Análisis precisos, alto rendimiento de crecimiento bacteriano
19 de septiembre de 2017
Evaluación cuantitativa del crecimiento bacteriano es fundamental para entender la fisiología microbiana como un fenómeno de nivel de sistemas. Se introduce un protocolo de manipulación experimental y un enfoque analítico, permitiendo análisis precisos, alto rendimiento de crecimiento bacteriano, que es un tema clave de interés en biología de sistemas.
El objetivo general de este experimento es analizar con precisión el crecimiento bacteriano de manera de alto rendimiento. Mediante este procedimiento, se pueden probar simultáneamente múltiples medios o cepas variadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología de sistemas y la microbiología, como, cuáles son los factores determinantes del crecimiento celular.
Las principales ventajas de esta técnica son que permiten a los investigadores evaluar con precisión parámetros globales como la tasa máxima de crecimiento y la densidad máxima de población en las curvas de crecimiento de células bacterianas. Aunque este método puede proporcionar información sobre el crecimiento de E. coli, también puede aplicarse a otros microorganismos, como en el ensayo de crecimiento y el cribado de bacterias ambientales.
Para comenzar, coloque cinco tubos de vidrio esterilizados con tapones de hule siliconado, pipetas y las cepas objetivo sobre una mesa limpia. Exponga la boca del tubo de vidrio a un mechero Bunsen antes de abrir el tapón de hule siliconado. Exponga el tapón de hule siliconado a la llama después de abrir el tubo y luego coloque ligeramente la tapa nuevamente sobre el tubo de vidrio.
A continuación, utilice la pipeta electrónica y la pipeta serológica desechable para agregar cinco mililitros de M63 a uno de los tubos de vidrio y 4,5 mililitros de M63 a otros cuatro tubos. Utilice la punta p200 para tomar una colonia e inocularla en el tubo de vidrio que contiene cinco mililitros de M63. Vortexee el tubo para obtener una suspensión.
Luego, diluya la solución 10 veces transfiriendo 0,5 mililitros de esta solución a uno de los cuatro tubos que contienen 4,5 mililitros de M63. Repita este proceso para los tubos restantes. Después de esterilizar los extremos de los tubos de vidrio y los tapones de caucho de silicona, tape los tubos con los tapones.
Luego, coloque los cinco tubos en un incubador agitador precalentado a 37 grados Celsius y agítelos a 200 rpm. Incube la cultura durante la noche o de 10 a 30 horas. Tras la incubación, añada 1.000 microlitros de M63 a una cubeta desechable con el p1000.
Coloque la cubeta desechable en un espectrofotómetro. Inicie el programa a una longitud de onda fija de 600 nanómetros y mida el blanco. Transfiera los cinco tubos de vidrio del incubador agitador a la mesa limpia.
Deseche el M63 del cubeta desechable y agregue 1.000 microlitros de cultivo a la misma cubeta desechable con el p1000. Luego, mida la turbidez óptica del cultivo celular. A continuación, agregue 250 microlitros de solución esterilizada de glicerol al 60 % y 750 microlitros del cultivo celular seleccionado a un microtubo de 1,5 mililitros y mezcle por pipeteo.
Coloque los nueve microtubos restantes en el soporte para microtubos y distribuya 100 microlitros de la mezcla preparada en cada tubo. Almacene los stocks en el congelador profundo a 80 grados celsius. Para configurar el lector de microplacas, primero abra el software, abra los protocolos en el administrador de tareas y seleccione crear nuevo.
Luego, seleccione el protocolo estándar. Abra el procedimiento y ajuste la configuración. Abra la configuración de temperatura y seleccione, incubadora encendida.
A continuación, ajuste la temperatura a 37 grados Celsius y el gradiente a cero grados Celsius. Verifique el precalentamiento antes de continuar con el siguiente paso. Abra inicio cinético y establezca un tiempo de corrida de 24 o 48 minutos; luego, configure el intervalo cada 30 minutos o cada hora.
Abrir y agitar estableciendo el modo de agitación como lineal. Verificar la agitación continua y ajustar la frecuencia a 567 cpm. A continuación, abrir lectura, seleccionar absorbancia, punto final/kinética y monocromadores.
Establezca la longitud de onda en 600. Finalmente, haga clic en validar para confirmar que el procedimiento es correcto. Y haga clic en guardar para guardarlo como un nuevo programa para uso futuro.
Para la grabación en tiempo real del crecimiento, agregue aproximadamente 25 mililitros de M63 a un reservorio de reactivo esterilizado. Luego, agregue 900 microlitros de M63 a los microtubos en preparación para realizar diluciones seriadas. A continuación, agregue 900 microlitros de M63 al stock de glicerol descongelado y vortexee.
Transfiera 100 microlitros de la dilución 10 veces a otro microtubo que contenga 900 microlitros de M63 y vortexee. Repita este paso hasta alcanzar el número deseado de diluciones. Ahora, llene los pocillos del borde de una microplaca esterilizada de fondo plano de 96 pocillos con 200 microlitros de M63, utilizando una pipeta de ocho canales.
Cargue 200 microlitros de cada muestra diluida en los pocillos de la microplaca según la tabla de referencia. Para evitar capas de distribución debido al calentamiento y a la eficiencia de siembra, nunca utilice los pocillos del borde de la microplaca para sus muestras y cargue la misma muestra en múltiples pocillos en distintas ubicaciones de la microplaca. Coloque la microplaca de 96 pocillos en el lector de placas.
Abra la lectura ahora y el administrador de tareas, y elija el programa. Haga clic en aceptar para comenzar la medición. Finalmente, guarde la grabación como un nuevo archivo experimental para el análisis de datos.
Se muestra aquí un ejemplo de una tabla de referencia que se elaboró antes de realizar el experimento. Se dibujó un pictograma de una placa de 96 pocillos como una tabla de ocho por doce para indicar las posiciones de las muestras de cultivo inoculadas en la placa de 96 pocillos. La velocidad de crecimiento se calcula aplicando la ecuación a todos los pares de valores consecutivos de OD600.
Se calculó la media y la desviación estándar de cinco tasas de crecimiento consecutivas para estimar la tasa de crecimiento máxima. Las tasas de crecimiento de un total de 60 cultivos celulares se indican mediante el mapa de calor mostrado. La degradación del blanco al rojo indica las tasas de crecimiento desde bajas hasta altas.
Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en pocos minutos si se lleva a cabo correctamente y en orden. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y cargar muestras en la microplaca para realizar mediciones altamente precisas del crecimiento bacteriano de manera de alto rendimiento. Al intentar este procedimiento, es importante recordar elaborar una tabla de referencia antes de realizar el experimento para evitar cultivos celulares de baja densidad y asegurarse de que las células comiencen a crecer dentro de las 24 horas.
Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la automatización de la manipulación experimental y el análisis computacional para responder preguntas adicionales, como cuáles son los factores determinantes para la propagación de poblaciones y sus dinámicas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para investigadores en los campos de la biología de sistemas y la microbiología, con el fin de explorar los principios fundamentales del crecimiento celular y optimizar las composiciones de los medios de cultivo.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para el análisis preciso y de alto rendimiento del crecimiento bacteriano, lo cual es fundamental para comprender la fisiología microbiana. El método permite probar simultáneamente múltiples medios o cepas variadas, proporcionando información sobre los factores clave que afectan el crecimiento celular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Fisiología microbiana
- Biología de sistemas
- Microbiología
Antecedentes
- Comprender el crecimiento bacteriano es esencial para la fisiología microbiana.
- El análisis de alto rendimiento permite la evaluación de los parámetros de crecimiento.
- Este método puede aplicarse a diversos microorganismos.
- Facilita responder preguntas fundamentales en microbiología.
Objetivo del estudio
- Analizar el crecimiento bacteriano con precisión.
- Evaluar parámetros globales de tasas de crecimiento y densidad poblacional.
- Proporcionar información sobre el crecimiento de E. coli y otros microorganismos.
Métodos Utilizados
- Manipulación experimental de las condiciones de crecimiento bacteriano.
- Técnicas de análisis de alto rendimiento.
- Prueba simultánea de múltiples cepas y medios.
- Evaluación de las curvas de crecimiento de bacterias.
Resultados principales
- Evaluación precisa de las tasas máximas de crecimiento alcanzadas.
- Evaluación de la densidad máxima de población en las curvas de crecimiento.
- Conocimientos obtenidos sobre los factores que determinan el crecimiento bacteriano.
- Aplicabilidad al cribado de bacterias ambientales.
Conclusiones
- El método mejora la comprensión de la dinámica del crecimiento microbiano.
- Proporciona un marco para investigaciones futuras en biología de sistemas.
- Potencial para aplicaciones más amplias en estudios microbiológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis de crecimiento bacteriano de alto rendimiento permite una evaluación rápida de la aptitud de cepas y la optimización de medios, apoyando la validación temprana de objetivos en el descubrimiento de agentes antimicrobianos. La cuantificación precisa de la tasa de crecimiento y la densidad poblacional proporciona confianza predictiva para reducir riesgos en candidatos líderes dentro de líneas de investigación centradas en microbiología. Este método aborda la necesidad de cribado fenotípico escalable y reproducible en investigaciones de biología de sistemas y microbiología traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas mediante la medición de la tasa máxima de crecimiento como un indicador de la aptitud celular bajo distintas condiciones genéticas o ambientales.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de objetivos mediante la comparación de alto rendimiento entre cepas silvestres y mutantes en múltiples formulaciones de medio.
- Valor predictivo: Facilita la selección de proyectos al cuantificar la coordinación de la función génica dependiente del crecimiento, reduciendo la ambigüedad mecanicista en la elección de objetivos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara bancos bacterianos validados para la estandarización reproducible de ensayos, asegurando lecturas basadas en OD600 consistentes en diversas campañas de cribado.
- Valor operativo: Utiliza el formato de placa de 96 pocillos para permitir pruebas escalables y paralelas de docenas de cepas o condiciones con un consumo mínimo de reactivos.
- Preparación para el ensayo: Genera curvas detalladas de crecimiento temporal que mejoran la fiabilidad del cribado al registrar las fases de latencia, exponencial y estacionaria para la confirmación de resultados positivos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta los fenotipos de crecimiento en fase de descubrimiento con modelos preclínicos al mantener la fidelidad del sistema relevante a la enfermedad en bacterias ambientales y patógenas.
- Avance Ajustado al Riesgo: Apoya las decisiones de continuar o descartar al vincular la cinética de crecimiento con la reorganización del transcriptoma y las tendencias de aptitud a nivel genómico.
- Reducción de Riesgos Mecanicista: Se centra en la confianza predictiva en las vías dependientes del crecimiento en lugar de en los resultados clínicos, alineándose con los objetivos iniciales de reducción de riesgos.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
Este método se enmarca dentro del continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis en biología temprana hasta la preparación de ensayos para la identificación de compuestos prometedores, particularmente en programas dirigidos a antimicrobianos y al microbioma.
- Biología de descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis al permitir una comparación precisa de la dinámica de crecimiento entre eliminaciones génicas, variantes de promotores o condiciones de estrés.
- Selección: Garantiza la disponibilidad del ensayo mediante mediciones estandarizadas de OD600, preparación reproducible de cultivos y salida de datos cinéticos para la validación de resultados positivos.
- Análisis: Proporciona resultados cuantitativos, como la tasa máxima de crecimiento y la densidad poblacional, que permiten la comparación estadística entre condiciones y el rendimiento de cepas.
- Investigación traslacional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante el uso de bacterias y medios ambientalmente relevantes que imitan condiciones fisiológicas.
- Reutilización empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el perfilado de crecimiento en distintos proyectos, reduciendo el desarrollo redundante de protocolos y permitiendo la alineación de datos entre equipos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos, reducción de la ambigüedad mecanicista en las vías vinculadas al crecimiento.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de las mediciones de crecimiento entre cepas y medios.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital mediante pruebas paralelas y reducción del riesgo biológico en programas tempranos de antimicrobianos.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo basada en datos de aptitud de crecimiento, que permite el avance de cepas con perfiles fenotípicos robustos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microbiología en técnicas estériles, preparación de cultivos y calibración de OD600.
- Depende de un lector de microplacas con control de temperatura, capacidad de agitación y lectura cinética de absorbancia a 600 nm.
- Necesita la estandarización entre equipos de tablas de referencia, protocolos de dilución y posicionamiento de pocillos para evitar efectos de borde.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen el ajuste de la densidad del inóculo y la composición del medio para cepas de crecimiento lento o exigentes.
- Límite práctico: límite de detección más estricto a bajas densidades poblacionales en comparación con UFC, lo que requiere un inóculo suficiente para obtener una señal confiable.
