic &#34; validar &#34; para confirmar que el procedimiento es correcto. Haga clic &#34; guardar &#34; para guardar como un nuevo programa para el uso futuro.</li>
	</ol></li> <li>En tiempo real de grabación de crecimiento <ol><li>dibujar un pictograma de la placa de 96 pozos (8 × 12 tabla) para indicar las posiciones de las muestras de cultivo inoculados en la placa de 96 pocillos. Imprimir la tabla y utilizarla como referencia para el experimento de. 
		Nota: Los pozos situados en los bordes de la microplaca sólo deben contener medio en blanco debido a la evaporación.</li>
		Microplacas de fondo <li>lugar un piso de 96 pocillos estéril con tapa P-1000, puntas de pipeta de 1000 μl, P-200, puntas de pipeta de 200 μL, varios microtubos de 1,5 mL, una pipeta multicanal de 8, un reservorio de reactivo esterilizada, temperatura M63 y el glicerol acciones (preparadas en el paso 2.3) en un banco limpio.</li>
		<li>Añadir aproximadamente 25 mL M63 para el depósito de reactivo. Uso de este stock de reserva de todos los pasos siguientes.</li>
		<li>Agregar 900 μl M63 en los microtubos en preparación para hacer diluciones seriadas.</li>
		<li>Descongelar el stock de glicerol a temperatura ambiente. Agregar 900 μl M63 stock de glicerol descongeladas y vortex. Esto resulta en una dilución de 10 veces del original stock de glicerol de.</li>
		<li>Transferir 100 μl de la dilución de 10 veces a otro microtubo que contiene 900 μl de M63 y vortex. Esto resulta en una 100-fold dilución.</li>
		<li>Repetir paso 3.2.6 hasta conseguir el número de diluciones deseado es.</li>
		<li>Llenar los pozos en el borde de la microplaca con 200 μL M63 utilizando una pipeta de 8 canales (P-200). 
		Nota: Estos pozos se pueden utilizar como el espacio en blanco.</li>
		<li>Carga 200 μL de cada muestra en pasos 3.2.4 - 3.2.7 en los pocillos de la microplaca según la tabla de referencia (paso 3.2.1) diluida. Vórtice el antes las muestras diluidas de carga y carga la misma muestra en pozos múltiples en variados lugares en la placa de.</li>
		<li>Coloque la microplaca de 96 pocillos en el lector de placas de.</li>
		<li>Abierta &#34; leer ahora &#34; en &#34; el administrador de tareas &#34; y elegir el programa (sección 3.1). Haga clic en &#34; OK &#34; para comenzar a medir. Guardar la grabación como un nuevo archivo experimental para análisis de datos (sección 4).</li>
	</ol></li></ol> 4. Análisis de datos <ol><li>exportar los resultados de los datos en tiempo real tasa de crecimiento (sección 3.2) a una memoria USB stick como un archivo de texto. 
	Nota: Un resultados con formato de 96 pocillos (curvas) se mostrarán en el lector de la placa en tiempo real. Los registros por hora (valores de OD) pueden ser exportados como una tabla; las filas y las columnas representan los números bien (por ejemplo, A1, B1) y el tiempo de medición (por ejemplo, 00:00:59), respectivamente.</li>
	<li>Abrir el archivo de texto con un software de hoja de cálculo.</li>
	<li>Copiar las lecturas cada hora de 600 OD de la microplaca de 96 pozos en una nueva hoja de cálculo para su posterior análisis.</li>
	<li>Restar el fondo lee en el tiempo cero de las lecturas cada hora de cada muestra bien. 
	Nota: Para mayor comodidad, el valor medio del espacio en blanco pozos que contienen M63 (paso 3.2.8) puede ser utilizado como el valor de fondo.</li>
	<li>Calcular la media de cinco consecutivos OD 600 lecturas para estimar la densidad de población máxima. 
	Nota: El mayor valor promedio de OD 600 cinco Lee consecutivo se define como el máximo de OD 600 de la curva de crecimiento correspondiente.</li>
	<li>Calcular la tasa de crecimiento, μ (h -1), aplicando la siguiente ecuación para todos los pares de valores consecutivos de OD 600: 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56197/56197eq1.jpg" /> Nota: en esta ecuación, C y C i + 1 representan los valores de OD 600 de cualquier dos puntos de tiempo consecutivos (t y t i + 1, ««««respectivamente). LN indica logaritmo natural.</li>
	<li>Calcular los cambios en la tasa de crecimiento en el tiempo basados en la hora OD 600 Lee según el paso 4.6. Calcular la media y la desviación estándar de cinco crecimientos consecutivos para estimar la tasa de crecimiento máxima. 
	Nota: El promedio mayor con la menor desviación estándar se define como la tasa de crecimiento máxima de la curva de crecimiento correspondiente.</li>
</ol> 5. Confirmando la tendencia Global de las lecturas de 96 pocillos (opcional) Nota: tanto la placa del lector y la placa de 96 pocillos consumible pueden causar mediciones sesgadas. Para lograr resultados cuantitativos muy precisos y reproducibles, confirmando la tendencia global de la placa de 96 pocillos está altamente-recomendado.
<ol><li>Preparar la placa de 96 pocillos y el lector de la placa para la prueba de sesgo, como se describe en la sección 3.2.2.</li>
	<li>Añadir 20 mL M63 a un tubo de centrífuga de 50 mL esterilizado. Añadir el caldo glicerol al mismo tubo de centrífuga y vortex. Transferir la solución suspendida a un reservorio de reactivo esterilizada.</li>
	<li>Use una pipeta de 8 canales para transferir 200 μL de la solución de suspensión a la placa de 96 pozos.</li>
	<li>Coloque la placa de 96 pocillos en el lector de placas y comenzar la medición.</li>
	<li>Registro hora OD 600 Lee y analiza como se describe en la sección 4. Comparar la densidad de población y tasa de crecimiento máxima calculada de cada pozo para determinar sesgo localización de 96 pocillos Lee.</li>
</ol>

<ol><li>Kovarova-Kovar, K., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+kinetics+of+suspended+microbial+cells%3A+from+single-substrate-controlled+growth+to+mixed-substrate+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).</li>
<li>Soupene, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+studies+of+Escherichia+coli+strain+MG1655%3A+growth+defects+and+apparent+cross-regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression.</a> J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).</li>
<li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li>
<li>Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+growth+and+physiology%3A+a+call+for+better+craftsmanship%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship.</a> Front Microbiol. 6, 287(2015).</li>
<li>Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+genome+reduction+and+bacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Correlation between genome reduction and bacterial growth.</a> DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).</li>
<li>Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate-coordinated+transcriptome+reorganization+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria.</a> BMC Genomics. 14, 808(2013).</li>
<li>Nahku, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+growth+rate+dependent+transcriptome+profiling+of+Escherichia+coli+K12+MG1655+in+accelerostat+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures.</a> J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).</li>
<li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+translating+ribosomes+enables+Escherichia+coli+to+maintain+elongation+rates+during+slow+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth.</a> Nat Microbiol. 2, 16231(2016).</li>
<li>Madrid, R. E., Felice, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biomass+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microbial biomass estimation.</a> Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).</li>
<li>Harris, C. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+microbial+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">The estimation of microbial biomass.</a> Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).</li>
<li>Yates, G. T., Smotzer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+lag+phase+and+initial+decline+of+microbial+growth+curves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">On the lag phase and initial decline of microbial growth curves.</a> J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).</li>
<li>Kargi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-interpretation+of+the+logistic+equation+for+batch+microbial+growth+in+relation+to+Monod+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics.</a> Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).</li>
<li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+growth+curves%3A+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Food+Sci+Nutr%22%5BJournal%5D)">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).</li>
<li>Sprouffske, K., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growthcurver%3A+an+R+package+for+obtaining+interpretable+metrics+from+microbial+growth+curves%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves.</a> BMC Bioinformatics. 17, 172(2016).</li>
<li>Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rates+made+easy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Growth rates made easy.</a> Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).</li>
<li>Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+growth-rate+composition+formula+for+the+growth+of+E.coli+on+co-utilized+carbon+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates.</a> Mol Syst Biol. 11 (4), 801(2015).</li>
<li>Engen, S., Saether, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((r-+and+K-selection+in+fluctuating+populations+is+determined+by+the+evolutionary+trade-off+between+two+fitness+measures%3A+Growth+rate+and+lifetime+reproductive+success%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success.</a> Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).</li>
</ol>

Agradecemos a Kohei Tsuchiya para dar el ejemplo de ensayo de UFC. Este trabajo fue parcialmente apoyado por una subvenciones para la investigación científica (C) no. 26506003 (a BWY) desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología, Japón.

Pasos críticos en el protocolo incluyen la preparación de una acción común de crecimiento exponencial las células y la replicación de las mismas muestras en pozos múltiples en diversas posiciones en la microplaca. Previamente, microbiólogos comenzaron la cultura de una cultura de la noche. Mientras que este método puede reducir el tiempo de retraso del crecimiento bacteriano, es difícil de conseguir las curvas de crecimiento reproductivo. Como se muestra en la figura 2, las mediciones indepe...

Estudios microbiológicos a menudo comienzan con el cultivo de las células bacterianas y la evaluación de las curvas de crecimiento bacteriano, que representan un fenómeno fundamental de la fisiología bacteriana1,2,3. Principios básicos de la cultura están ampliamente disponibles en la literatura de los estudios publicados y los libros de texto porque la cultura bacteriana es una metodología fundamental. A nivel Banco, considerable atención se ha centrado tradicionalmente en optimización de medios de cultivo y condiciones de cultivo, pero controla la tasa de crecimiento, que probablemente daría aún mayor comprensión de la fisiología microbiana, no ha sido ampliamente estudiados4. Para el crecimiento exponencial de bacterias, un parámetro clave del estado celular es la tasa de crecimiento, que se ha divulgado para ser coordinado con el genoma, transcriptoma y proteoma5,6,7,8 . Así, la evaluación cuantitativa del crecimiento bacteriano es crucial para la comprensión de fisiología microbiana.
Para evaluar el crecimiento bacteriano, los métodos experimentales utilizados para estimar la biomasa están bien establecidos9,10 y se basan en la detección de parámetros bioquímicos, físicos o biológicos, como la turbidez óptica. Además, los métodos analíticos utilizados para capturar las propiedades dinámicas de los cambios de crecimiento se basan comúnmente en modelos no lineales establecidos11,12,13, por ejemplo, las ecuaciones logísticas. Dinámica de crecimiento se adquiere generalmente por tiempo muestreo del crecimiento celular en cultivo por medición de turbidez óptica o realizar pruebas de unidad (UFC) formadoras de colonias. La limitación de estos métodos de cultivo y detección es que los puntos no son un fiel reflejo de la dinámica de la población porque los intervalos de medición son a menudo en horas y la condición de la cultura (p. ej., cambios de temperatura y aireación) se altera en el momento de muestreo. Técnicas de cultivo y análisis deben ser actualizadas con los acontecimientos recientes en la tecnología y la comprensión. Los avances recientes en los lectores de microplacas permiten la observación en tiempo real del crecimiento bacteriano y disminuyen significativamente los costos laborales. Usando estos dispositivos avanzados, los estudios más recientes sobre crecimiento bacteriano han publicado métodos analíticos para mediciones de alto rendimiento14,15.
El propósito de este protocolo es evaluar la dinámica de crecimiento precisa de una manera de alto rendimiento, que será de gran valor para estudios cuantitativos que en última instancia, responder las preguntas de cómo se determina la tasa de crecimiento y los factores que afectan la tasa de crecimiento. El protocolo aborda todos los factores que deben tenerse en cuenta para la cuantificación precisa y repetible de crecimiento bacteriano. El método experimental y el análisis se describen en detalle en el texto principal. Este método permite el análisis preciso y reproducible de crecimiento bacteriano en forma de alto rendimiento. Microbiólogos pueden utilizar este protocolo para obtener resultados cuantitativos adicionales de su evidencia experimental. Este protocolo también puede utilizarse para estudios en biología de sistemas que tratan de sacar conclusiones conceptuales o para lograr un resumen teórico de crecimiento.

<table><tbody><tr><td>K2HPO4</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Wako</td><td>166-04255</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Wako</td><td>019-03435</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O</td><td>Wako</td><td>138-00415</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina-HCl</td><td>Wako</td><td>201-00852</td><td></td></tr><tr><td>glucosa</td><td>Wako</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de hierro (II) heptahidratado (FeSO4-7H2O)</td><td>Wako</td><td>094-01082</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Wako</td><td>075-00611</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga (50 mL, esterilizado)</td><td>WATSON</td><td>1342-050S</td> Puntas de <td></td></tr><tr><td>pipeta, 200 y micro; L</td><td>WATSON</td><td>110-705Y</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta, 1.000 y micro; L</td><td>WATSON</td><td>110-8040</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo (1,5 mL)</td><td>WATSON</td><td>131-715C</td><td></td></tr><tr><td>8 pipetas multicanal</td><td>WATSON</td><td>NT-8200</td><td></td></tr><tr><td>PASORINA AGITADOR</td><td>AS ONE</td><td>2-4990-02</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de vidrio (200 mL)</td><td>AS ONE</td><td>1-8562-07</td><td></td></tr><tr><td>Protector de pH de precisión</td><td>AS ONE</td><td>AS800 / 1-054-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>GILSON</td><td>1-6855-05</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-1000</td><td>GILSON</td><td>1-6855-06</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Serolocical Desechables (10 mL)</td><td>SANPLATEC</td><td>SAN27014</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Serolocicales Desechables (25 mL)</td><td>SANPLATEC</td><td>SAN27015</td><td></td></tr><tr><td>Soporte Microtubo</td><td>BM Bio</td><td>801-02Y</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>BM Bio</td><td>BM-V1</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca Corning Costar de 96 pocillos con tapa (fondo plano, transparente)</td><td>Sigma-Aldrich</td> Corning, depósito de reactivo <td>3370</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar (50 mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, PVDF 4870</td><td></td></tr><tr><td>Stericup GV (250 mL, 0,22 y micro; M)</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>DRUMMOND</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Bioshaker (BR-23UM MR)</td><td>TAITEC</td><td>0053778-000</td><td></td></tr><tr><td>Célula de eliminación (1,5 mL)</td><td>Kartell</td><td>1938 / 2-478-02</td><td></td></tr><tr><td>DU 730 Life Science UV/Vis Espectrofotómetro</td><td>Beckman Coulter</td><td>A23616</td><td></td></tr><tr><td>EPOCH2</td><td>BioTek</td><td>2014- EP2-002 / EPOCH2T</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados (500 mL)</td><td>IWAKI</td><td>82-0008</td><td></td></tr><tr><td>BIO banco limpio</td><td>Panasonic</td><td>MCV-B131F</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de vidrio</td><td>NICHIDEN RIKA GLASS</td><td>P-10M~P-30 /101019</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de caucho de silicona</td><td>ShinEtsu Polymer</td><td>T-19</td><td></td></tr><tr><td>Cepas bacterianas</td><td>Organización del banco de cepas; Proyecto Nacional de Recursos Biológicos (NBRP) en Japón</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análisis precisos, alto rendimiento de crecimiento bacteriano

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Crecimiento bacteriano es un concepto central en el desarrollo de la moderna fisiología microbiana, así como en la investigación de la dinámica celular a nivel de sistemas. Estudios recientes han reportado correlaciones entre el crecimiento bacteriano y eventos de todo el genoma, como reorganización de reducción y transcriptoma de genoma. Analizar correctamente el crecimiento bacteriano es fundamental para entender la coordinación dependiente del crecimiento de las funciones de genes y componentes celulares. Por consiguiente, se requiere la evaluación cuantitativa precisa del crecimiento bacteriano en forma de alto rendimiento. Desarrollos tecnológicos emergentes ofrecen nuevas herramientas experimentales que permiten la actualización de los métodos utilizados para el estudio de crecimiento bacteriano. El protocolo introducido el emplea a un lector de microplacas con un procedimiento experimental altamente optimizado para la evaluación precisa y reproducible del crecimiento bacteriano. Este protocolo fue utilizado para evaluar el crecimiento de varias cepas de Escherichia coli ha descrito anteriormente. Los pasos principales del protocolo son las siguientes: la elaboración de un gran número de poblaciones de células en pequeños viales de repetidas pruebas con la reproducibilidad, la utilización de placas de 96 pocillos para la evaluación del crecimiento de alto rendimiento y el cálculo manual de dos grandes parámetros (es decir, densidad de población y tasa de crecimiento máxima) que representa la dinámica de crecimiento. En comparación con el tradicional análisis de unidad (UFC) formadoras de colonias, que cuenta con las células que se cultivan en tubos de vidrio con el tiempo en placas de agar, el presente método es más eficiente y proporciona más registros temporales de los cambios de crecimiento, pero tiene una más estricta límite de detección a densidades de población bajas. En Resumen, el método descrito es ventajoso para el análisis de alto rendimiento precisa y reproducible del crecimiento bacteriano, que puede utilizarse para sacar conclusiones conceptuales o hacer observaciones teóricas.

El método descrito proporciona un medio para capturar la dinámico crecimiento bacteriano de manera continua, de alto rendimiento utilizando un lector de formato de 96 pozos que tiene varias mediciones de densidad óptica a diferentes intervalos de tiempo (desde minutos a horas o días). Las curvas de crecimiento de una variedad de cepas de e. coli expresan diversos genomas pueden adquirirse precisamente en un solo experimento (figura 1A). En comparació...

Evaluación cuantitativa del crecimiento bacteriano es fundamental para entender la fisiología microbiana como un fenómeno de nivel de sistemas. Se introduce un protocolo de manipulación experimental y un enfoque analítico, permitiendo análisis precisos, alto rendimiento de crecimiento bacteriano, que es un tema clave de interés en biología de sistemas.

Análisis precisos, alto rendimiento de crecimiento bacteriano

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

El objetivo general de este experimento es analizar con precisión el crecimiento bacteriano de manera de alto rendimiento. Mediante este procedimiento, se pueden probar simultáneamente múltiples medios o cepas variadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología de sistemas y la microbiología, como, cuáles son los factores determinantes del crecimiento celular.Las principales ventajas de esta técnica son que permiten a los investigadores evaluar con precisión parámetros globales como la tasa máxima de crecimiento y la densidad máxima de población en las curvas de crecimiento de células bacterianas. Aunque este método puede proporcionar información sobre el crecimiento de E. coli, también puede aplicarse a otros microorganismos, como en el ensayo de crecimiento y el cribado de bacterias ambientales.Para comenzar, coloque cinco tubos de vidrio esterilizados con tapones de hule siliconado, pipetas y las cepas objetivo sobre una mesa limpia. Exponga la boca del tubo de vidrio a un mechero Bunsen antes de abrir el tapón de hule siliconado. Exponga el tapón de hule siliconado a la llama después de abrir el tubo y luego coloque ligeramente la tapa nuevamente sobre el tubo de vidrio.A continuación, utilice la pipeta electrónica y la pipeta serológica desechable para agregar cinco mililitros de M63 a uno de los tubos de vidrio y 4,5 mililitros de M63 a otros cuatro tubos. Utilice la punta p200 para tomar una colonia e inocularla en el tubo de vidrio que contiene cinco mililitros de M63. Vortexee el tubo para obtener una suspensión.Luego, diluya la solución 10 veces transfiriendo 0,5 mililitros de esta solución a uno de los cuatro tubos que contienen 4,5 mililitros de M63. Repita este proceso para los tubos restantes. Después de esterilizar los extremos de los tubos de vidrio y los tapones de caucho de silicona, tape los tubos con los tapones.Luego, coloque los cinco tubos en un incubador agitador precalentado a 37 grados Celsius y agítelos a 200 rpm. Incube la cultura durante la noche o de 10 a 30 horas. Tras la incubación, añada 1.000 microlitros de M63 a una cubeta desechable con el p1000.Coloque la cubeta desechable en un espectrofotómetro. Inicie el programa a una longitud de onda fija de 600 nanómetros y mida el blanco. Transfiera los cinco tubos de vidrio del incubador agitador a la mesa limpia.Deseche el M63 del cubeta desechable y agregue 1.000 microlitros de cultivo a la misma cubeta desechable con el p1000. Luego, mida la turbidez óptica del cultivo celular. A continuación, agregue 250 microlitros de solución esterilizada de glicerol al 60 % y 750 microlitros del cultivo celular seleccionado a un microtubo de 1,5 mililitros y mezcle por pipeteo.Coloque los nueve microtubos restantes en el soporte para microtubos y distribuya 100 microlitros de la mezcla preparada en cada tubo. Almacene los stocks en el congelador profundo a 80 grados celsius. Para configurar el lector de microplacas, primero abra el software, abra los protocolos en el administrador de tareas y seleccione crear nuevo.Luego, seleccione el protocolo estándar. Abra el procedimiento y ajuste la configuración. Abra la configuración de temperatura y seleccione, incubadora encendida.A continuación, ajuste la temperatura a 37 grados Celsius y el gradiente a cero grados Celsius. Verifique el precalentamiento antes de continuar con el siguiente paso. Abra inicio cinético y establezca un tiempo de corrida de 24 o 48 minutos; luego, configure el intervalo cada 30 minutos o cada hora.Abrir y agitar estableciendo el modo de agitación como lineal. Verificar la agitación continua y ajustar la frecuencia a 567 cpm. A continuación, abrir lectura, seleccionar absorbancia, punto final/kinética y monocromadores.Establezca la longitud de onda en 600. Finalmente, haga clic en validar para confirmar que el procedimiento es correcto. Y haga clic en guardar para guardarlo como un nuevo programa para uso futuro.Para la grabación en tiempo real del crecimiento, agregue aproximadamente 25 mililitros de M63 a un reservorio de reactivo esterilizado. Luego, agregue 900 microlitros de M63 a los microtubos en preparación para realizar diluciones seriadas. A continuación, agregue 900 microlitros de M63 al stock de glicerol descongelado y vortexee.Transfiera 100 microlitros de la dilución 10 veces a otro microtubo que contenga 900 microlitros de M63 y vortexee. Repita este paso hasta alcanzar el número deseado de diluciones. Ahora, llene los pocillos del borde de una microplaca esterilizada de fondo plano de 96 pocillos con 200 microlitros de M63, utilizando una pipeta de ocho canales.Cargue 200 microlitros de cada muestra diluida en los pocillos de la microplaca según la tabla de referencia. Para evitar capas de distribución debido al calentamiento y a la eficiencia de siembra, nunca utilice los pocillos del borde de la microplaca para sus muestras y cargue la misma muestra en múltiples pocillos en distintas ubicaciones de la microplaca. Coloque la microplaca de 96 pocillos en el lector de placas.Abra la lectura ahora y el administrador de tareas, y elija el programa. Haga clic en aceptar para comenzar la medición. Finalmente, guarde la grabación como un nuevo archivo experimental para el análisis de datos.Se muestra aquí un ejemplo de una tabla de referencia que se elaboró antes de realizar el experimento. Se dibujó un pictograma de una placa de 96 pocillos como una tabla de ocho por doce para indicar las posiciones de las muestras de cultivo inoculadas en la placa de 96 pocillos. La velocidad de crecimiento se calcula aplicando la ecuación a todos los pares de valores consecutivos de OD600.Se calculó la media y la desviación estándar de cinco tasas de crecimiento consecutivas para estimar la tasa de crecimiento máxima. Las tasas de crecimiento de un total de 60 cultivos celulares se indican mediante el mapa de calor mostrado. La degradación del blanco al rojo indica las tasas de crecimiento desde bajas hasta altas.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en pocos minutos si se lleva a cabo correctamente y en orden. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y cargar muestras en la microplaca para realizar mediciones altamente precisas del crecimiento bacteriano de manera de alto rendimiento. Al intentar este procedimiento, es importante recordar elaborar una tabla de referencia antes de realizar el experimento para evitar cultivos celulares de baja densidad y asegurarse de que las células comiencen a crecer dentro de las 24 horas.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la automatización de la manipulación experimental y el análisis computacional para responder preguntas adicionales, como cuáles son los factores determinantes para la propagación de poblaciones y sus dinámicas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para investigadores en los campos de la biología de sistemas y la microbiología, con el fin de explorar los principios fundamentales del crecimiento celular y optimizar las composiciones de los medios de cultivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Kurokawa, M., et al. Análisis preciso y de alto rendimiento del crecimiento bacteriano. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demuestra la cuantificación de alto rendimiento del crecimiento bacteriano utilizando un lector de microplacas. Describe los pasos implicados en la preparación del cultivo, la medición de la densidad óptica y el análisis de la dinámica del crecimiento.

Análisis preciso y de alto rendimiento del crecimiento bacteriano usando un lector de microplacas

Fuente: Cabeen, M. T., et al. Análisis microfluídico de célula única de Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)El vídeo demuestra el uso de un dispositivo microfluídico para observar el crecimiento bacteriano a nivel de célula única. Muestra cómo las células bacterianas no móviles, confinadas en trincheras a microescala, son continuamente nutridas e imaginadas bajo un microscopio de fluorescencia. La configuración permite la visualización en tiempo real de la división celular y el seguimiento de...

Seguimiento del crecimiento bacteriano a resolución de célula única en un sistema microfluídico

ScanLag es un método de alto rendimiento para medir el retraso en el crecimiento, es decir, el tiempo de retraso, así como la tasa de crecimiento de las colonias para miles de células en paralelo. El cribado con ScanLag permite discriminar entre un retraso prolongado y un crecimiento lento a nivel de una sola variante.

ScanLag: De Alto Rendimiento La cuantificación del crecimiento de las colonias y Lag Tiempo

Se desarrolló un ensayo en tiempo real de alto rendimiento para identificar simultáneamente (1) antimicrobianos penetrantes en células eucariotas dirigidos a un patógeno bacteriano intracelular, y (2) evaluar la citotoxicidad de las células eucariotas. Posteriormente, se combinó una variación de la misma tecnología con la tecnología de dispensación digital para permitir estudios fáciles, de alta resolución, de dosis-respuesta y de sinergia bidimensional y tridimensional.

De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

El crecimiento de cultivos bacterianos radiomarcados en platos de microtíteres facilita el muestreo de alto rendimiento que permite múltiples ensayos técnicos y biológicos de réplica de la abundancia de piscinas de nucleótidos, incluyendo el de (p)ppGpp. Los efectos de las transiciones de crecimiento provocadas por fuentes de estrés fisiológico, así como la recuperación del estrés pueden ser monitoreados.

Uso de Microtiter Dish Radiolabeling para mediciones múltiples in Vivo de Escherichia coli (p)ppGpp seguido de cromatografía de capa fina

En este método, cuantificamos la afinidad de unión de proteínas de unión al ARN (RBP) a sitios de unión cognados y no cognados utilizando un ensayo de reportero simple, vivo y en células bacterianas. El ensayo se basa en la represión de un gen reportero.

Un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y ARN en bacterias

Este enfoque molecular para determinar la aptitud bacteriana facilita la detección precisa y precisa de microorganismos utilizando códigos de barras de ADN genómicos únicos que se cuantifican a través de PCR digital. El protocolo describe el cálculo del índice competitivo para las cepas de Salmonella;  sin embargo, la tecnología es fácilmente adaptable a los protocolos que requieren la cuantificación absoluta de cualquier organismo genéticamente maleable.

Indice competitivo basado en PCR digital para el análisis de alta producción de la aptitud en Salmonella

Este protocolo permite una descripción del crecimiento bacteriano en condiciones de estrés en los niveles de población de una sola célula y célula.

Análisis multiescala del crecimiento bacteriano bajo tratamientos de estrés

Los fenotipos de crecimiento de levadura se miden con precisión a través de imágenes de lapso de tiempo altamente paralelas de células inmovilizadas que crecen en microcolonías. Simultáneamente, se puede monitorear la tolerancia al estrés, la expresión proteica y la localización de proteínas, generando conjuntos de datos integrados para estudiar cómo las diferencias ambientales y genéticas, así como la heterogeneidad de la expresión génica entre las células isogénicas, modulan el crecimiento.

Imágenes en vivo de alto rendimiento de microcolonias para medir la heterogeneidad en crecimiento y expresión génica

Aquí se describe una pantalla de la sobreexpresión del plásmido...

La levadura de alto rendimiento de la pantalla sobreexpresión plásmido

Aprende a analizar el crecimiento bacteriano con precisión y alto rendimiento usando E. coli y otros microorganismos. Este método permite evaluar tasas de crecimiento y densidad poblacional simultáneamente.

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