Name: Microirradiation láser para estudiar In Vivo las respuestas celulares al daño en el ADN Simple y complejo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a usar la microirradiación láser para inducir daños simples y complejos en el ADN y estudiar la señalización celular y el ensamblaje de factores de reparación in vivo.

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Agradecemos al Dr. Akira Yasui en la Universidad de Tohoku, Japón para el plásmido de expresión de GFP-NTH1 y Dr. Eros Lazzerini Denchi en el Scripps Research Institute, La Jolla, California de TRF2 YFP y plásmidos de expresión de EGFP 53BP11220-1711 . Este trabajo fue financiado por la oficina de investigación científica de la fuerza aérea (FA9550-04-1-0101) y la Fundación Beckman Laser Institute Inc. (a M.W.B), la beca de la Fundación Ford de la Academia Nacional de Ciencias (B.A.S) y MCB NSF-1615701 y CRCC CRR-17-426665 (a. K. Y.).

Los autores no tienen nada que revelar.

Las ventajas de la utilización de láser microirradiation para la investigación DDR son:
1. es factible inducir diferentes tipos y cantidades de ADN dañan por roturas de cadena simple a complejo daño en el ADN, y para detectar factores de reparación diferentes a la DNA dañan sitios mediante el ajuste de los parámetros de la irradiación láser. También es posible infligir daño varias veces en el mismo núcleo de la célula con el fin de evaluar los efectos de transporte (como en la <strong...

En Vivo Señalización de daño de ADN no es haber entendido bien In vivo, el ADN es acomplejado con histonas y otros factores para formar fibras de cromatina. Regulación de la estructura de la cromatina es de suma importancia para el metabolismo del ADN. Por ejemplo, la variante de la histona H2AX es fosforilada por la ataxia-telangiectasia mutado (ATM) y otras cinasas siguiente doble cadena rompe inducción (DSB) y es importante para la amplificación de la señal de OSD daños así como proporcionar un sitio para otro factores. Difusión de elección de vía de señalización y reparación de daños parecen ser críticamente influenciado por la estructura de la cromatina locales en sitios de daño1. Un número de remodelación factores, histona chaperonas y enzimas modificadoras de histonas de la cromatina son reclutados en efecto dañar sitios y son importante para la reparación del ADN eficiente, destacando la importancia de la regulación de la cromatina en la DDR y reparar2 , 3 , 4. Además, se observó sitio daño clustering o reposicionamiento en levadura y drosophila5,6,7,8, de relocalización de loci de genes en el compartimiento subnuclear asociado con genes regulación9,10. Recientes estudios en ratón y células humanas también revelaron movilización sitios web DSB, que influencias reparación fidelidad y vía elección11,12. Esto plantea la posibilidad que DDR y reparación puede también ser íntimamente arquitectura nuclear, organización de orden superior cromatina y cromosoma dinámica en el núcleo celular. Por lo tanto, es fundamental para desarrollar métodos de alta resolución para estudiar DDR y reparar procesos en el contexto del ambiente endógeno nuclear en una célula viva para entender las consecuencias a corto y largo plazo de daño en el ADN.
Papel crítico de PAR polimerasa (PARP) en medir el grado y tipo de daño y regula el ensamblaje de la proteína en el sitio de daño PARP1 es un sensor de DNA nick rápidamente activado por daño en el ADN que desempeña un papel crítico en la reparación de ADN13. PARP1 originalmente fue pensado para funcionar junto con rayos x reparar Cruz complementando 1 (XRCC1) para facilitar la reparación de la supresión de base (BER), pero estudios recientes revelan su papel en otras vías de reparación del ADN, incluyendo reparación DSB14. Activa PARP1 utiliza nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) como sustrato a ADP-ribosylate varias proteínas objetivo, incluyendo sí mismo. Esta enzima y otros miembros de la familia han atraído mucha atención en los últimos años como inhibidores de la PARP han surgido como prometedores medicamentos para el cáncer. Aunque los inhibidores de la PARP inicialmente fueron encontrados para ser eficaz en el gen del cáncer de mama (BRCA)-transformado células de cáncer de mama, ahora hay una gran cantidad de evidencia de sus efectos en mono - y combinación de terapias junto con ADN dañando agentes, radiación contra un amplio espectro de cánceres con mutaciones que no se limita a BRCA15,16,17,18,19,20.
A nivel molecular, activación de la PARP fue demostrada que desempeñan un papel crítico en la organización de la estructura de la cromatina locales en sitios de daño. Contratación dependiente del PAR de las enzimas de modificación de la cromatina facilita la reparación DSB y dictados reparacion opciones de camino, sugiriendo el papel importante del andamiaje de modificación PAR en sitios de daño. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 recientemente demostramos la exclusión de la proteína p53-1 (53BP1) dañen sitios por PAR 32, proporcionando una explicación alternativa para el hyperactivation 53BP1 dependiente de endjoining no homóloga ( NHEJ) por PARP inhibidor y destacando la importancia de PARP en OSD reparación vía elección33,34. PARP1 también directamente PARylates y afecta a la reparación de la actividad de la DNA múltiples factores14.
Usando Microirradiation de láser como una herramienta para estudiar DDR y reparación en Vivo Microirradiation láser para producir sub-micron alteraciones en cromosomas individuales primero fue descrito en 196935 y revisado en detalle en 198136. Varias décadas más tarde, microirradiation laser fue demostrado para inducir daño de la DNA en una región definida Submicrométrica en el núcleo celular y fue demostrado para ser una técnica valiosa para el estudio de reclutamiento o modificaciones de los diversos factores de lesiones del ADN in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. este método permite la detección de aquellos factores que no forman distintos focos inducido por irradiación (IRIF) en sitios de daño39,42. También es posible examinar la dinámica espacio-temporal de los cambios estructurales de la cromatina en los sitios de daño y en el resto del núcleo. Cuidadosamente comparamos el DDR inducida por láser diferentes sistemas y poder evaluar la relación entre el tipo de daño en el ADN y el microirradiation condiciones32,43,44, 45. Los patrones de reclutamiento aberrante de 53BP1 y telomeric repetición factor de Unión 2 (TRF2) fueron observados en los estudios previos de daños del láser, que sirvió de base para la preocupación recurrente por la naturaleza "non-physiological" del daño inducido por el láser46 ,47,48,49. Encontramos que estas aparentes discrepancias podrían explicarse ahora por PARP diferencial señalización que indicadores de la cantidad y la complejidad del daño inducido32. Confirmamos que: 1) laser-microirradiated las células (incluso después de la irradiación de energía de entrada alta) son arrestadas en interfase en una forma de control dependiente del checkpoint de daños y permanecer viables (al menos hasta 48 h)32,50; y 2) contratación de factor de reparación o modificaciones fielmente lo observado con el tratamiento con agentes perjudiciales convencionales de ADN y la inducción de OSD por endonucleasas32,39,42, recapitular 44,50,51,52. Estos resultados apoyan fuertemente la relevancia fisiológica de estudiar respuestas celulares inducidas por daños de láser.

<table><tbody><tr><td>Ti:Zafiro NIR láser de femtosegundo pulsado Mira-900</td><td>Coherent Inc.</td>Microscopio invertido <td>Mira 900</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>63X/1.4 NA objetivo</td><td>Zeiss</td><td>APOCHROMAT Ph3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Platina de rotación compacta&nbsp;</td><td>Newport Corp</td><td>PR50PP</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Warner</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de calefacción</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>10918</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de incubación de gas</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>11920</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de potencia y energía láser (RoHS)</td><td>Campo</td><td>coherenteMaxII-TOP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-R2 Cámara CCD digital</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 META Microscopios de escaneo láser</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X/1.3 NA Zeiss Plan APO</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm Platos cuadriculados&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD-D</td><td></td></tr><tr><td>PtK2 células epiteliales renales</td><td>ATCC</td><td>CCL 56&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Medio independiente del CO2&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>MEM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>suplementado con L-Glutamina, 4% FBS</td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Fisher Scientific 25030081</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Timidina&nbsp;</td><td>&nbsp; SIGMA</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>medios sin suero&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Opti-MEM I Medios de Suero Reducidos)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Dímero de pirimidina anti-cicolbutancia (CPD) (ratón)</td><td>Kamiya Biomedical Company</td><td>MC-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-XRCC1 (ratón)</td><td>Gene Tex Inc</td><td>GTX72311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-53BP1 (conejo)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-22760</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CtIP (conejo)</td><td>Abcam</td><td>ab70163</td><td></td></tr><tr><td>Polímeros anti-PAR (ratón)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-SA216-0100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR (conejo)</td><td>Trevigen</td><td>4336-BPC-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRF2 (ratón)</td><td>Novus Biological&nbsp;</td><td>NB100-56506</td><td></td></tr><tr><td>Anti 6-4PP (ratón)</td><td>Kamiya Biomedical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad21 (conejo)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (para la detección de cohesinas)</td>generado en el laboratorio <td></td><td></td>de <td>Yokomori (KY)</td></tr><tr><td>Anti-Rad51 (Conejo)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8349</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ku70 (ratón)</td><td>&nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100-102</td><td></td></tr><tr><td>8-oxiguanina&nbsp;</td><td>Trevigen, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-PARP1&nbsp; (Conejo)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>generado en KY lab</td><td></td><td>ref 43</td></tr><tr><td>&nbsp; Anti-hCAPG (Conejo)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (para la detección de condensina)</td><td>generado en KY lab</td><td></td><td>ref 42</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>&nbsp; Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Burro Anti-Ratón Alexa Fluor 488 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>HiPerFect siRNA Reactivo de transfección</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reactivo de transfección</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>GFP-SMC1 línea celular estable&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>generado en el laboratorio</td><td></td> KY <td>ref 49 &nbsp;</td></tr><tr><td>Línea celular estable GFP-NEIL2</td><td>generada en KY lab</td><td></td><td>ref 54</td></tr><tr><td>Línea celular estable GFP-NTH1</td><td>generada en KY lab</td><td></td><td>ref 32</td></tr><tr><td>Plásmido GFP-SMC1</td><td>generado en KY lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plásmido GFP-Ku</td><td>generado en KY lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-MDC1 (conejo)</td><td>&nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100 &ndash; 395</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gH2AX (conejo)</td><td>&nbsp; Millipore</td><td>07&ndash; 164</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-53BP1(1220-1711) Línea celular estable PtK2</td><td>generada en el laboratorio</td><td></td> de Berns <td>ref 32</td></tr><tr><td>TRF2-YFP Línea celular estable PtK2</td><td>generada en el laboratorio</td><td></td> de Berns <td>ref 32</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de PARG</td><td>Trevigen</td><td>4680-096-03</td><td></td></tr><tr><td>ADN&ndash; Inhibidor de PKcs&nbsp; NU7026&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N1537</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ATM KU55933</td><td>&nbsp; Calbiochem</td><td>118500</td><td></td></tr><tr><td>Olaparib&nbsp;</td><td>Tecnología Apexbio</td><td>A4154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído&nbsp;</td><td>MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA CIENCIA MS</td><td>100503-916 (EA)</td><td></td></tr><tr><td>Cantidad Un software de análisis 1-D versión 4.6.9</td><td>Bio-Rad</td><td>SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC&nbsp;</td><td>Programa de análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Excel</td><td>programa de hoja de cálculo</td><td>de Microsoft</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>detergente</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) 10X sin calcio y magnesio</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200166</td><td>diluido a 1X&nbsp;</td></tr></tbody></table>

microirradiation láser para estudiar in vivo las respuestas celulares al daño en el adn simple y complejo

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Daño de la DNA induce respuestas concretas de reparación y señalización de la célula, que es fundamental para la protección de la integridad del genoma. Microirradiation laser se convirtió en una valiosa herramienta experimental para investigar el ADN daños respuesta (DDR) en vivo. Permite análisis unicelular alta resolución en tiempo real de la dinámica macromolecular en respuesta a daño inducido por el láser confinado a una región Submicrométrica en el núcleo celular. Sin embargo, varias condiciones de láser han sido utilizadas sin apreciación de las diferencias en los tipos de daño inducido. Como resultado, la naturaleza de los daños es a menudo no bien caracterizado o controlado, provocando inconsistencias evidentes en los perfiles de contratación o modificación. Hemos demostrado que las condiciones de irradiación diferentes (es decir, diferentes longitudes de onda así como diferentes potencias de entrada (cultivos) de un láser de femtosegundo (fs) y de infrarrojo cercano (NIR)) inducida por distintos conjuntos de proteínas DDR y reparación. Esto refleja el tipo de daño en el ADN producido. Este protocolo describe cómo titulación laser de potencia de entrada permite la inducción de diferentes cantidades y la complejidad del daño de la DNA, que pueden controlarse fácilmente por la detección de daño base y reticulación, diferencial poli (ADP-ribosa) (PAR) de señalización, y Asambleas de factor de reparación específica de la vía en sitios de daño. Una vez determinadas las condiciones de daño, es posible investigar los efectos de daños diferente complejidad y daño diferencial de señalización, así como agotamiento de factor aguas arriba de cualquier factor de interés.

Usando células PtK2 estable expresaban EGFP 53BP11220-1711 o TRF2 YFP, láser alimentación valoración se llevó a cabo para determinar las condiciones óptimas para su contratación (figura 1)32.
En los sitios de daño del láser de alta potencia de input, el agrupamiento significativo de CPD (daño reticulando típicamente generado por daño ultravioleta (UV)) así como GFP-NTH1 ADN glicosilasa que específicamente reconoce el daño de base...

El objetivo de este protocolo es describir cómo utilizar microirradiation de láser para inducir a diferentes tipos de daños en el ADN, como roturas de cadena relativamente simple y complejo daño, para el estudio de ADN daños reparación y señalización de factor Asamblea en sitios de daño en vivo .

Microirradiation láser para estudiar In Vivo las respuestas celulares al daño en el ADN Simple y complejo

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

El objetivo general de este protocolo es describir cómo utilizar la microirradiación con láser para inducir diferentes tipos de daño en el ADN, incluyendo roturas simples de cadena y daño complejo, con el fin de estudiar la señalización del daño en el ADN y el ensamblaje de factores de reparación in vivo. En las décadas de 1960 y 1970, enfocamos un haz de láser a través de un microscopio, que pueden ver detrás de mí, y logramos dañar una pequeña región de un cromosoma. La célula se dividió, sobrevivió, y no pudimos comprender por qué.Bueno, 40 años después, ahora estamos utilizando este método para estudiar selectivamente la reparación del ADN, y eso es lo que verán hoy. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reparación del ADN, como cómo se reconoce y procesa el daño en el ADN y cómo se propaga la señal de daño en la célula. La microirradiación con láser permite el análisis en tiempo real, con alta resolución y a nivel de célula individual, de la dinámica de macromoléculas en respuesta al daño en el ADN confinado a una región de varias micras dentro del núcleo celular.Sin embargo, se han utilizado diversas condiciones de láser sin tener en cuenta la

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Genética

Los láseres se utilizan con frecuencia en los estudios de la respuesta celular al daño del ADN. Sin embargo, que generan lesiones cuya distancia, la frecuencia y las colisiones con las horquillas de replicación están raramente caracterizado. Aquí se describe un método que permite la determinación de estos parámetros con láser localizado entrecruzamientos entre cadenas.

El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos

Microirradiation láser es una herramienta útil para estudios de reparación del ADN en las células vivas. Se muestra un enfoque metodológico para el uso de láseres de rayos UVA para inducir varias lesiones del ADN. Hemos optimizado un método para microirradiation local que mantiene el ciclo normal de la célula; así, las células irradiadas proceden a través de mitosis.

Avanzadas técnicas de Microscopía Confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del ADN

Confocal de la fluorescencia microscopía láser micro-irradiación oferta herramientas y para inducir daño en el ADN y control de la respuesta de proteínas de reparación del ADN en áreas seleccionadas de las nucleares. Esta técnica ha avanzado significativamente nuestro conocimiento de detección de daño, las señales y reclutamiento. Este manuscrito muestra estas tecnologías para examinar reparación de rotura de filamento solo y doble.

Aplicación de Micro-la irradiación del Laser para la examinación de Single y doble filamento romper reparación en células de mamíferos

Estudiar la cinética de reparación de daños de ADN requiere un sistema para inducir lesiones en regiones definidas del nucleares. Se describe un método para crear localizados roturas de doble cadena utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un 405 nm láser y procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación de estas lesiones.

Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

Este protocolo describe un método no invasivo para identificar eficientemente las células de fase S para estudios de microscopía aguas abajo, como la medición del reclutamiento de proteínas de reparación del ADN mediante microirradiación láser.

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Se describe una sólida estrategia de sustitución de genes para manipular genéticamente el hongo Ustilago maydis carbón. Este protocolo explica cómo generar mutantes de deleción para investigar fenotipos de infección. Se puede extender para modificar genes de cualquier manera deseada, por ejemplo, mediante la adición de una secuencia que codifica un marcador de proteína fluorescente.

La manipulación genética del patógeno de la planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudiar biología de hongos y plantas Microbe Interactions

El daño dirigido al ADN se puede lograr atando un agente dañino para el ADN a un oligonucleótido formador de triplex (TFO). Mediante el uso de TFO modificados, la asociación de proteínas específicas del daño del ADN y la modificación de la topología del ADN se pueden estudiar en células humanas mediante la utilización de ensayos de inmunoprecipitación de cromatina modificada y ensayos de superenrollamiento del ADN descritos en este documento.

Herramientas para estudiar el papel de la proteína HMGB1 arquitectónico en el procesamiento de la hélice causante de distorsión, de ADN específica de sitio enlaces cruzados

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