Name: Preparación de los cultivos disociados ratón neuronas corticales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 2 s
Description: Aprende a preparar cultivos neuronales disociados de corteza cerebral de ratón para electrofisiología e imágenes de calcio. Este método utiliza neuronas de ratones postnatales sin células gliales de alimentación.

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Los preparativos antes del día de cultivo: <ul><li> Prepare una solución estéril de disección (DS). </li><li> Prepare NBM/B27 (Mediom Neurobasal con suplementos B27). </li><li> Autoclave ddH2O y esterilizar coversilps vidrio, si es necesario. </li><li> Escudo platos de cultivo de tejidos o cubreobjetos de vidrio con poli-D-lisina. </li></ul> Poli-D-lisina de revestimiento: Preparar el día antes de cultivo en condiciones estériles. <ul><li> Descongele alícuota del PDL 10 veces y el lugar en el hielo. </li><li> Añadir 9 ml estéril ultra filtrado de agua a 1 ml de PDL y mezclar bien (1X). </li><li> Cubra las superficies con 1X PDL noche a temperatura ambiente de la siguiente manera: <ul><li> vidrio cubreobjetos (Bellco gato de cristal, Inc. # 1943-00012.): 75 l / cubreobjetos O </li><li> 24 placas de cultivo, así: 300 l / pocillo O </li><li> 35 mm placa de cultivo: 1ml/dish </li></ul></li><li> Enjuague 5X con agua estéril (uso de pipetas Pasteur estéril para aspirar el contenido). </li><li> Eliminar el agua hasta que la superficie esté completamente seca. </li></ul> Procedimiento de cultivo (que se hace en campana de flujo laminar bajo condiciones estériles) <ol><li> Recorte bloque de agar y péguelo en el bloque de apoyo de la Vibraslicer microtomo (Campden Instruments Ltd.) con pegamento. </li><li> Cuando se utiliza última etapa embrionaria (E17-18) fetos de ratones, presa de la eutanasia, sin extraer el útero y los fetos individuales de saco embrionario. Fetos lugar en placa de Petri estéril y continuar como se indica a continuación. </li><li> Decapitar feto de ratón o crías (las directrices aprobadas por seguir a su animal de Atención Institucional y el empleo). </li><li> Quite la piel y el cráneo y el cerebro el lugar en el disco un papel filtro Whatman en una placa de Petri de 60 mm DS llena de frío. </li><li> Cortar el cerebelo con una hoja de afeitar estéril. </li><li> Recoger el cerebro con una espátula y drenar el líquido en exceso en un papel de filtro, a continuación, transferir el cerebro para bloquear el apoyo Vibraslicer y el cerebro de pegamento en el lugar (lado caudal y parte ventral hacia agar). </li><li> Llene la cámara de frío con síndrome de Down. Selector de velocidad a 8-9. </li><li> Corte secciones 200-400 micras, a partir de bulbo olfatorio. Una vez que la hoja de la Vibraslicer entra en la corteza, empezar a cortar 600μm secciones coronal. Un cerebro de ratón E17-18 por lo general los rendimientos de 3-4 rebanadas utilizable, mientras que un cerebro de ratón P0 rendimientos 4-5 rebanadas utilizable. </li><li> Transferencia de las secciones de cerebro de 35 mm placa de Petri marcada DS 2 con punta opuesta de la ONU conectado 10 ml de vidrio con pipeta Pasteur. </li><li> Diseccionar la corteza y eliminar el uso de agujas de vidrio meninges extraídos de los tubos capilares. </li><li> Cortar las cortezas corticales en trozos pequeños, 0.5-1 mm de largo. </li><li> ES filtro a través del filtro de 0,2 micras unida a una jeringa de 5 cc en un 35 mm placa de Petri. </li><li> Transferencia de las piezas de tejido cortical de placa de Petri que contiene ES filtrada. </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 30 min. </li></ol> Mientras tanto: <ol><li> Limpieza de campana, Vibraslicer y herramientas de disección. </li><li> Añadir 5 ml de agua tibia NBM/B27 en un 60 mm placa de Petri. </li></ol> Después de 30 min. incubación: <ol><li> La transferencia de tejido a 10 ml DS. Dejar reposar durante 1 minuto. </li><li> La transferencia de tejido al primer remolinos tubo de alta y dejar reposar durante 2-3 min. </li><li> Hola traslado al segundo. Repita lo anterior. </li><li> Traslado a la primera Li. Repita lo anterior. </li><li> Traslado a la segunda batería. Repita lo anterior. </li><li> Transferencia a terceros Li. Repita lo anterior. </li><li> La transferencia de tejido para el plato de 60 mm con los medios de comunicación. </li></ol> Bajo el microscopio de disección: <ol><li> Limpie los residuos de los tejidos y triturar cada pieza con cuidado que pasa a través de una pipeta de vidrio tirado (uso de disminuir el tamaño de diámetro) para aflojar el tejido. </li><li> Transferencia de suspensión de células a un tubo cónico de 15 ml que contiene el resto de NBM + B27 (hacen un total de 13 ml para una placa de 24 ml o bien 11 para 5 -. Placas de 35 mm Mezclar suavemente y esperar a que grandes pedazos de tejido para resolver). </li><li> Transferencia de suspensión de células (0,5 ml / pocillo de una placa de 24 pocillos o 2 ml / placa de cultivo de 35 mm). </li><li> Cuando se utiliza cubreobjetos de vidrio, añadir 80 l de suspensión celular por cubreobjetos y dejar una hora en el cultivo de tejidos incubadora para que las células se adhieran antes de la inundación de la cámara con más NBM/B27 los medios de comunicación. </li><li> Mantener los cultivos a 37 ° C y 5% CO 2. </li></ol> Día Siguiente 24 y placa: Feed cada pocillo con 0,5 ml de células no neuronales acondicionado NBM/B27 medio (cNBM/B27; Protocolo para la preparación de cNBM/B27 medio aparece a continuación) Platos de 35 mm: Vuelva a colocar 0,5 ml con cNBM/B27 medio. Mantener la cultura mediante la sustitución de 0,5 ml de medio fresco con cNBM/B27 cada 2-3 días. Aunque los medios de cultivo no promueve la proliferación de células gliales, las culturas pueden ser tratados con 5μM FDU (5-fluoro-2&#39;-desoxiuridina, Sigma F0503) en el día 03/05 en la cultura de reducir aún más el número de células gliales, si es necesario. JUEGO<html> -UP para la disección y la Cultura Esterilizar las herramientas de disección en el 70% EtOH o autoclave ellos: <ul><li> Tijeras (empresas medianas y pequeñas) Espátulas (empresas medianas y pequeñas) </li><li> Pinzas (empresas medianas y pequeñas) Razor blade </li><li> Hoja de baño Buffer vibraslicer </li><li> Pequeña cuña de metal de hoja de soporte para el cerebro </li></ul> Otros materiales: <ul><li> Placas de Petri (60 mm) </li><li> Placas de Petri (35 mm) </li><li> Papel de filtro </li><li> Pipeta de vidrio de 10 ml </li><li> Pipetas desechables estériles, 5,10 y 25 ml </li><li> Filtro de jeringa de 0,2 micras </li><li> Jeringa de 5 cc </li><li> Tubos de centrifugación de 15 ml </li><li> Pasteur de vidrio estéril pipetas </li><li> PDL placas de cultivo recubiertos o cubreobjetos de vidrio </li></ul> Etiqueta seis tubos de 15 ml centrífuga y seguir la preparación: Tubo # 1: La solución de la enzima: Añadir 50 U de la papaína (Worthington LS 03126) a 5 ml contiene DS: <ul><li> 100μl de la L-cisteína (0,8 mg) </li><li> 7 l de NaOH 0,1 N </li><li> 50 l APV (5 mM) </li></ul> Deje la solución a temperatura ambiente para despejar. Tenga en cuenta que la solución de la enzima aparecerá &quot;nublado&quot; en un primer momento y las necesidades para eliminar antes de su uso. Tubo # 2 y # 3: Inhibidor de la Enzima de alta: 3 ml DS + 300 l BSA / Ti + 30 l APV (5 mm). Mezclar con cuidado para evitar las burbujas, y se divide en dos alícuotas de 1,5 ml. Tubo # 4 - # 6: inhibidor de la enzima de baja: 8 ml DS + 80 l de BSA / Ti + 80 l APV (5 mm). Mezclar con cuidado para evitar las burbujas, se divide en tres alícuotas de 2,6 ml. Se colocan los tubos numerados # 2 al # 6 en el hielo. Deja el tubo # 1 (solución enzimática) a temperatura ambiente. SOLUCIONES y las alícuotas <ul><li> Solución A (solución salina tamponada) Sigma Fórmula peso 500 ml [conc.] </li><li> Cloruro de sodio NaCl S-9625 58.45 80.0g 137mm </li><li> Cloruro de Potasio KCl P-4504 74,56 4,0 g 5.4mm </li><li> Fosfato de sodio dibásico anhidro Na 2 HPO 4 S-0876 142,0 0,24 g 0,17 mm </li><li> Fosfato de potasio monobásico anhidro KH 2 PO 4 P-5379 136,09 0,3 g 0.22mm </li></ul> Pesar todos los ingredientes y mezcle hasta que se disuelven con 400 ml de agua ultra filtrada. Alcanzar un volumen final de 500 ml. Coloque en un frasco limpio y autoclave. Almacenar a 4 ° C y la etiqueta de &quot;Solución DS A&quot;. <ul><li> Solución B (Hepes) Sigma Fórmula peso 250 ml [conc.] </li><li> Hepes Hepes H-3375 283,3 9,9 20.97g </li></ul> Añadir agua ultrafiltrada hasta 200 ml. Mezclar hasta que se disuelva y llevar el volumen final de 250 ml. Coloque en un frasco limpio y autoclave. Almacenar a 4 ° C y la etiqueta de &quot;DS solución B&quot;. <ul><li> Solución de trabajo de 500 ml [conc.] </li><li> De agua ultra filtrada 400 ml </li><li> Una solución de archivo de 25 ml </li><li> Solución madre B 14 ml </li><li> D (+)-glucosa Sigma G-8270 3,0 g 33.3mM </li><li> Sacarosa Sigma S-0389 7,5 g 43,8 mM </li></ul> Ajustar el pH a 7.4 con NaOH 1N. Alcanzar un volumen final de 500 ml con agua ultra filtrada. Decantar en un frasco de vidrio limpio y autoclave. Almacenar a 4 ° C. Etiqueta de &quot;Solución de disección&quot;. Poli-D-lisina de preparación: <ol><li> Preparar la solución 10X de poly-D-lisina (PDL; Sigma P-7280) en H 2 O estéril a 1mg/ml. </li><li> Hacer 1,0 ml alícuotas. Esta solución puede conservarse a -20 ° C hasta por 3 meses. </li></ol> MEDIA <ol><li> Añadir 10 ml de B-27 Suplemento (Gibco 17504-044) a 500 ml botella de NBM (Medium Neurobasal, Gibco 21103-049). </li><li> Hacer alícuotas de 40 ml y almacenar a 4 ° C. </li></ol> APV <ol><li> Agregar 10 ml de H2O estéril al vial de 10 mg de APV (2-amino-5-phosphonopentanoic ácido, Sigma A-5282) y mezclar bien. </li><li> Preparar 180 alícuotas y almacenar a -20 ° C. </li></ol> BSA / Ti <ol><li> Disolver 1 g de BSA (albúmina bovina. Sigma A-7030) y 1 g de inhibidor de tripsina (Sigma T-9253) en 10 ml DS. </li><li> Ajustar el pH a 7.4 con NaOH 1N. </li><li> Esterilizar por filtración a través de filtro de 0,2 micras jeringa. </li><li> Se dividen en 400 alícuotas y almacenar a -20 ° C. </li></ol> L-cisteína En un tubo Eppendorf se disuelven 0,6 mg L-cisteína (Sigma C-7755) en 200 l DS. AGAR (4%) <ol><li> Disolver 4 g de agar Bacto (Difco 0140-01) en 100 ml de agua estéril. Mantener a 4 ° C hasta que sea necesario para la cultura. </li><li> Agar microondas para derretir y llenar una caja de Petri de 35 mm. Deje reposar para enfriar y polimerizar. </li></ol> Papaína (Worthington LS 03126) e_title &quot;&gt; no neuronales CULTURAS EN BOTELLAS DE CULTURA NUNC RECUBRIMIENTO frasco de cultivo (4 botellas Nunc) <ol><li> Añadir 9 ml de agua estéril para cada uno de 3 tubos de 10 veces para hacer PDL PDL 1X. </li><li> Transferencia de 30 ml 1X PDL en la primera botella. </li><li> Mover ligeramente hasta que todas las superficies están cubiertas de crecimiento. Deje reposar durante 1 minuto. </li><li> Transferencia 1x PDL a la segunda botella. Deje reposar durante 1 minuto. </li><li> Repita lo mismo con las botellas de tercera y cuarta. </li><li> Enjuague todas las cuatro botellas de 150 ml con 2X estéril H 2 O. </li></ol> Prepare la solución de enzima (ES): <ol><li> En un peso del tubo 0,6 ml de centrífuga de 0.8 mg L-cisteína (Sigma C7755), añadir DS 150 ml y agitar hasta que los cristales se disuelven. </li><li> Transferir 5 ml DS a un tubo cónico de 15 ml y añadir 150 ml de L-cisteína. </li><li> Añadir 50 unidades de papaína. (Worthington LS 03126) </li><li> Añadir 7 ml NaOH 0,1 N. </li></ol> PREPARE MEM (GIBCO 11090-081 #) <ol><li> Quitar 65 ml de la botella de 500 ml del MEM. Ahorre 10 ml para preparar la glucosa. </li><li> Añadir 5 ml de penicilina / estreptomicina (Gibco # 15070-063). </li><li> Agregar 10 ml de glucosa 1M (Sigma G-8270) (1,8 g / 10 ml MEM) </li><li> Añadir 50 ml de suero fetal bovino (Gibco # 16140-071) o bovina de suero de ternera (Omega BC-04). </li><li> Mezclar bien, alícuota y almacenar a 4 ° C. </li></ol> Neurobasal SUPLEMENTO MEDIUM/B-27 (NBM/B27) NBM, 500 ml (Gibco # 21103-049), B-27 (50 veces), 10 ml (Gibco # 17504-044) <ol><li> Añadir todo el contenido de B-27 vial a la botella de NBM y mezclar. </li><li> Alícuota y se almacenan a 4 ° C. </li></ol> DISECCIÓN de tejido cerebral <ol><li> Seco disección herramientas de EtOH al 70% antes de la disección. </li><li> Transferir 10 ml DS en cada una de tubo de 3.15 ml. </li><li> Seleccione crías de ratón (P0 - P3), se necesitan tres cerebros para 4 botellas. </li><li> Añadir DS fría a 35 mm placa de Petri. </li><li> Decapitar cría de ratón y diseccionar el cerebro. </li><li> Lugar en los cerebros de la placa de Petri que contiene DS frío. </li><li> Picar en trozos de tejido, lo suficientemente pequeño para pasar a través de una pipeta de vidrio. </li></ol> ENZIMA DISOCIACIÓN <ol><li> Eliminar la mayor DS tanto como sea posible de la antena con una pipeta Pasteur. </li><li> ES filtro a través de una jeringa de 0,2 micras y filtro de 5 cc. </li><li> ES lugar en el plato con el tejido. </li><li> Incubar el tejido a 37 ° C incubadora (CO 2 libre) durante 30 minutos. </li></ol> LAVADO DE TEJIDO <ol><li> La transferencia de tejido con una pipeta de vidrio para el primer tubo de DS, el asegurarse de obtener como ES posible. </li><li> Centrifugar durante 30 segundos a 1500 rpm. </li><li> Transferencia de tejidos y repetir el procedimiento dos veces más. </li></ol> TRITURACIÓN <ol><li> Coloque 38 ml de MEM / FBS en un tubo de centrífuga de 50 ml </li><li> Añadir 3 ml de MEM / FBS a un plato de 35 mm y transferencia de tejido a esta placa de Petri. </li><li> Disociar el tejido de él con cuidado triturar a través de una punta de la pipeta eppendorf 1000μl. </li><li> Transferencia de suspensión de células en el tubo que contiene 38 ml de MEM / FBS y mezclar bien. </li></ol> CHAPA <ol><li> Coloque la botella en posición vertical para obtener la cultura cantidades iguales de la suspensión celular y los medios de comunicación en cada botella. </li><li> Poner 90 ml de MEM / FBS en cada frasco de cultivo. </li><li> Agregar 10 ml de suspensión celular en cada botella. </li><li> Etiqueta: no neuronales, las iniciales y la fecha. Se incuba a 37 ° C y 5% CO 2. </li></ol> ALIMENTACIÓN <ol><li> El día 3 o 4, alimentación de las celdas con agua tibia MEM / FBS (decantar todos los medios de comunicación y reemplazarlo con 100 ml de MEM / FBS). Los cultivos pueden tardar 7-10 días para confluir. </li><li> En el Día de 10.7 cambiar los medios de comunicación para NBM/B27. </li><li> Al día siguiente, recoger los medios de comunicación. Filtro con 0.22μm </li><li> Hacer alícuotas de 40 ml y se alimentan con la cultura MEM / FBS. </li><li> Próximos 2 o 3 días, los medios de comunicación para el cambio NBM/B27 </li><li> Al día siguiente, recoger y repetir el procedimiento. </li><li> Seguir recogiendo los medios de comunicación durante aprox. 2 semanas. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<table><tbody><tr><td>5-Fluoro-2&amp;rsquo;-deoxiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Vibraslicer</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Medio Neurobasal (NBM)</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-amino-5-fosfonopentanoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio, solución 1N</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>Agar Bacto</td><td>Difco Laboratories</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Papaína</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS 03126</td><td></td></tr><tr><td>Filtro estéril para jeringa de 0,2 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>DDA02025S0</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio, No1, 12 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-00012</td><td></td></tr><tr><td>Medio Mínimo Esencial (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11090-081</td><td>con sales de Earle&amp;rsquo;s sin L-glutamina, necesario para cultivar cultivos no neuronales</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>para cultivo no neuronal</td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td>necesario para cultivos no neuronales</td></tr><tr><td>Frascos de cultivo de tejidos Nunclon &quot;Triple Flask&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-25</td><td>Utilizar para cultivos no neuronales. Estos frascos son muy convenientes para producir &quot;medio Neurobasal/B27 enriquecido&quot;, aunque también se pueden usar otros frascos o placas de cultivo de tejidos.</td></tr><tr><td>Placas de vidrio para imágenes &quot;Imaging dishes&quot;</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>Placas de cultivo de fondo de vidrio de 35 mm, ideales para imágenes de calcio o sodio cuando se utiliza un sistema de imagen invertido. ¡Pero son caras!</td></tr></tbody></table>

preparación de los cultivos disociados ratón neuronas corticales

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Este video lo guiará en el proceso de generación de cultivos de neuronas corticales de embrión tardío y temprano del cerebro del ratón postnatal. Estas culturas se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones, incluyendo la inmunocitoquímica, la bioquímica, la electrofisiología, imágenes de calcio y sodio, proteínas y / o aislamiento de ARN. Estas culturas también proporcionan una plataforma para estudiar el desarrollo neuronal de los animales transgénicos que portan una mutación letal del gen embrionario tardío y postnatal. El procedimiento es relativamente sencillo, requiere de cierta experiencia en la técnica de cultivo de tejidos y no debe tardar más de dos o tres horas si está debidamente preparado. Cuidadosa separación de la corteza cortical del tracto de fibras tálamo-corticales se reducirá el número de embarazos no deseados células no neuronales. Para aumentar la producción de las células neuronales triturar las piezas del tejido cortical suavemente después de la etapa de incubación enzimática. Esto es imprescindible, ya que evita daños innecesarios a las células y la muerte prematura de las células neuronales. Debido a que estos cultivos se mantienen en ausencia de células alimentadoras glía, sino que también ofrecen una ventaja adicional de cultivos en crecimiento enriquecido en las neuronas.

Este video muestra un procedimiento para la generación de cultivos neuronales a partir de finales de embriones y la corteza temprana de ratón postnatal. Estos cultivos pueden ser utilizados para inmunocitoquímica, la bioquímica, la electrofisiología, calcio y sodio de imagen y proporcionar una plataforma para estudiar el desarrollo neuronal de los animales transgénicos que portan una mutación del gen letal después del parto.

Preparación de los cultivos disociados ratón neuronas corticales

Este video le guiará a través del proceso para generar cultivos de neuronas corticales a partir de cerebro de ratón en etapa embrionaria tardía y postnatal temprana. Estos cultivos...

Hola, mi nombre es Hilgenberg. Trabajo aquí en la universidad en California, en Irvine, en el Departamento de Anatomía y Neurobiología. Hoy les hablaré sobre cómo preparamos cultivos corticales a partir de ratones.Estos son ratones de día postnatal de los que preparamos esas neuronas. Y normalmente utilizamos esos cultivos ya sea para electrofisiología, o para preparaciones de proteínas o ARN. Utilizamos la misma preparación de cultivo para imágenes de calcio o imágenes de sodio.Lo bueno de estos cultivos es que, en realidad, es una adaptación del protocolo de banker, pero cultivamos estos cultivos en ausencia de células alimentadoras gliales, lo que los hace mucho más convenientes y, por lo general, los cultivos son más ricos en neuronas que en células gliales. Así que comencemos y les mostraré cómo preparamos esas neuronas. Muy bien, ahora estamos en el punto en el que podemos extraer el cerebro y comenzar la disección propiamente dicha.Pero antes es importante mencionar que las laminillas en las que desea sembrar estas células deben estar recubiertas. Solíamos hacerlo, generalmente durante la noche a temperatura ambiente, con una concentración de polilisina de 0,1 miligramo por mililitro. Al día siguiente, retiramos la polilisina y lavamos las laminillas tres veces consecutivas.Dependiendo de la aplicación, puede usar platos grandes o platos pequeños, o puede usar cubreobjetos de vidrio. Muy bien, esta es la configuración típica para la cabina, y le expliqué brevemente qué soluciones necesita tener preparadas y también qué instrumentos son útiles para el aislamiento o la disección del cerebro y luego el corte real del cerebro. Lo que tenemos aquí es la solución de disección que está fría.Por lo general, está sobre hielo. Tenemos un cortador vibratomo que necesitamos para seccionar los cerebros. Tengo un recipiente que contiene solución de disección en el cual se monta el cerebro y luego se corta.Tengo varias herramientas que necesito para la extracción del cerebro. Tengo una placa de sacabocados. Es un sacabocados del 4 % que utilizo para mantener el cerebro en su lugar.Necesitamos una jeringa, un par de filtros estériles, platos de papel Rotman y platos de Petri de varios tamaños. Y esta es mi herramienta para pipetas de ratón. También tengo pipetas de vidrio estiradas aquí.Estas son capilares de vidrio que utilizo como herramientas de disección, así como para recoger los fragmentos cerebrales y, básicamente, manipularlos repetidamente. Nuestra solución enzimática contiene la solución de disección. Incluye L-cisteína para activar la pepsina, así como hidróxido de sodio 0,1 N para equilibrar el pH.Una vez que se añade la pepaina, la solución es un poco opaca y necesita aclararse antes de poder utilizarla realmente para digerir enzimáticamente el tejido. Y ahora estamos básicamente listos para comenzar el procedimiento. El fibro Slicer ha sido preparado.He insertado una cuchilla que secciona mi cerebro y también he colocado el recipiente debajo que contiene el tampón y sostiene el cerebro. Y estoy listo para montar el bloque de AGA en mi placa de soporte que también sostendrá el cerebro. Este AGA ya ha curado, es un AGA al 4 %, y ahora voy a cortar justo a través de una zona como esta.Y en los lados, básicamente, se recorta un tornillo sinfín de forma rectangular. Luego, uso una espátula y simplemente extraigo esta pieza del bloque del tornillo sinfín. Ahora voy a pegar este tornillo sinfín en mi placa de soporte con el lado plano del tornillo sinfín orientado hacia adelante.Entonces, este es el soporte al que se pega el cerebro y que luego se mantiene en su lugar mediante esta barrena. De este modo, cuando realizamos el corte en este sentido, el cerebro no se mueve hacia atrás. Ahora estamos listos para extraer el cerebro.Normalmente utilizamos un ratón P cero o un ratón P uno. Muy bien, esta es la cabeza del ratón decapitada y voy a retirar rápidamente el cráneo. Primero voy a cortar la banda muscular que se encuentra aquí y en el otro lado.Luego entro con mis tijeras. Tengo mucho cuidado de que el lado interno de las tijeras no dañe el cerebro. Y voy cortando alrededor del cráneo en ambos lados.Y ahora podemos simplemente levantar el cartílago y voy a usar mi pequeña ULA para extraer el cerebro de esta manera. Entonces, coloco este cerebro en mi placa de Petri, que he llenado con la solución de corte y que tiene un papel filtro Watman en el fondo. Lo que me gustaría hacer ahora es cortar la base del cerebro para obtener una superficie plana y firme que me permita montar el cerebro sobre mi soporte.Así que voy a colocar una gota muy pequeña de adhesivo en mi placa de soporte. Ahora voy a tomar mi cerebro con la espátula, utilizando mis pinzas curvas para ayudarme en este paso. Lo que quiero hacer es eliminar básicamente una gota del exceso de líquido que tengo procedente de la solución de disección, y luego voy a montar el cerebro contra mi soporte de aguja.Ahora estamos listos para transferir el cerebro al baño de tampón. Así que estoy agregando solución de disección a ese pequeño recipiente y voy a colocar el soporte que sostiene el cerebro. Se monta con el cerebro orientado hacia la cuchilla.Muy bien, ahora el cerebro está montado y voy a usar el cortador de fibras; estoy intentando localizar el inicio del cerebro, moviendo el cerebro hacia la hoja. Acabo de cortar un poco del bulbo olfativo. Ahora estoy moviendo mi hoja unos 600 micrómetros hacia abajo y realizo otro corte, que debería atravesar justo la corteza.Se va la corteza y sube hasta el, hasta el filo. Y estoy moviendo mi filo otros 600 micrómetros hacia abajo y estoy cortando la segunda sección. Es importante que esto se haga de forma continua sin interrupciones y de manera uniforme y suave.Y cuando retire la hoja, detenga el cortador de fibras. Ahora se usará una pipeta de vidrio que utilicé de forma incorrecta. En realidad, uso el extremo posterior y voy a mover esta sección cortical hacia arriba aquí y transferirla a una placa de Petri limpia.Avanzo a través del cerebro, siempre 600 micrómetros, hasta haber recolectado aproximadamente cinco o seis secciones para un ratón P cero o P uno. Y continúo hasta llegar al extremo final de la corteza. Ahora estamos listos para aislar la corteza del resto del cerebro.Vale, estoy utilizando estas pipetas de vidrio, que son pipetas de vidrio estiradas tan afiladas como herramientas de disección. Normalmente comienzo con la primera sección que tengo, que es la más pequeña y donde se encuentra el bulbo olfativo que debemos extraer. Además, también intento eliminar las meninges de esta preparación.Nuevamente, retire el bulbo olfativo de esta pieza, pelándolo y separándolo de las meninges. A veces hay fragmentos que no se pueden separar tan fácilmente, así que simplemente continúe y deje esos fragmentos atrás, conservando las piezas adecuadas. Siempre avanzo hacia un extremo y voy trabajando paso a paso, sección tras sección.Es importante que elimine las meninges y, además, cuando observe estas secciones, a veces querrá darles la vuelta para ver mejor dónde se encuentra el haz de fibras que contiene la mayor parte de las células no neuronales que realmente no desea en esta preparación. Bien, en esta sección puede ver claramente este haz de fibras debajo de la capa cortical. Por lo tanto, inserto la aguja justo entre donde termina la capa cortical y estoy señalando el haz de fibras que contiene la mayoría de las células no neuronales que estamos tratando de evitar en esta preparación.Así que estoy cortando a lo largo de esta línea, tratando de dejar los tractos de fibra atrás. Este es el paso en el que se pica el tejido en cubos pequeños. Muy bien, ahora estoy esterilizando mi solución enzimática a través de un filtro de 0,2 micrones unido a una jeringa.Y agrego eso directamente sobre mis fragmentos corticales, así mismo. Asegúrese de que haya suficiente líquido que rodee todos los fragmentos corticales, y luego estos fragmentos se colocan en un incubador a 37 grados durante 30 minutos, lo cual debería aflojar considerablemente el tejido. Así que han pasado 30 minutos desde que estos fragmentos corticales están incubando en el incubador.Mientras tanto, calenté un poco de medio neurobasal con suplemento B 27, en el que finalmente se colocarán estas células. También he preparado algunas soluciones aquí. La primera es la solución de disección.Así que es una solución de disección simple. Luego se transfieren a una solución con alto inhibidor de tripsina que contiene BSA como agente secuestrador y un PV para bloquear el componente del receptor NMDA. A continuación, pasan por tres lavados con BSA de bajo inhibidor de tripsina y un PV. Voy a retirar ahora estos fragmentos de la solución de propano y los transferiré a un tubo cónico que contiene la solución de disección DS.Estos agregados simplemente descenderán por gravedad y puede tardar uno o dos minutos hasta que todos se asienten en la parte cónica del tubo. Luego los tomaré nuevamente y los transferiré a la solución que contiene el inhibidor alto de tripsina. Nuevamente, debemos esperar hasta que estos agregados se asienten en el fondo del tubo.Hay un lavado más a través de una solución con alto inhibidor de tripsina y luego estos agregados se lavan con bajo inhibidor de tripsina. Después de mi último lavado y del inhibidor de enzima bajo, voy a transferir las células a mi medio neurobasal precalentado y comenzaré a disociar mecánicamente las células pasándolas arriba y abajo por una capilar de vidrio con un tamaño de orificio decreciente. Voy a triturar ahora las células y los agregados de tejido.Pero antes de hacerlo, eliminaré todos los restos que son visibles aquí. Hay, por ejemplo, proteína y ADN que salen de las células y forman esta masa tipo bola de algodón, una sustancia que se adhiere a los agregados de tejido. Desea eliminar esto primero porque obstruye la punta de su pipeta y usted está forzando el tejido a través de un diámetro más pequeño.Luego voy a romper algunos de estos capilares de vidrio para obtener una abertura del tamaño adecuado y poder mover mis células dentro y fuera de la abertura. Esta es una buena pipeta. Esta que ven es bonita y redonda, y no tiene bordes afilados.Voy a insertar esto en mi pipeta para ratón. Hay un filtro de 0,2 micrones entre medio y ahora voy a mover los tejidos dentro y fuera de mi capilar de vidrio. Por lo tanto, el primer proceso debería avanzar bastante sin problemas porque los agregados de tejido no son mucho más grandes que la abertura de la pipeta.Todo lo que desea hacer es aflojar el tejido. Luego, introduzco una punta de pipeta ligeramente más pequeña. Me gustaría tener una punta de pipeta redonda y bien definida.Esto tiene buen aspecto. Y nuevamente, todos los agregados se mueven dentro y fuera del tubo de una sola vez. Por lo tanto, el tejido ahora está muy blando y deshecho, de modo que si se vuelven a suspender estos agregados en medio, las células básicamente caerán por su propio peso.Ahora voy a transferir todas mis células disociadas a un tubo cónico fresco de 15 mililitros y las refrigeraré quizás dos o tres veces más, moviéndolas suavemente hacia arriba y hacia abajo para desagregar las células que aún se encuentran en esos grupos más grandes. Luego, queremos esperar uno o dos minutos para que los trozos grandes que aún están en el tubo se sedimenten. Además, es posible que tenga fragmentos de vidrio procedentes de las capilares de vidrio que rompió y que también deben sedimentar hasta el fondo.Luego podemos usar alícuotas de esto para sembrar sobre laminillas o placas recubiertas completamente con lisina. Estoy sembrando 80 microlitros sobre esta laminilla de vidrio que previamente ha sido recubierta con polilisina y forma una burbuja uniforme. Las células finalmente se asentarán y adherirán a la laminilla de vidrio.Entonces, después de aproximadamente una hora, las células se han sedimentado y voy a añadir muy suavemente algo más de medio a toda la placa. Puede darle un suave movimiento circular de esta manera. Luego, estas células se colocan en el incubador a 37 grados y mañana les añadiré medio condicionado.Bien, estas son las células corticales. Tienen apenas un poco menos de un día de edad. Fueron sembradas ayer y se puede observar que hay muchas neuronas, todas con numerosas prolongaciones neuronales, y también algo de debris celular.Esas son las células que no sobrevivieron. Y estas se eliminarán en los próximos ciclos de alimentación. Las células muertas son las células redondas muy pequeñas con membranas onduladas.Acabo de mostrarle cómo preparar estos cultivos corticales disociados. Es importante recordar que al retirar la corteza cortical de las secciones cerebrales, debe separarla de la sustancia blanca cortical por donde pasan las fibras, ya que contiene muchas células no neuronales. Además, al triturar las células, no lo haga en exceso, ya que esto prácticamente elimina la mayor parte de las células aisladas que ha obtenido hasta ahora.Así que tenga cuidado con los cortes de tejido y obtendrá un cultivo hermoso. Buena suerte en sus experimentos.

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