Name: Cuantificación de la abundancia y la carga de los niveles de ARN de transferencia en Escherichia coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprende a cuantificar la abundancia y carga de ARN de transferencia en Escherichia coli. Este método permite comparar niveles de ARN entre diferentes estados de crecimiento celular.

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Los autores agradecen a Marit Warrer excelente asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por el Consejo Danés de investigación independiente | Ciencias naturales [1323-00343B] y la Fundación Nacional Danés de investigación [DNRF120].

<ol><li>Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li>
<li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel%28%2B%29+and+Rel%28-%29+strains+during+amino+acid+starvation%3A+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li>
<li>Krüger, M. K., Sørensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li>
<li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li>
<li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li>
<li>Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+and+alternatives+in+reading+the+universal+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Errors and alternatives in reading the universal genetic code.</a> Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).</li>
<li>Traxler, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global%2C+ppGpp-mediated+stringent+response+to+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNAs+Mediate+the+Rapid+Adaptation+of+Escherichia+coli+to+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress.</a> PLoS Genet. 11 (6), e1005302(2015).</li>
<li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li>
<li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+codon+bias%3A+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li>
<li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+%28Asn%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li>
<li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation%3A+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li>
<li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18(2011).</li>
<li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li>
<li>McCarthy, B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0926655062903456">The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).</li>
<li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li>
<li>Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21460796">Ribosome degradation in growing bacteria.</a> EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).</li>
<li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li>
<li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+medium+for+enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).</li>
<li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li>
<li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe cómo medir simultáneamente el nivel de carga de concreto e. coli tRNAs y comparar los niveles relativos de los tRNAs en diferentes muestras. Son los puntos críticos del protocolo 1) manejar las muestras de tal manera que se mantienen los niveles de carga celular tRNA, 2) para normalizar la cantidad de tRNA de tal manera que pueden compararse confiablemente niveles relativos del tRNA en diferentes muestras y 3) para el sp ecificity de las sondas seleccionadas para los tRNAs de interés. Est...

A continuación, presentamos un método para cuantificar el ARNt específico y medir su carga niveles por borrar norteño. El método se basa en una técnica desarrollada por Varshney et al. 1. recolección de las células en ácido tricloroacético (TCA) y manteniendo las muestras a 0 ° C a lo largo de la purificación de RNA, el enlace éster entre el tRNA y el aminoácido es conservado2,3,4. TRNAs Aminoacylated pueden distinguirse de sus contrapartes nonacylated por electroforesis y blotting norte, debido a una movilidad disminuida de la aminoacylated tRNA en el gel, causado por el ácido amino covalentemente5. Además, presentamos un protocolo para normalizar la cantidad de tRNA por adición de spike en células overexpressing el tRNA raramente usadoselC 4.
tRNAs son algunas de las moléculas más abundantes en la célula bacteriana y una parte esencial de la maquinaria de traducción. tRNAs unen aminoácidos y transfieren a los ribosomas traduciendo. La Unión de aminoácidos para tRNAs (aminoacilación o carga) facilita el aminoacil tRNA sintetasas. La abundancia relativa de diferentes tRNAs cargados es importante para asegurar la fidelidad de la síntesis de proteínas, debido a insuficiente representación del cognado cargado que tRNA para un codón determinado ARN mensajero (ARNm) aumenta la probabilidad de que un tRNA cerca de cognado entregar erróneamente su aminoácido a la cadena polipeptídica creciente en el ribosoma6. La importancia del tRNA cargado se refleja en la amplia respuesta de la célula de e. coli a una severa caída en los niveles de carga de un tRNA; la respuesta estricta. Durante la respuesta estricta disminuye la síntesis de ARNt, ARN ribosómico y mRNAs mayoría a favor de la transcripción de los mRNAs específicos asociados con aminoácido biosíntesis y estrés de supervivencia, y disminuye drásticamente la tasa de crecimiento de las células7 . Además, trabajos recientes y otros ha demostrado que e. coli activamente degrada a la mayoría de su tRNA en respuesta a las tensiones que limitan la traducción4,8, sugiriendo que puede ser el ajuste de los niveles de tRNA importante para hacer frente a dichas tensiones. Así, mediciones fiables de abundancias del tRNA y los niveles de carga será una herramienta importante para comprender plenamente las respuestas de estrés bacteriano.
E. coli se utiliza comúnmente para expresar proteínas recombinantes y debido a las diferencias en la utilización de codones entre especies, expresión óptima es un problema a menudo9. Esto puede eludirse por expresión de tRNAs adicionales necesarios para traducir el mRNA recombinante10. Las medidas de tRNA carga niveles en estas cepas podrían guiar los esfuerzos de solución de problemas y ayudar a optimizar la expresión de la proteína.
Este método también permite la detección de "confusiones"; un aminoacylated de molécula de ARNt con un aminoácido no cognado. Aminoacilación por diferentes aminoácidos puede causar un tRNA migrar con velocidades ligeramente diferentes a través de geles de poliacrilamida1,11. En algunos casos, el método también puede utilizarse para distinguir patrones de modificación diferentes tRNAs idéntico3.
Otro había establecido procedimiento bioquímico para la investigación del tRNA carga niveles es periodato de oxidación. El método se basa en la observación que aminoacylated tRNA está protegido de periodato de oxidación y tRNA descargada no es. Después periodato de tratamiento de la oxidación la recarga de los tRNA se utiliza para estimar los niveles de carga del ARN cosechado. Sin embargo, la recarga de varios tRNAs se ha demostrado para ser afectado por el tratamiento proporcionando alguna inexactitud12. El método presentado aquí medidas de carga directamente del RNA purificado, excluyendo así cualquier sesgo de reacciones químicas o enzimáticas. Una limitación de este método es que sólo una especie de tRNA se detecta a la vez, aunque el mismo Northern blot puede ser despojado y reprobed para varios tRNAs, es lento y algo laborioso recopilar datos sobre muchos tRNAs.
Una manera confiable de normalización de las muestras entre sí es vital en los estudios donde el objetivo es comparar los niveles relativos de una molécula a través de diferentes muestras. Aquí presentamos un procedimiento de normalización para RNA donde una pequeña alícuota de e. coli las células overexpressing el tRNA raraselC se agrega como un punto en a todas las muestras experimentales antes de la purificación del ARN. Este método es útil no sólo al examinar tRNAs pero para la cuantificación relativa de cualquier especie de ARN cuando la configuración experimental es tal que no RNA endógeno puede confiar que presentan en la misma concentración celular en todas las muestras. Por ejemplo, el nivel de una "limpieza" del ARN ribosómico RNA-como a menudo se utiliza como una referencia endógena para comparar las cantidades relativas de otro ARN entre diferentes muestras13. Pero esto es de poca utilidad si la concentración celular de la RNA de referencia varía entre las muestras, como puede ser el caso de ARN ribosómico si muestreo ocurre durante un estrés respuesta15,16,17 o entrada en fase estacionaria17. La adición de spike en células en las muestras experimentales antes de purificación de RNA proporciona una forma sólida y precisa de normalización independiente de la configuración de muestreo. Otra forma de normalización es la adición de uno o más punto en RNAs a las muestras experimentales después de la purificación de RNA. Sin embargo, este método no tiene en cuenta para las diferencias en la recuperación de RNA entre muestras.
Usando células de e. coli que sobrexpresan la referencia RNA como spike-en las células (ver figura 1) en un experimento de e. coli tiene el inconveniente que resulta además de una pequeña cantidad de exógena e. coli total de RNA para la muestras. Se corrigen para esta incorporación mediante el análisis de una muestra que contiene solamente spike en células en paralelo con las muestras experimentales (véase el Northern blot en carril figura 2, con la etiqueta "selC"). El protocolo que se presenta está desarrollado para e. coli K-12 pero es probable que sea aplicable para la mayoría de las especies bacteriana.

<table><tbody><tr><td>Urea</td><td>Merck</td><td>57-13-6</td><td>Pureza >99%</td></tr><tr><td>Poliacrilamida</td><td>Serva</td><td>79-06-7</td><td></td></tr><tr><td>Bis (N,N'-Metileno-bis-acrilamida)</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0201</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético (TCA)</td><td>Sigma</td><td>76-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Merck</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetato</td><td></td><td></td><td></td>de sodio</tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td><td></td><td></td><td></td>clorhídrico</tr><tr><td>Cloruro de</td><td></td><td></td><td></td>sodio</tr><tr><td>NaH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrato</td><td></td><td></td><td></td>de sodio</tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arenque Esperma ADN</td><td>Sigma</td><td>100403-24-5</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P32 y gamma; ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleótidos de ADN (sondas)</td><td>TAG Copenhague</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana Hybond N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroblotter</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Horno <td></td><td></td><td></td>de<td>hidridización</td></tr><tr><td>Geiger-M&uuml; Tubo</td><td></td><td></td><td></td>ller</tr><tr><td>Pantalla de generador de imágenes de fósforo</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr>Tubo <td></td><td></td><td></td>de<td>hibridación</td></tr><tr><td>Matraces</td><td></td><td></td><td></td>de</tr><tr><td>cultivo Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml Tubos</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td>de<td>centrífuga de 20 ml</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de la abundancia y la carga de los niveles de arn de transferencia en escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

ARN de transferencia (tRNA) es una parte esencial de la maquinaria traduccional en cualquier organismo. ARNt se unen y transferir los aminoácidos al ribosoma traduciendo. Los niveles relativos de tRNAs distintos y la proporción de aminoacylated tRNA al tRNA total, conocido como el nivel de carga, son factores importantes en la determinación de la exactitud y velocidad de traducción. Por lo tanto, la abundancia y niveles de carga de tRNAs son variables importantes a medir en el estudio de la síntesis de proteínas, por ejemplo en diversas condiciones de estrés. Aquí, describimos un método para cosechar tRNA y medición directa de la abundancia relativa y el nivel absoluto de la carga de la especie específica del ARNt en Escherichia coli. El tRNA se recolecta de tal manera que se conserve el vínculo inestable entre el ARNt y su aminoácido. El RNA entonces se somete a electroforesis en gel y Northern Blot, que resulta en la separación de los tRNAs cargados y descargados. Los niveles de tRNAs específicos en diferentes muestras se pueden comparar debido a la adición de espiga en las células para la normalización. Antes de la purificación del ARN, agregamos 5% de células de e. coli que sobreproducción la tRNA raraselC a cada muestra. La cantidad de las especies de tRNA de interés en una muestra luego se normaliza la cantidad de tRNAselC en la misma muestra. Además de la espiga en las células antes de la purificación del ARN tiene la ventaja sobre adición de purificada spike en RNAs que también explica las diferencias en la eficiencia de la lisis de células entre las muestras.

Utilizando el procedimiento descrito aquí, la abundancia y carga se miden los niveles de tres tRNAs en e. coli K-12 antes y durante el hambre de aminoácidos.
El auxotroph arginina cepa NF9154 (leu thr su argH thi mtl supE44) se cultivaba durante al menos diez generaciones en MOPS medio mínimo suplementado con 0.4% de glicerol, 50 treonina μg/mL, leucina, arginina e histidina 5 μg/mL a 37...

Aquí presentamos un método para medir directamente el ARN de transferencia carga niveles de purificada de Escherichia coli RNA como una forma de comparar niveles relativos de ARN de transferencia, o cualquier otro RNA corto, a través de diferentes muestras basadas en la adición de espiga en células expresan un gen de referencia.

Cuantificación de la abundancia y la carga de los niveles de ARN de transferencia en Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

El objetivo general de este experimento es cuantificar la abundancia y los niveles de carga de ARN de transferencia en Escherichia coli. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular, como cómo cambian los niveles de carga del ARNt en diferentes estados de crecimiento. La principal ventaja de este método es que los niveles de ARN se pueden comparar cuantitativamente incluso entre estados de crecimiento que alteran drásticamente la composición del ARN en las células.Comience este experimento cultivando cultivos experimentales y de E. coli de acuerdo con el protocolo de texto. Cultive el cultivo de espiga a 37 grados centígrados, mientras agita a 160 RPM. Cuando el cultivo de espiga ha alcanzado una OD436 de aproximadamente 0,1, induzca la expresión de la célula C de ARNt mediante la adición de IPTG.Haga crecer el cultivo hasta que alcance un OD436 de aproximadamente 0,5. Luego, mueva el cultivo a hielo hasta que se hayan recolectado todas las muestras. Después de eso, precaliente un matraz de cultivo con tapa de 100 mililitros que contenga cuatro mililitros de TCA al 10% para cada muestra en un baño de agua a 37 grados centígrados.Mida y registre la OD436 de los cultivos experimentales directamente antes de la recolección de células. Luego, transfiera cuatro mililitros de cultivo a un matraz que contenga TCA precalentado. Mezcle la muestra a mano agitando el matraz durante cinco segundos, lo que desactivará inmediatamente todas las actividades enzimáticas preservando los niveles de carga de los ARNt.Cuando se hayan recogido todas las muestras, añada un 5% de células con pico a cada muestra. Prepare también una muestra de control que conste únicamente de células con espiga, tal como se describe en el protocolo de texto. Para iniciar la extracción de ARN, vierta ocho mililitros de cada muestra, incluidos los controles, en un tubo de centrífuga enfriado con hielo.Centrifugar las muestras a 9,500 x G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Después de eliminar el sobrenadante por completo, vuelva a suspender el pellet en 0,3 mililitros de acetato de sodio frío, que contiene 10 mililimolar EDTA. Transfiera cada muestra a un tubo de microcentrífuga frío de 1,5 mililitros y agregue 0,3 mililitros de fenol equilibrado con el tampón, utilizado para volver a suspender el pellet.A continuación, haga un vórtice de cada muestra 10 veces durante 15 segundos cada vez. Con al menos un minuto a cero grados centígrados entre cada vórtice, para mantener las muestras frías. A continuación, centrifugar las muestras a 20.000 x G a cuatro grados centígrados durante 15 minutos.Transfiera la cara superior o de agua a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue 0,3 mililitros de fenol frío a la cara del agua y agite las muestras cuatro veces y 15 segundos cada una como se describió anteriormente. A continuación, centrifugar las muestras a 20.000 x G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Transfiera la cara del agua a un nuevo tubo de microcentrífuga fría de 1,5 mililitros y agregue 2,5 volúmenes de etanol frío al 96%. Luego, incuba los tubos a 20 grados centígrados durante una hora para precipitar el ARN. Centrifugar las muestras a 20.000 x G a cuatro grados centígrados durante 30 minutos.Después de quitar el sobrenadante, agregue con cuidado un mililitro de etanol frío al 70% al pellet de ARN, asegurándose de no alterarlo. Invierta el tubo suavemente una vez, para lavarlo con etanol. Finalmente, centrifugar a 20, 000 x G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Retire el sobrenadante por completo y seque al aire el pellet hasta que el etanol se elimine por completo. A 20 microlitros de acetato de sodio frío que contiene 1 milimolar EDTA, vórtice vigorosamente para volver a suspender el pellet. Para iniciar la electroforesis, mezcle cuatro microlitros de cada muestra con seis microlitros de tampón de carga.Cargue las muestras, incluidos los controles, en un gel de poliacrilamida 6,5 de 0,4 milímetros de espesor que contenga ocho tampones molares de ureal y 0,1 molares de acetato de sodio. Luego, separe el ARN ejecutando la electroforesis a 10 voltios por centímetro de gel a cuatro grados centígrados durante aproximadamente 20 horas hasta que el tinte azul de bromofenol llegue al fondo del gel. Separe con cuidado las dos placas de vidrio para que el gel permanezca en una de ellas.Use el área del gel del tinte de xileno cianol y 20 centímetros hacia abajo hacia el tinte de bromofenol para el secado. Corta un pedazo delgado de papel de filtro hasta el tamaño del área de secado deseada. Coloque el papel de filtro encima de la parte del gel que se usará para secar.Corta y desecha las partes del gel que no estén cubiertas con papel de filtro. A continuación, utiliza el papel de filtro para levantar con cuidado el gel y separarlo de la placa de vidrio. Coloque una membrana de nailon cargada positivamente encima del gel y séquela electrobólicamente en un tampón de transferencia a 20 voltios durante 90 minutos.Termine reticulando el ARN a la membrana mediante luz ultravioleta. A continuación, coloque la membrana reticulada en un tubo de hibridación y agregue seis mililitros de solución de hibridación. Gire el tubo a 42 grados centígrados durante una hora para prehibridar la membrana.A continuación, añada 30 sondas de ADN oligonucleótido radiactivo molar pico, cinco cebadas y marcadas con P32. Gire para incubar la membrana con la sonda a 42 grados centígrados durante la noche. Después de la incubación, utilice una pipeta desechable de 10 mililitros para retirar la sonda.A continuación, lave rápidamente la membrana dos veces en el tubo de hibridación, en 15 mililitros de solución de lavado a temperatura ambiente. Mueva la membrana a un recipiente de plástico plano, cúbralo con la solución de lavado y cierre la tapa. Incubar la membrana en un agitador a temperatura ambiente durante 30 minutos.Cambie la solución y continúe lavando hasta lograr una relación señal-ruido satisfactoria. Utilice un tubo Geiger Muller para obtener la relación señal-ruido, comparando la radiación de la zona donde la sonda se ha hibridado con el ARNt, con la radiación de una zona vacía. Después de eso, envuelva la membrana firmemente en una envoltura de plástico y séllela herméticamente soldando.Coloque esta membrana en una pantalla de imágenes de fósforo. Después de un tiempo de exposición adecuado, escanee la pantalla con un escáner láser y guarde el archivo en formato gel. A continuación, cargue el archivo de gel en el software de imágenes.Dibuje una línea vertical a lo largo de cada uno de los carriles de muestreo de modo que abarque la mayor parte del ancho del carril y excluya los bordes de las bandas en los que la señal puede ser desigual. Para visualizar los recuentos de cada carril, haga clic en análisis y, a continuación, en crear gráfico. Defina manualmente los dos picos que representan el ARNt cargado y no cargado de cada carril.Después de eso, haga clic en análisis y luego, informe de área para obtener recuentos de cada pico. Finalmente, registre el área debajo de cada uno de los dos picos. Calcule los niveles de ARNt como se describe en el protocolo de texto.Este método se utilizó para medir la abundancia de varios ARNt y E. Coli nf915 antes y durante nuestra inanición de arginina. En la parcela norte hibridada con diferentes sondas de ARNt, hay una clara separación entre las bandas que representan el ARNt cargado de las bandas que representan el ARNt sin carga. El perfil de radiación a lo largo de cada carril se obtuvo de las manchas del norte utilizando software de imágenes.La señal de radiación de cada carril se cuantificó aislando cada uno de la mancha. Un gráfico que representa la cuantificación de la señal de un solo carril, muestra dos picos. El pico izquierdo proviene del ARNt aminoacilado y el derecho del ARNt desacilado.El área debajo de cada pico se exporta para su posterior análisis. La cuantificación de las bandas de la transferencia de norte muestra que la abundancia relativa de todas las especies de ARNt analizadas disminuyó rápida y significativamente durante la inanición de aminoácidos. Por otro lado, los niveles de carga de ARNt del ARNt que acepta la arginina disminuyeron rápidamente tras la eliminación de la arginina y luego aumentaron ligeramente durante el período de inanición.Sin embargo, los niveles de carga de los otros ARNt aumentaron ligeramente después de la inanición y luego disminuyeron a niveles casi previos a la inanición. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar el ARN de una manera que se pueda cuantificar la carga y la abundancia de ARNt y cómo usar las células de pico para la normalización. A lo largo de este procedimiento, es importante recordar que debe mantener el ARN frío y ácido para evitar la hidrólisis del ARN.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Se describe un método para el análisis de microarrays para determinar los niveles relativos de todos los tRNAs aminoacilación...

Todo el genoma análisis de Aminoacilación (de carga) Niveles de tRNA utilizando microarrays

Fuente: Stenum, T. S., et al. Cuantificación de la abundancia y los niveles de carga de ARN de transferencia en Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demuestra el uso de electroforesis en gel y blot septentrional para detectar y comparar los niveles de carga de los ARN de transferencia en E. coli separando las formas aminoaciladas y desaciladas.

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Los estudios de biomoléculas in vivo son cruciales para comprender la función molecular en un contexto biológico. Aquí describimos un método novedoso que permite la internalización de biomoléculas fluorescentes, como el ADN o las proteínas, en microorganismos vivos. También se presenta y discute el análisis de datos in vivo registrados por microscopía de fluorescencia.

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Aquí, el poder de una inserción al azar de un elemento de DNA no codificante mediada por transposones se utilizó para resolver su posición cromosómica óptima.

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En este método, cuantificamos la afinidad de unión de proteínas de unión al ARN (RBP) a sitios de unión cognados y no cognados utilizando un ensayo de reportero simple, vivo y en células bacterianas. El ensayo se basa en la represión de un gen reportero.

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La tecnología MAPS se ha desarrollado para escudriñar el targetome de un ARN regulador específico in vivo. El sRNA de interés está etiquetado con un aptámero MS2 que permite la co-purificación de sus socios de ARN y su identificación por secuenciación de ARN. Este protocolo modificado es particularmente adecuado para bacterias Gram-positivas.

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