Evaluación de la senescencia inducida por la lesión y en Vivo de reprogramación en el músculo esquelético

El objetivo general de este protocolo es evaluar tanto la senescencia como la reprogramación in vivo en el músculo esquelético tras una lesión tisular. Este método puede ayudar a abordar preguntas fundamentales en el campo de la medicina regenerativa, como cómo mejorar la plasticidad celular para promover la regeneración muscular. La principal ventaja de esta técnica consiste en proporcionar un método fiable para detectar y cuantificar células senescentes en su entorno residente.

Recientemente se ha implicado a la senescencia celular en la reparación y regeneración de tejidos. Comprender los mecanismos mediante los cuales la senescencia contribuye a la reparación y regeneración del tejido ciertamente tendrá un impacto en la medicina regenerativa. Tuvimos la idea inicial de este método cuando investigamos el posible impacto del daño tisular en la reprogramación in vivo en el músculo esquelético.

Para comenzar este procedimiento, fije los portaobjetos con muestras de músculo en paraformaldehído al 1% y glutaraldehído al 0,2% en PBS durante cuatro minutos. A continuación, lave los portaobjetos con PBS dos veces, cada vez durante 10 minutos. Luego, lave los portaobjetos con PBS, pH 5,5 durante 30 minutos.

A continuación, incubar los cortes con la solución de X-gal a oscuras a 37 grados Celsius durante un mínimo de 24 horas. Posteriormente, lavar las laminillas con PBS tres veces, cada vez durante 10 minutos. Luego, fijar nuevamente las laminillas con PBS que contenga paraformaldehído al 1 % durante 30 minutos.

Finalmente, lave las laminillas con PBS tres veces. Posteriormente, contratiña con eosina al 0,2 % sumergiendo las laminillas en la solución de eosina durante un minuto. Luego, enjuáguelas brevemente con agua destilada.

Monte las laminillas con un medio de montaje acuoso que no sea fluorescente. Fije las laminillas con PBS que contenga paraformaldehído al 4% durante 10 minutos. Lávelas dos veces con PBS, cada vez durante 10 minutos.

Posteriormente, agregue la solución de permeabilización e incube durante cinco minutos. A continuación, lave los portaobjetos con PBS dos veces, cada vez durante cinco minutos. En el último lavado, agregue 200 microlitros de PBS, que contenga BSA al 0,25%, directamente sobre los portaobjetos durante cinco minutos.

Incube los portaobjetos con el anticuerpo primario anti-Nanog a 1,25 microgramos por mililitro durante la noche a 4 grados Celsius en PBS que contenga 5% de FBS. Lave los portaobjetos con PBS dos veces, cada vez durante 10 minutos. En el último lavado, use 200 microlitros de PBS que contenga 0,25% de BSA durante cinco minutos.

Posteriormente, incubar las laminillas con 100 microlitros de anticuerpo secundario RAB-HRP de un kit listo para usar durante 45 minutos. Luego, lavar las laminillas con PBS tres veces, cada vez durante cinco minutos, para eliminar el anticuerpo secundario. Después de eso, diluir el DAB en el tampón sustrato, proporcionado por el kit listo para usar.

Agite vigorosamente. Añada 100 microlitros de solución de DAB directamente sobre cada portaobjetos e incube durante un máximo de 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, elimine la solución de DAB enjuagando los portaobjetos con agua.

Contratincione las laminillas con la solución de rojo rápido durante dos minutos. Luego, lave las laminillas con agua nuevamente, brevemente. A continuación, deshidrátelas con etanol al 95 % durante cinco minutos, seguido de etanol al 100 % dos veces, cada vez durante cinco minutos.

A continuación, monte los portaobjetos con un medio de montaje de endurecimiento rápido. Observe los portaobjetos al microscopio en campo claro a 20x para evitar fondo. En este procedimiento, examine los portaobjetos y seleccione las dos secciones de mejor calidad en cada uno, con la mayor distancia posible entre ellas, basándose en la integridad del tejido, la calidad de la tinción y la contratincción.

Cuente las células positivas para SA-Beta-Gal en estas dos secciones y calcule el valor medio. Luego, determine el rango del tamaño del píxel seleccionando manualmente la célula positiva para SA-Beta-Gal más pequeña y la más grande. En la interfaz de ImageJ, haga clic en Analizar, Herramientas, Administrador de ROI, Analizar, Establecer medida.

A continuación, seleccione Área. Utilice la herramienta de selección y rodee la célula positiva para SA-Beta-Gal más pequeña y la más grande, y agréguelas al Administrador de ROI haciendo clic en Agregar. Después, mida los tamaños utilizando el botón Medir y guarde los valores para usarlos posteriormente.

A continuación, ajuste el parámetro de umbral para asegurar que se seleccionen todas las células positivas visibles. Convierta la imagen a escala de grises haciendo clic en Imagen, Tipo y luego 8 bits. Posteriormente, vaya a Imagen, Ajustar y Umbral.

Mueva el segundo cursor hasta que todas las células positivas para SA-Beta-Gal estén cubiertas en rojo, luego haga clic en Aplicar. Analice las partículas haciendo clic en Analizar, Analizar Partículas, seguido de Tamaño y aplique el valor definido anteriormente. Ingrese Circularidad, 0,00-1,00, y haga clic en Aceptar. Se mostrará un resumen de todas las partículas contadas en el Administrador de ROI.

Ahora, transfiera todas las partículas seleccionadas a la imagen original. Ajuste manualmente la selección para garantizar una cuantificación precisa. Añada células positivas o elimine las células falsas positivas.

Finalmente, mida el área delineando la sección utilizando la herramienta de selección. Haga clic en Administrador de ROI, Agregar y luego en Medir. Bajo el microscopio, cuente manualmente las células positivas para Nanog en campo claro a un aumento de 20x.

Se muestra aquí una representación esquemática para evaluar la reprogrmación in vivo y el nivel de senescencia tras una lesión muscular. A continuación se presentan imágenes representativas de la tinción de SA-Beta-Gal y Nanog en secciones congeladas de músculo esquelético dañado. Estas imágenes muestran la tinción de SA-Beta-Gal, contratenida con eosina, y la tinción de Nanog, contratenida con rojo rápido.

Los músculos no lesionados se muestran en la parte superior, mientras que los músculos lesionados se muestran en la parte inferior. Este gráfico muestra la cuantificación y correlación de células positivas para SA-Beta-Gal y células positivas para Nanog en secciones consecutivas a los 10 días posteriores a la lesión. Al realizar este procedimiento, es importante recordar incluir siempre un control negativo para asegurar la especificidad de la tinción.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar todos los métodos, como la inmunofluorescencia o la selección de diferentes marcadores de senescencia, en todo tipo de células, con el fin de responder preguntas adicionales, como la identidad celular de las células senescentes. Tras cada avance, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la senescencia o de la reparación y regeneración de tejidos exploraran cómo la senescencia celular puede promover la plasticidad celular para facilitar la reparación y regeneración de tejidos en mamíferos. Por tanto, tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo identificar tanto las células senescentes como las reprogramadas in vivo.