La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

El objetivo general de las imágenes de lapso de tiempo multifotónico es capturar imágenes tridimensionales en tiempo real de alta resolución de poblaciones de células migratorias. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología del desarrollo, como el mapeo de las vías de migración de diferentes poblaciones celulares. La principal ventaja de esta técnica sobre la microscopía confocal tradicional es que los láseres multifotónicos tienen una penetración más profunda en los tejidos y una menor fototoxicidad.

Esto aumenta la usabilidad en tejidos más gruesos y permite períodos más largos de adquisición de imágenes. Para preparar la recolección de embriones entre las 3:00 y las 9:00 p.m., ensamble tanques de cría y llénelos con agua de ósmosis inversa o ósmosis inversa.

Transfiere hasta tres hembras y tres machos a lados opuestos del tanque dividido. A la mañana siguiente, retire el divisor poco después de que se enciendan las luces del vivero. Permita el apareamiento sin interrupciones durante 20 minutos o hasta que se produzca un número suficiente de embriones.

Los embriones estarán en el fondo del tanque de cría. Cuando se observen los huevos, levante el tanque interior ranurado junto con los peces y colóquelos rápidamente en un tanque exterior limpio y sólido lleno de agua de ósmosis inversa. Use una pantalla de recolección de huevos para recolectar huevos del tanque exterior y transfiera los huevos a placas de Petri que contengan 30 mililitros de medio embrionario 1X.

Incubar los huevos recolectados a 28,5 grados centígrados. En el caso de los embriones transgénicos, a las 24 horas después de la fecundación o HPF, se extraen los óvulos muertos y se evalúa el estado de desarrollo de los embriones. Con fórceps, extraiga los coriones de tres o cuatro embriones que expresan GFP.

Bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia de disección con un filtro de excitación de paso de banda estándar de 460 a 490 nanómetros, se evalúan los embriones positivos para GFP. Transfiera estos embriones a una placa de Petri separada que contenga 30 mililitros de medio para embriones frescos 1X. Después de 20 HPF, coloque los embriones positivos de GFP cribados y decorionados en una solución de PTU al 0,003% para inhibir la pigmentación.

Evite iniciar el tratamiento antes, ya que puede tener efectos adversos sobre la cresta neural y el desarrollo neuroepitelial. Agregue 0,4 gramos de polvo de agarosa LowMelt a 20 ml de medio para embriones 1x. Caliente la mezcla durante uno o dos minutos o hasta que la solución esté clara y todas las partículas se disuelvan.

Aliquot aproximadamente 1 ml de la solución de agarosa en tubos de centrífuga nuevos de 1,5 ml para su almacenamiento. Para configurar la cámara de baño abierta, coloque una pequeña cantidad de grasa de alto vacío en la base de la cámara de baño abierta. Coloque una cubierta de vidrio circular en la base y atornille la parte superior de la cámara de baño abierta en la base hasta que quede apretada.

Pipetear aproximadamente 500-700 microlitros de solución de agarosa al 2% en la cámara de baño abierta hasta que la base esté llena aproximadamente 3/4 s. Espere 30 segundos para permitir que la agarosa se enfríe un poco sin polimerizar por completo y, posteriormente, transfiera un solo embrión al centro de la base. Bajo un microscopio estereoscópico fluorescente, use una punta de micropipeta de 10 microlitros para orientar el embrión y colóquelo cerca de la parte inferior de la agarosa para que no flote cuando se agregue el medio embrionario.

Un paso crítico es asegurarse de que el embrión esté colocado correctamente en la agarosa. En estos experimentos, orientamos el embrión lateralmente, pero el embrión también se puede posicionar para enfocarse en las áreas dorsal y ventral. Monitoree y reposicione el embrión hasta que la agarosa se haya endurecido.

A continuación, utilice una pipeta de transferencia para llenar completamente la cámara abierta ensamblada con medio embrionario de lapso de tiempo. Después de colocar todo el conjunto en la platina del microscopio, de acuerdo con el protocolo de texto, use el objetivo de cinco veces para ubicar el embrión. A continuación, eleve manualmente la platina a la posición más alta y utilice el enfoque fino para colocar el embrión en el centro del rango del microscopio.

Baje manualmente el escenario y cambie el objetivo de cinco tiempos al objetivo de inmersión en agua de 25 tiempos. Levante con cuidado la etapa para volver a enfocar el embrión. En el software, haga clic en el modo XYTZ para obtener múltiples imágenes en intervalos de tiempo o T en el plano XY a una profundidad de Z. Utilice la epifluorescencia o la vista de campo claro para encontrar la profundidad de enfoque en el área de interés que demarcará la pila z.

Para estos experimentos, el borde lateral del ojo es el comienzo de la pila z. Cuando se enfoca aquí, en el software, haga clic en el botón Comenzar. Después de enfocar hasta la línea media del embrión, que es el final de la pila z, haga clic en el botón finalizar.

Un paso crítico es asegurarse de que el paso Z abarque el área de interés. En nuestro caso, queremos capturar la anchura del ojo desde los bordes lateral hasta los mediales. Haga clic en el menú para ajustar el tiempo de adquisición y la frecuencia de imagen.

Para una recuperación adecuada del fluor4 y la supervivencia del embrión, permita una proporción de al menos uno a tres entre la adquisición de la pila z cuando la potencia del láser está activada y el tiempo de recuperación cuando la potencia del láser está apagada. Con el tiempo adecuado para la recuperación del embrión, establezca el tiempo entre las pilas z en la ventana designada. A continuación, establezca el tiempo total del experimento en la ventana adecuada.

Ahora, active la configuración de imagen en vivo para realizar los ajustes finales en la configuración del láser. Ajuste la transmisión láser, la ganancia y las barras deslizantes de compensación dentro del software para optimizar la imagen de fluorescencia. Además, ajuste la orientación del embrión según sea necesario en función de la duración del experimento, el crecimiento previsto del embrión, etc.

Asegúrese de que el área de interés permanezca dentro del encuadre durante todo el experimento. Durante la adquisición de lapso de tiempo, apague la fuente de luz de epifluorescencia, cubra el escenario con la caja de seguridad láser que es adecuada para la protección contra la luz de fondo, luego presione inicio. Acceda a la cámara de baño abierta a través de las puertas correderas de la caja de seguridad láser para rellenarla con medio embrionario de lapso de tiempo cada 8-12 horas.

Después de la adquisición de imágenes, abra los archivos en el software de procesamiento de imágenes, resalte la serie de imágenes correcta. En el software, elija el menú de procesos, haga clic en Deconvolución 3D y aplique para desconvolucionar cada pila z. Importa archivos tif individuales en el software de procesamiento de video, luego selecciona todos los archivos tif y arrástralos al editor de video.

Ajusta la duración de cada imagen dentro del video a 0,1 segundos. Finalmente, exporta el video como un archivo mov o mp4. Aquí, mediante imágenes de fluorescencia multifotónica, se observan los patrones de migración de las células de la cresta neural craneal que dan lugar a las estructuras faciales craneales y al segmento anterior del ojo en líneas transgénicas de pez cebra sox10:EGFP y foxd3:GFP.

Las células de la cresta neural Sox 10 positivas entre 12 y 30 hpf migran desde el borde del tubo neural a la región craneal facial. Las células del prosencéfalo y el mesencéfalo migran dorsal y ventralmente al ojo en desarrollo para poblar el mesencinto periocular. Como se indica aquí, las células sox10 positivas forman el proceso nasal frontal.

Las células de la cresta neural del rombencéfalo migran ventralmente y dan lugar a los arcos faríngeos. Las imágenes de lapso de tiempo de las células de cresta neural positivas de foxd3 entre 30 y 60 hpf muestran que estas células migraron entre la copa óptica y el ectodermo de la superficie y a través de la fisura ocular marcada por la flecha y se fusionaron alrededor del cristalino marcado por el asterisco formando el estroma del iris. Una vez dominada, esta técnica de principio a fin se puede realizar en cuatro días si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar elegir embriones con una alta cantidad de fluorescencia. La configuración inicial del software puede ser un desafío, pero una vez que se determinan los parámetros, los cambios adicionales suelen ser mínimos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la microscopía de lapso de tiempo multifotónica para obtener imágenes de las células migratorias en el embrión.