Name: Microirradiation láser para estudiar In Vivo las respuestas celulares al daño en el ADN Simple y complejo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a usar la microirradiación láser para inducir daños simples y complejos en el ADN y estudiar la señalización celular y el ensamblaje de factores de reparación in vivo.

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Agradecemos al Dr. Akira Yasui en la Universidad de Tohoku, Japón para el plásmido de expresión de GFP-NTH1 y Dr. Eros Lazzerini Denchi en el Scripps Research Institute, La Jolla, California de TRF2 YFP y plásmidos de expresión de EGFP 53BP11220-1711 . Este trabajo fue financiado por la oficina de investigación científica de la fuerza aérea (FA9550-04-1-0101) y la Fundación Beckman Laser Institute Inc. (a M.W.B), la beca de la Fundación Ford de la Academia Nacional de Ciencias (B.A.S) y MCB NSF-1615701 y CRCC CRR-17-426665 (a. K. Y.).

Los autores no tienen nada que revelar.

Las ventajas de la utilización de láser microirradiation para la investigación DDR son:
1. es factible inducir diferentes tipos y cantidades de ADN dañan por roturas de cadena simple a complejo daño en el ADN, y para detectar factores de reparación diferentes a la DNA dañan sitios mediante el ajuste de los parámetros de la irradiación láser. También es posible infligir daño varias veces en el mismo núcleo de la célula con el fin de evaluar los efectos de transporte (como en la <strong...

En Vivo Señalización de daño de ADN no es haber entendido bien In vivo, el ADN es acomplejado con histonas y otros factores para formar fibras de cromatina. Regulación de la estructura de la cromatina es de suma importancia para el metabolismo del ADN. Por ejemplo, la variante de la histona H2AX es fosforilada por la ataxia-telangiectasia mutado (ATM) y otras cinasas siguiente doble cadena rompe inducción (DSB) y es importante para la amplificación de la señal de OSD daños así como proporcionar un sitio para otro factores. Difusión de elección de vía de señalización y reparación de daños parecen ser críticamente influenciado por la estructura de la cromatina locales en sitios de daño1. Un número de remodelación factores, histona chaperonas y enzimas modificadoras de histonas de la cromatina son reclutados en efecto dañar sitios y son importante para la reparación del ADN eficiente, destacando la importancia de la regulación de la cromatina en la DDR y reparar2 , 3 , 4. Además, se observó sitio daño clustering o reposicionamiento en levadura y drosophila5,6,7,8, de relocalización de loci de genes en el compartimiento subnuclear asociado con genes regulación9,10. Recientes estudios en ratón y células humanas también revelaron movilización sitios web DSB, que influencias reparación fidelidad y vía elección11,12. Esto plantea la posibilidad que DDR y reparación puede también ser íntimamente arquitectura nuclear, organización de orden superior cromatina y cromosoma dinámica en el núcleo celular. Por lo tanto, es fundamental para desarrollar métodos de alta resolución para estudiar DDR y reparar procesos en el contexto del ambiente endógeno nuclear en una célula viva para entender las consecuencias a corto y largo plazo de daño en el ADN.
Papel crítico de PAR polimerasa (PARP) en medir el grado y tipo de daño y regula el ensamblaje de la proteína en el sitio de daño PARP1 es un sensor de DNA nick rápidamente activado por daño en el ADN que desempeña un papel crítico en la reparación de ADN13. PARP1 originalmente fue pensado para funcionar junto con rayos x reparar Cruz complementando 1 (XRCC1) para facilitar la reparación de la supresión de base (BER), pero estudios recientes revelan su papel en otras vías de reparación del ADN, incluyendo reparación DSB14. Activa PARP1 utiliza nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) como sustrato a ADP-ribosylate varias proteínas objetivo, incluyendo sí mismo. Esta enzima y otros miembros de la familia han atraído mucha atención en los últimos años como inhibidores de la PARP han surgido como prometedores medicamentos para el cáncer. Aunque los inhibidores de la PARP inicialmente fueron encontrados para ser eficaz en el gen del cáncer de mama (BRCA)-transformado células de cáncer de mama, ahora hay una gran cantidad de evidencia de sus efectos en mono - y combinación de terapias junto con ADN dañando agentes, radiación contra un amplio espectro de cánceres con mutaciones que no se limita a BRCA15,16,17,18,19,20.
A nivel molecular, activación de la PARP fue demostrada que desempeñan un papel crítico en la organización de la estructura de la cromatina locales en sitios de daño. Contratación dependiente del PAR de las enzimas de modificación de la cromatina facilita la reparación DSB y dictados reparacion opciones de camino, sugiriendo el papel importante del andamiaje de modificación PAR en sitios de daño. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 recientemente demostramos la exclusión de la proteína p53-1 (53BP1) dañen sitios por PAR 32, proporcionando una explicación alternativa para el hyperactivation 53BP1 dependiente de endjoining no homóloga ( NHEJ) por PARP inhibidor y destacando la importancia de PARP en OSD reparación vía elección33,34. PARP1 también directamente PARylates y afecta a la reparación de la actividad de la DNA múltiples factores14.
Usando Microirradiation de láser como una herramienta para estudiar DDR y reparación en Vivo Microirradiation láser para producir sub-micron alteraciones en cromosomas individuales primero fue descrito en 196935 y revisado en detalle en 198136. Varias décadas más tarde, microirradiation laser fue demostrado para inducir daño de la DNA en una región definida Submicrométrica en el núcleo celular y fue demostrado para ser una técnica valiosa para el estudio de reclutamiento o modificaciones de los diversos factores de lesiones del ADN in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. este método permite la detección de aquellos factores que no forman distintos focos inducido por irradiación (IRIF) en sitios de daño39,42. También es posible examinar la dinámica espacio-temporal de los cambios estructurales de la cromatina en los sitios de daño y en el resto del núcleo. Cuidadosamente comparamos el DDR inducida por láser diferentes sistemas y poder evaluar la relación entre el tipo de daño en el ADN y el microirradiation condiciones32,43,44, 45. Los patrones de reclutamiento aberrante de 53BP1 y telomeric repetición factor de Unión 2 (TRF2) fueron observados en los estudios previos de daños del láser, que sirvió de base para la preocupación recurrente por la naturaleza "non-physiological" del daño inducido por el láser46 ,47,48,49. Encontramos que estas aparentes discrepancias podrían explicarse ahora por PARP diferencial señalización que indicadores de la cantidad y la complejidad del daño inducido32. Confirmamos que: 1) laser-microirradiated las células (incluso después de la irradiación de energía de entrada alta) son arrestadas en interfase en una forma de control dependiente del checkpoint de daños y permanecer viables (al menos hasta 48 h)32,50; y 2) contratación de factor de reparación o modificaciones fielmente lo observado con el tratamiento con agentes perjudiciales convencionales de ADN y la inducción de OSD por endonucleasas32,39,42, recapitular 44,50,51,52. Estos resultados apoyan fuertemente la relevancia fisiológica de estudiar respuestas celulares inducidas por daños de láser.

<table><tbody><tr><td>Ti:Zafiro NIR láser de femtosegundo pulsado Mira-900</td><td>Coherent Inc.</td>Microscopio invertido <td>Mira 900</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>63X/1.4 NA objetivo</td><td>Zeiss</td><td>APOCHROMAT Ph3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Platina de rotación compacta&nbsp;</td><td>Newport Corp</td><td>PR50PP</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Warner</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de calefacción</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>10918</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de incubación de gas</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>11920</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de potencia y energía láser (RoHS)</td><td>Campo</td><td>coherenteMaxII-TOP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-R2 Cámara CCD digital</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 META Microscopios de escaneo láser</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X/1.3 NA Zeiss Plan APO</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm Platos cuadriculados&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD-D</td><td></td></tr><tr><td>PtK2 células epiteliales renales</td><td>ATCC</td><td>CCL 56&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Medio independiente del CO2&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>MEM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>suplementado con L-Glutamina, 4% FBS</td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Fisher Scientific 25030081</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Timidina&nbsp;</td><td>&nbsp; SIGMA</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>medios sin suero&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Opti-MEM I Medios de Suero Reducidos)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Dímero de pirimidina anti-cicolbutancia (CPD) (ratón)</td><td>Kamiya Biomedical Company</td><td>MC-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-XRCC1 (ratón)</td><td>Gene Tex Inc</td><td>GTX72311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-53BP1 (conejo)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-22760</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CtIP (conejo)</td><td>Abcam</td><td>ab70163</td><td></td></tr><tr><td>Polímeros anti-PAR (ratón)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-SA216-0100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR (conejo)</td><td>Trevigen</td><td>4336-BPC-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRF2 (ratón)</td><td>Novus Biological&nbsp;</td><td>NB100-56506</td><td></td></tr><tr><td>Anti 6-4PP (ratón)</td><td>Kamiya Biomedical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad21 (conejo)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (para la detección de cohesinas)</td>generado en el laboratorio <td></td><td></td>de <td>Yokomori (KY)</td></tr><tr><td>Anti-Rad51 (Conejo)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8349</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ku70 (ratón)</td><td>&nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100-102</td><td></td></tr><tr><td>8-oxiguanina&nbsp;</td><td>Trevigen, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-PARP1&nbsp; (Conejo)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>generado en KY lab</td><td></td><td>ref 43</td></tr><tr><td>&nbsp; Anti-hCAPG (Conejo)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (para la detección de condensina)</td><td>generado en KY lab</td><td></td><td>ref 42</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>&nbsp; Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Burro Anti-Ratón Alexa Fluor 488 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>HiPerFect siRNA Reactivo de transfección</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reactivo de transfección</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>GFP-SMC1 línea celular estable&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>generado en el laboratorio</td><td></td> KY <td>ref 49 &nbsp;</td></tr><tr><td>Línea celular estable GFP-NEIL2</td><td>generada en KY lab</td><td></td><td>ref 54</td></tr><tr><td>Línea celular estable GFP-NTH1</td><td>generada en KY lab</td><td></td><td>ref 32</td></tr><tr><td>Plásmido GFP-SMC1</td><td>generado en KY lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plásmido GFP-Ku</td><td>generado en KY lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-MDC1 (conejo)</td><td>&nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100 &ndash; 395</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gH2AX (conejo)</td><td>&nbsp; Millipore</td><td>07&ndash; 164</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-53BP1(1220-1711) Línea celular estable PtK2</td><td>generada en el laboratorio</td><td></td> de Berns <td>ref 32</td></tr><tr><td>TRF2-YFP Línea celular estable PtK2</td><td>generada en el laboratorio</td><td></td> de Berns <td>ref 32</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de PARG</td><td>Trevigen</td><td>4680-096-03</td><td></td></tr><tr><td>ADN&ndash; Inhibidor de PKcs&nbsp; NU7026&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N1537</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ATM KU55933</td><td>&nbsp; Calbiochem</td><td>118500</td><td></td></tr><tr><td>Olaparib&nbsp;</td><td>Tecnología Apexbio</td><td>A4154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído&nbsp;</td><td>MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA CIENCIA MS</td><td>100503-916 (EA)</td><td></td></tr><tr><td>Cantidad Un software de análisis 1-D versión 4.6.9</td><td>Bio-Rad</td><td>SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC&nbsp;</td><td>Programa de análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Excel</td><td>programa de hoja de cálculo</td><td>de Microsoft</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>detergente</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) 10X sin calcio y magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200166</td><td>diluido a 1X&nbsp;</td></tr></tbody></table>

microirradiation láser para estudiar in vivo las respuestas celulares al daño en el adn simple y complejo

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Daño de la DNA induce respuestas concretas de reparación y señalización de la célula, que es fundamental para la protección de la integridad del genoma. Microirradiation laser se convirtió en una valiosa herramienta experimental para investigar el ADN daños respuesta (DDR) en vivo. Permite análisis unicelular alta resolución en tiempo real de la dinámica macromolecular en respuesta a daño inducido por el láser confinado a una región Submicrométrica en el núcleo celular. Sin embargo, varias condiciones de láser han sido utilizadas sin apreciación de las diferencias en los tipos de daño inducido. Como resultado, la naturaleza de los daños es a menudo no bien caracterizado o controlado, provocando inconsistencias evidentes en los perfiles de contratación o modificación. Hemos demostrado que las condiciones de irradiación diferentes (es decir, diferentes longitudes de onda así como diferentes potencias de entrada (cultivos) de un láser de femtosegundo (fs) y de infrarrojo cercano (NIR)) inducida por distintos conjuntos de proteínas DDR y reparación. Esto refleja el tipo de daño en el ADN producido. Este protocolo describe cómo titulación laser de potencia de entrada permite la inducción de diferentes cantidades y la complejidad del daño de la DNA, que pueden controlarse fácilmente por la detección de daño base y reticulación, diferencial poli (ADP-ribosa) (PAR) de señalización, y Asambleas de factor de reparación específica de la vía en sitios de daño. Una vez determinadas las condiciones de daño, es posible investigar los efectos de daños diferente complejidad y daño diferencial de señalización, así como agotamiento de factor aguas arriba de cualquier factor de interés.

Usando células PtK2 estable expresaban EGFP 53BP11220-1711 o TRF2 YFP, láser alimentación valoración se llevó a cabo para determinar las condiciones óptimas para su contratación (figura 1)32.
En los sitios de daño del láser de alta potencia de input, el agrupamiento significativo de CPD (daño reticulando típicamente generado por daño ultravioleta (UV)) así como GFP-NTH1 ADN glicosilasa que específicamente reconoce el daño de base...

El objetivo de este protocolo es describir cómo utilizar microirradiation de láser para inducir a diferentes tipos de daños en el ADN, como roturas de cadena relativamente simple y complejo daño, para el estudio de ADN daños reparación y señalización de factor Asamblea en sitios de daño en vivo .

Microirradiation láser para estudiar In Vivo las respuestas celulares al daño en el ADN Simple y complejo

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

El objetivo general de este protocolo es describir cómo utilizar la microirradiación con láser para inducir diferentes tipos de daño en el ADN, incluyendo roturas simples de cadena y daño complejo, con el fin de estudiar la señalización del daño en el ADN y el ensamblaje de factores de reparación in vivo. En las décadas de 1960 y 1970, enfocamos un haz de láser a través de un microscopio, que pueden ver detrás de mí, y logramos dañar una pequeña región de un cromosoma. La célula se dividió, sobrevivió, y no pudimos comprender por qué.Bueno, 40 años después, ahora estamos utilizando este método para estudiar selectivamente la reparación del ADN, y eso es lo que verán hoy. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reparación del ADN, como cómo se reconoce y procesa el daño en el ADN y cómo se propaga la señal de daño en la célula. La microirradiación con láser permite el análisis en tiempo real, con alta resolución y a nivel de célula individual, de la dinámica de macromoléculas en respuesta al daño en el ADN confinado a una región de varias micras dentro del núcleo celular.Sin embargo, se han utilizado diversas condiciones de láser sin tener en cuenta las diferencias en los tipos de daño inducidos, lo que provoca inconsistencias en las respuestas celulares, el reclutamiento de factores y las modificaciones. Para expresar proteínas marcadas con fluorescencia en células HeLa, el día uno, siembre de seis a ocho veces 10 a la cuarta células en 0,5 mililitros de medio de cultivo en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Luego coloque la placa en el incubador de cultivo celular.El segundo día, realice la transfección de ADN mediada por liposomas diluyendo 0,3 microgramos de un ADN plasmídico de expresión en mamíferos que codifica un factor de reparación del ADN marcado con un fluoróforo en 25 microlitros de medio de cultivo sin suero. Aquí, utilizamos el dominio de unión a sitios de daño de 53BP1 fusionado a GFP para daños por roturas de doble cadena, o la ADN glicosilasa NTH1 fusionada a GFP para daños en bases. En otro tubo de 1,5 mililitros, diluya un microlitro de reactivo de transfección de ADN basado en liposomas en 25 microlitros de medio de cultivo sin suero, luego mezcle el contenido de los dos tubos, el ADN diluido y el reactivo de transfección, e incube el tubo a temperatura ambiente durante 10 minutos para formar complejos de ADN-lípido.Lave las células una vez con 0,5 mililitros de medio de cultivo, luego elimine el medio y agregue 0,5 mililitros de medio de cultivo fresco a las células. Añada los complejos de ADN-lípidos a las células y mezcle suavemente moviendo la placa de un lado a otro varias veces. A continuación, devuelva las células al incubador.Después de cuatro a seis horas, retire el medio de cultivo de las células y agregue 300 microlitros de tripsina-EDTA al 0,5%. Retire la solución, luego agregue 200 microlitros de tripsina-EDTA e incube las células a 37 grados Celsius durante tres a cuatro minutos. Después de confirmar que las células se han desprendido, agregue 800 microlitros de medio de cultivo y resuspenda las células pipeteando suavemente para deshacer los agregados celulares.Transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo de 35 milímetros con una cubreobjetos cuadriculada y agregue medio de cultivo hasta un volumen final de dos mililitros. Después de 48 horas, las células tendrán una confluencia del 30 al 60 % con expresión de la proteína fluorescente, y estarán listas para la inducción de daño con láser. Encienda el láser de infrarrojo cercano (NIR) y permita que el sistema de láser se caliente durante una hora antes de usarlo.Coloque un cultivo de células en una platina calentada a 37 grados Celsius dentro de una cámara que permita el control de dióxido de carbono y humedad. Para el análisis en tiempo real de proteínas marcadas con fluorescencia, utilice un objetivo de inmersión en aceite con alto aumento y una combinación adecuada de filtros de fluorescencia según la etiqueta utilizada. Busque células que presenten una expresión comparable de la proteína fluorescente.Evite células que tengan una expresión demasiado débil o demasiado fuerte con el fin de reducir la variabilidad entre células en las mediciones de fluorescencia. Para microscopía confocal, utilice un objetivo de aceite de 100x con apertura numérica de 1.3 y la función de blanqueo del software para enfocar pistas lineales dentro del núcleo celular. Ajuste el porcentaje de transmisión del láser al 5% sin cambiar ninguna otra configuración.Luego, coloque una célula en el centro del campo. Haga clic en la región de interés y, utilizando el ratón, dibuje una línea o un cuadro en el núcleo de aproximadamente 50 por cuatro píxeles. Evite tocar la membrana nuclear o los nucléolos.Luego, haga clic en el botón de blanqueo para inducir daño en el ADN. Aquí, la diferencia entre el reclutamiento máximo de GFP-53BP1 y GFP-NTH1 es evidente. Para realizar análisis cuantitativo de fluorescencia en células vivas con el microscopio confocal, utilice una magnificación de 1x y un láser de argón para GFP FITC.Establezca una resolución de 512 x 512 píxeles, una velocidad de escaneo de cinco y el número uno para escaneo rápido o dos más para promediar múltiples escaneos y mejorar la relación señal-ruido. Luego capture las imágenes. Dibuje la ROY de blanqueo para inducir el daño, luego seleccione el submenú Serie Temporal adquirida, establezca el número en 20 y el retraso de ciclo en 30 segundos.Seleccione blanqueador una vez tras el primer escaneo y luego haga clic en iniciar B. En este caso, la primera imagen se adquiere inmediatamente antes de la inducción del daño, seguida por la adquisición de 19 imágenes adicionales a intervalos de 30 segundos. Aquí, puede observarse que GFP-NTH1 es reclutado rápidamente y de forma transitoria a los sitios de daño, mientras que GFP-53BP1 se acumula lentamente y permanece en los sitios de daño. Algunos factores de reparación pueden ser reclutados a los sitios de daño de manera específica al ciclo celular.Para identificar células en fase G1 para la inducción de daño, bajo un microscopio invertido, utilizando un objetivo de 10x y lentes oculares de 10x, identifique células en metafase que estén ligeramente levantadas y con forma redondeada. Adquiera imágenes para registrar la posición de las células en metafase sobre el portaobjetos con cuadrícula. Después de tres a cuatro horas, confirme que la división celular ha dado lugar a dos células hijas listas para la inducción de daño en la posición registrada.Para preparar células en fase SG2, utilice un protocolo de doble bloqueo con timidina. Confirme la eficiencia de sincronización mediante perfilado de ADN y/o detección de Rad51 en sitios de daño. En el daño láser con potencia de entrada alta, se observó con mayor claridad la agrupación del daño por CPD inducido por UV y de la glucosilasa del ADN GFP-NTH1 que reconoce específicamente el daño en las bases, en comparación con la potencia de entrada baja.Además, se observaron niveles más altos de XRCC1 y CtIP, lo que refleja el aumento en el número de roturas de cadena sencilla y doble, indicando así que se indujo daño complejo en el ADN. Como se demuestra aquí, la variación de la potencia de entrada del láser provoca cambios en la señalización del daño. PARP1 media la poli ADP-ribosilación o PAR de proteínas diana en los sitios de daño, la cual es significativamente inducida por alta potencia de entrada del láser, pero solo débilmente por baja potencia del láser.53BP1 es reclutado a sitios de daño con baja potencia de entrada, pero no a aquellos con alta potencia de entrada. Curiosamente, el reclutamiento a daño de baja potencia de entrada fue suprimido por la presencia de un segundo daño de alta potencia de entrada en el mismo núcleo celular. La inhibición se redujo mediante el inhibidor de PARP.Por el contrario, el inhibidor de PARP que degrada PAR potenció la señal de PAR y suprimió eficazmente la reclutación de 53BP1 incluso en los sitios de daño con baja potencia de entrada. Esto indica que la señalización de PARP, y no la naturaleza del daño en sí, determina la reclutación de 53BP1. Este es un ejemplo en el que la titulación con láser reveló una activación diferencial de PARP1 que mide la cantidad y complejidad del daño en el ADN, y que controla la accesibilidad del sitio de daño.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente cinco días, incluyendo la preparación de células, configuración del sistema láser, inducción de daño en el ADN, obtención de imágenes de células vivas o inmunosilentes y el análisis de datos. Puede llevar más tiempo si se requiere sincronización celular o análisis del costo temporal. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la titulación de la potencia de entrada del láser puede variar con el tiempo, incluso en el mismo sistema láser, especialmente después de un reajuste del sistema; por lo tanto, es fundamental verificar periódicamente el patrón de reclutamiento de los factores de reparación.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar y comparar resultados obtenidos mediante otros métodos que dañan el ADN, como el análisis de la irradiación, agentes químicos o la expresión de endonucleasas, con el fin de confirmar que los resultados no se deben a artefactos específicos del láser. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la reparación del ADN exploraran la respuesta al daño del ADN en relación con la cromatina nuclear, y para identificar nuevos factores y vías implicados en el daño, reconocimiento, procesamiento y señalización del ADN.

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Investigación

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Genética

Los láseres se utilizan con frecuencia en los estudios de la respuesta celular al daño del ADN. Sin embargo, que generan lesiones cuya distancia, la frecuencia y las colisiones con las horquillas de replicación están raramente caracterizado. Aquí se describe un método que permite la determinación de estos parámetros con láser localizado entrecruzamientos entre cadenas.

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