Name: La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprende a visualizar la migración de células de cresta neural en embriones de pez cebra mediante microscopía de láser de barrido multiphotón. Esta técnica permite obtener imágenes tridimensionales en tiempo real con alta resolución y menor fototoxicidad.

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Los autores agradecen a Thomas Schilling para amablemente regalar el pescado Tg (sox10:eGFP) y Mary Halloran para amablemente regalar pescado Tg(foxd3:GFP) .

El protocolo descrito aquí se realizó de acuerdo con las directrices para el tratamiento humanitario de animales de laboratorio establecidas por el Comité sobre el Uso y Cuidado de los Animales de la Universidad de Michigan (UCUCA).
1. Recolección de embriones para imágenes de lapso de tiempo
<ol>
	<li>Entre las 3 y las 9 pm, instale peces cebra transgénicos adultos machos y hembras Tg (sox10: EGFP) o Tg (foxd3: GFP) en un tanque de reproducción dividido para el apareamiento por parejas><.
	NOTA: Los peces Tg(sox10:EGFP) y Tg(foxd3:GFP), amables regalos de Thomas Schilling y Mary Halloran, respectivamente, se cruzaron con el fondo Casper (roy -/-, nácar -/-) para disminuir la autofluorescencia y la interferencia con la pigmentación.
	<ol>
		<li>Ensamble el tanque de cría (tanque interno ranurado + tanque exterior sólido) y llénelo con agua del sistema de ósmosis inversa (RO).</li>
		<li>Transfiera hasta 3 hembras y 3 machos a lados opuestos del tanque separados por un divisor; se pueden criar hasta 6 peces en parejas en un solo tanque de cría.</li>
		<li>A la mañana siguiente, retire el divisor poco después de que se enciendan las luces en el vivero. 
		NOTA: En el presente estudio, las luces están en un ciclo de luz de 14 horas (encendidas a las 9 am) y de 10 horas de oscuridad (apagadas a las 11 pm).</li>
		<li>Permita el apareamiento sin interrupciones durante 20 minutos o hasta que se produzca un número suficiente de embriones; los embriones estarán en el fondo del tanque de reproducción. Cuando se observen los huevos, levante el tanque interno ranurado junto con los peces y colóquelos rápidamente (peces y tanque interior) en un tanque exterior sólido y limpio lleno de agua de ósmosis inversa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prepare el medio embrionario estándar 1X añadiendo lo siguiente por 1 L de agua de ósmosis inversa: 0,287 g (4,9 mM) de NaCl, 0,127 g (0,17 mM) de KCl, 0,048 g (0,33 mM) de CaCl2,2H 2O, 0,04 g (0,33 mM) de MgSO4 (anhidro). Revuelva la solución hasta que las sales se disuelvan por completo.
	<ol>
		<li>Añadir 100 μL de azul de metileno al 0,1% como fungicida. Añadir 0,25 g de bicarbonato de sodio para ajustar el pH a 7,75. Almacene el medio a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Recoja los huevos del tanque exterior utilizando una pantalla de recolección de huevos y transfiera los huevos a placas de Petri (~ 50 embriones por placa) que contengan 30 mL de medio embrionario 1X. Incubar los huevos recolectados a 28,5 °C.</li>
	<li>Preparación embrionaria
	<ol>
		<li>Embriones Tg(sox10:EGFP).
		<ol>
			<li>En el caso de los embriones Tg(sox10:EGFP), a las 12 h después de la fecundación (hpf), se extraen los óvulos muertos y se evalúa la etapa de desarrollo de los embriones. Cribado de embriones GFP positivos utilizando un estereomicroscopio fluorescente de disección con un filtro de excitación de paso de banda estándar de 460-490 nm. Con fórceps, extraiga los coriones de 3-4 embriones que expresen GFP y transfiera estos embriones a una placa de Petri separada que contenga 30 ml de medio embrionario fresco 1X.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Embriones Tg(foxd3:GFP). 
		<ol>
			<li>En el caso de los embriones Tg(foxd3:GFP), a 22-24 hpf, retire los óvulos muertos y evalúe la etapa de desarrollo de los embriones. Cribado de embriones positivos utilizando un estereomicroscopio fluorescente de disección con un filtro de excitación de paso de banda estándar de 460-490 nm. Con fórceps, extraiga los coriones de 3-4 embriones que expresen GFP.</li>
			<li>Prepare la solución madre de feniltiourea (PTU) 1000X disolviendo 0,75 g (3%) de PTU en 25 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Alícuota y almacene la solución madre a 4 °C. Agregue 30 μL de solución madre 1000X PTU (3%) a 30 mL de medio embrionario 1X para generar una solución de PTU al 0,003%.</li>
			<li>Coloque los embriones GFP positivos cribados y decorionados en una solución de PTU al 0,003% para inhibir la pigmentación. No iniciar el tratamiento de los embriones con PTU antes de las 20 hpf, ya que el tratamiento precoz (a <20 hpf) puede tener efectos adversos sobre la cresta neural y el desarrollo neuroepitelial. 28</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Antes de llevar a cabo el experimento de lapso de tiempo, monitoree los embriones a través de imágenes en vivo utilizando un microscopio estereoscópico estándar a intervalos de 12 a 24 horas en comparaciones de edad como control de la variación de temperatura.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Montaje de embrión para imágenes de lapso de tiempo
<ol>
	<li>Preparación de medios embrionarios time-lapse
	<ol>
		<li>Prepare una solución madre de tricaína al 0,4% añadiendo 0,004 g de tricaína a 100 ml de agua de ósmosis inversa. Alicuente (~1 mL) la solución madre en tubos de centrífuga frescos de 1,5 mL y almacene a -20 °C.</li>
		<li>Prepare el medio embrionario de lapso de tiempo (50 mL de medio embrionario 1X, tricateína al 0,016%) agregando 2 mL de solución de tricaína al 0,4% a 48 mL de medio embrionario 1X. Si utiliza embriones >22 hpf, agregue también 50 μL de solución madre de PTU al 3% (concentración final.003% PTU) al medio embrionario.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación de agarosa de bajo punto de fusión al 2%
	<ol>
		<li>Añadir 0,4 g de polvo de agarosa de bajo punto de fusión a 20 mL de medio embrionario 1X. Calentar durante 1-2 minutos o hasta que la solución esté clara y todas las partículas se disuelvan. 
		NOTA: El aumento del porcentaje del gel de agarosa disminuye la porosidad de la matriz, lo que puede impedir físicamente el crecimiento y desarrollo del embrión. Por lo tanto, la solución de agarosa se puede reducir al 1,5% para minimizar estos efectos. Sin embargo, cuando el haz de excitación se mantiene estacionario durante la microscopía de barrido láser, puede producirse un mayor calentamiento, aumentando rápidamente en una relación logarítmica con el tiempo. En este protocolo, el calentamiento debido a la absorción de fluoróforos está altamente localizado en la región focal. Por lo tanto, en la región de interés, la temperatura podría aumentar a un valor lo suficientemente alto (≥ 30 ° C) para derretir soluciones de agarosa hechas en porcentajes inferiores a 1,5, exponiendo así directamente al embrión al láser o permitiendo condiciones en las que el embrión flota fuera del plano focal. Por esta razón, no se recomienda el uso de soluciones de agarosa inferiores al 1,5%.</li>
		<li>Aliquot (~1 mL) la solución de agarosa en tubos de centrífuga frescos de 1,5 mL para su almacenamiento. Almacene el exceso de solución de agarosa en forma líquida en un bloque de calor (60-70 °C) durante 2-3 semanas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaje del embrión
	<ol>
		<li>Para configurar la cámara de baño abierta, coloque una pequeña cantidad de grasa de alto vacío en la base de la cámara de baño abierta. Coloque una cubierta de vidrio circular en la base y atornille la parte superior de la cámara de baño abierta en la base hasta que quede apretada ( Figura 1A, B).</li>
		<li>Pipetear (~500-700 μL) de solución de agarosa al 2% (60-70 °C) en la cámara de baño abierta hasta que la base esté ~3/4 llena ( Figura 1C). Tenga en cuenta que una vez que la solución de agarosa está en la cámara de baño abierta en la mesa de laboratorio, la temperatura de la solución disminuye aproximadamente 1 °C/s.</li>
		<li>Espere 30 s para permitir que la agarosa se enfríe ligeramente (~30-40 °C), sin polimerizar completamente, y posteriormente transfiera un solo embrión al centro de la base ( Figura 1D, E).</li>
		<li>Bajo un microscopio estereoscópico fluorescente, coloque el embrión usando una punta de micropipeta de 1-10 μL, asegurándose de que el embrión esté colocado cerca de la parte inferior de la agarosa, ya que el embrión puede flotar cuando se cubre con medios embrionarios si se coloca demasiado cerca de la superficie de la agarosa. 
		NOTA: En los videos presentados (Videos 1-3), los embriones están orientados lateralmente, pero dependiendo del área de interés, los embriones pueden estar orientados ventral o dorsalmente.</li>
		<li>Monitoree y reposicione el embrión hasta que la agarosa se haya endurecido. Una vez que la agarosa se haya endurecido, use una pipeta de transferencia para llenar la cámara abierta ensamblada por completo con medios embrionarios de lapso de tiempo ( Figura 1F).</li>
		<li>Coloque la cámara de baño abierta en la plataforma de intercambio rápido, que encaja en el adaptador de etapa ( Figura 1G). Coloque toda la configuración (embrión, cámara de baño abierta, plataforma de intercambio rápido y adaptador de etapa) en la platina del microscopio inmediatamente encima del condensador ( Figura 1H).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Configuración del microscopio para imágenes de lapso de tiempo
<ol>
	<li>Determinación de la configuración del láser
	<ol>
		<li>Determinación de la longitud de onda del láser a utilizar. Utilice una longitud de onda que sea el doble de la longitud de onda de excitación del fluoróforo de interés (por ejemplo, longitud de onda entre 880 y 940 nm para GFP). 
		NOTA: En el presente estudio, el ajuste de la longitud de onda para GFP estaba entre 880 y 940 nm. Cuanto mayor sea la longitud de onda, menor será la potencia de salida del láser.</li>
		<li>Determine la transmisión del láser. Un alto porcentaje de transmisión láser matará al embrión, use el nivel más bajo de transmisión (recomendado). Para estudios de lapso de tiempo de 24 a 48 h, como se presenta en este documento, mantenga la transmisión por debajo del 5%.</li>
		<li>Determine los sistemas de detección del microscopio y asegúrese de que los filtros correctos para el fluoróforo estén en su lugar. 
		NOTA: Para los microscopios multifotónicos, existen múltiples sistemas de detección con varias sensibilidades para la fluorescencia emitida. En general, un sistema de detección interno tiene menos sensibilidad que un sistema de detección externo. Para líneas transgénicas con altos niveles de expresión de GFP, el sistema de detección interna es adecuado. En el caso de líneas transgénicas con bajos niveles de expresión de GFP o con otros fluoróforos (por ejemplo, proteína fluorescente roja), puede ser necesario un sistema de detección externo para mantener el porcentaje de transmisión del láser a un nivel razonable. Independientemente del sistema de detección utilizado, se deben colocar los filtros correctos para el fluoróforo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ajuste de la configuración del software en el microscopio multifotónico
	<ol>
		<li>Usando el objetivo 5X, localiza el embrión. Eleve manualmente la platina a la posición más alta y utilice el enfoque fino para colocar el embrión en el centro del rango del microscopio.</li>
		<li>Baje manualmente la etapa y cambie el objetivo 5X al objetivo de inmersión en agua 25X (apertura numérica NA, 0.95). Levante con cuidado la etapa para volver a enfocar el embrión.</li>
		<li>En el software, haga clic en el modo "xyzt" para obtener múltiples imágenes a intervalos de tiempo (t) en el plano x-y a una profundidad de "z". Utilice la epifluorescencia o la vista de campo claro para encontrar la profundidad de enfoque en el área de interés, lo que demarcará la pila Z.
		<ol>
			<li>En el software, haga clic en el botón "comenzar"; para estos experimentos, el borde lateral del ojo era el comienzo de la pila Z. Haga clic en el botón "finalizar"; la línea media del embrión era el final de la pila Z. 
			NOTA: El tamaño del paso fue de 0,3-0,6 μm y hubo un total de ~200 pasos para un tamaño de pila z de 60 a 120 μm).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Haga clic en el menú para ajustar el tiempo de adquisición y la frecuencia de la imagen. Para el sistema actual, ~ 200 pasos requieren aproximadamente 5 minutos para cada adquisición de z-stack. Para una recuperación adecuada del fluoróforo y la supervivencia del embrión, permita una relación de al menos 1:3 entre la adquisición de la pila z (encendido del láser) y el tiempo de recuperación (apagado del láser) 
		NOTA: Por ejemplo, las pilas z se adquieren cada 20 minutos con 5 minutos de adquisición de pilas z y 15 minutos de recuperación. Para este protocolo, se pueden obtener pilas z más grandes, pero aumentarían adecuadamente el tiempo entre las adquisiciones de pilas z, lo que resultaría en menos imágenes durante el curso de lapso de tiempo.
		<ol>
			<li>Con el tiempo adecuado para la recuperación del embrión, establezca el tiempo entre las pilas z en la ventana designada. Establezca la duración total del experimento en la ventana adecuada.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ajustes finales de software, láser y embriones.
		<ol>
			<li>Active la configuración de imagen en vivo para realizar los ajustes finales en la configuración del láser. Ajuste la transmisión láser (ver 3.1.2), las barras deslizantes de ganancia y compensación dentro del software para optimizar la imagen fluorescente. Además, ajuste la orientación del embrión, según sea necesario, en función de la duración del experimento, el crecimiento previsto del embrión, etc. Asegúrese de que el área de interés permanezca dentro del encuadre durante todo el experimento.</li>
			<li>Apague la fuente de luz epifluorescente, ya que ya no es necesaria durante la adquisición de lapso de tiempo. Cubra la platina con la caja de seguridad láser ( Figura 1I). Cuando se utiliza el sistema de detección interno, la caja de seguridad láser es adecuada para la protección contra la luz de fondo. Presione "inicio". 
			NOTA: Sin embargo, con sistemas de detección externos más sensibles, la caja de seguridad láser no bloquea suficiente luz de fondo y se requieren cubiertas adicionales para evitar la interrupción de la adquisición de imágenes.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Durante la adquisición de lapso de tiempo
<ol>
	<li>Rellene la cámara de baño abierta con medios embrionarios de lapso de tiempo cada 8-12 h (al menos 2 veces al día) durante la adquisición de lapso de tiempo a través de las puertas correderas de la caja de seguridad láser ( Figura 1I).</li>
	<li>Antes de abrir las puertas de la caja de seguridad láser, asegúrese de que el microscopio no esté adquiriendo una imagen activamente. 
	NOTA: El uso de calentadores y sistemas de medios circulantes no es necesario para experimentos de imágenes de lapso de tiempo que duran de 24 a 48 h. De hecho, las temperaturas de los calentadores de etapa y en línea son difíciles de controlar, y durante la adquisición de imágenes el embrión exhibe una tasa de desarrollo adecuada en un rango de temperatura de 25-28 °C. Además, los sistemas de medios circulantes tienden a desbordarse y dañar potencialmente el equipo. Por lo tanto, todos los embriones se estadifican de forma rutinaria después de la adquisición.</li>
</ol>
5. Procesamiento posterior a la adquisición
<ol>
	<li>En el software, haga clic en el menú "archivo" y elija "guardar".</li>
	<li>Abra el archivo en el software de procesamiento de imágenes (consulte la Tabla de materiales). Resalte la serie de imágenes correcta. En el software, elija el menú "Proceso". Haga clic en Deconvolución 3D y "Aplicar" para desconvolucionar cada pila z. 
	NOTA: El archivo es grande; Por lo tanto, este paso puede tardar muchas horas.</li>
	<li>En el software, en el menú "Proceso", haga clic en "proyección máxima". Haga clic en "Aplicar" para iniciar la proyección máxima y generar 1 imagen por pila z. Exporte cada archivo proyectado máximo (1 imagen por pila z) como un tiff.</li>
	<li>Importe archivos tiff individuales en el software de procesamiento de video. Selecciona todos los archivos tiff y arrástralos al editor de vídeo. Ajusta la duración de cada imagen dentro del video a 0.1s. Exporta video como archivo mov o mp4.</li>
</ol>

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</ol>

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la National Eye Institute de los National Institutes of Health (K08EY022912-01) y visión investigación núcleo (P30 EY007003).

La proyección de imagen multi-photon Time-lapse permite el seguimiento en vivo de poblaciones celulares transitorias y migratorias. Esta poderosa técnica se puede utilizar para el estudio de los procesos embrionarios en tiempo real, y en el presente estudio, los resultados de este método mejorado el conocimiento actual de la migración de células de cresta neural y el desarrollo. Anteriores estudios Time-lapse de imágenes típicamente utilizan la microscopía de láser confocal. 29 ,</su...

Enfermedades congénitas oculares pueden causar ceguera de la infancia y a menudo debido a las anormalidades de la cresta neural craneal. Las células de la cresta neural son células transitorias que surgen a partir del tubo neural y forman numerosos tejidos en todo el cuerpo. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 las células de la cresta Neural, derivadas del prosencéfalo y mesencéfalo, dan lugar a los huesos y el cartílago de la cara y regiones frontales, iris, córnea, red trabecular y esclera en el segmento anterior del ojo. 4 , 6 , 7 , 8 células de la cresta Neural desde el rhombencephalon forma que arcos de la faringe, mandíbula y tracto de salida cardíaco. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 estudios han puesto de relieve las aportaciones de la cresta neural para ocular y periocular desarrollo, haciendo hincapié en la importancia de estas células en el desarrollo del ojo vertebrado. De hecho, alteración de la diferenciación y migración de células de cresta neural conducen a anomalías craneofaciales y oculares como se observa en el síndrome de Axenfeld-Rieger y síndrome de Peters Plus. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 por lo tanto, una comprensión global de la migración, proliferación y diferenciación de estas células de la cresta neural se proporciona la penetración en la complejidad subyacente a enfermedades oculares congénitas.
El pez cebra es un organismo modelo de gran alcance para estudiar desarrollo ocular, como las estructuras del ojo de pez cebra son similares a sus contrapartes mamíferas, y muchos genes son conservados evolutivamente entre pez cebra y mamíferos. 18 , 19 , 20 además, embriones de pez cebra son transparentes y ovípara, facilitando la visualización del desarrollo del ojo en tiempo real.
Ampliando el trabajo previamente publicado,6,7,20 el patrón migratorio de las células de la cresta neural fue descrito usando múltiples fotones fluorescencia Time-lapse de imagen en líneas de pez cebra transgénico con proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control transcripcional de SRY (sex-determining región Y)-caja de 10 (sox10) o caja del Forkhead D3 regiones reguladoras del gen de (foxd3). 21 , 22 , 23 , 24. proyección de imagen de múltiples fotones fluorescencia Time-lapse es una técnica poderosa que combina las técnicas ópticas avanzadas de láser microscopía con larga excitación de fluorescencia de varios fotones de longitud de onda para capturar imágenes de alta resolución, tridimensionales de las muestras etiquetadas con fluoróforos. 25 , 26 , 27 el uso del multi-photon laser tiene distintas ventajas sobre el estándar microscopia confocal, incluyendo penetración creciente del tejido y disminución fluoróforo blanqueo.
Usando este método, dos poblaciones distintas de las células de la cresta neural varía en el momento de la migración y vías migratorias fueron las células de la cresta neural es decir positivo de foxd3, discriminados en el mesenchyme periocular y el ojo en desarrollo y sox10-positivo de la cresta neural células de mesénquima craneofacial. Con este método, se introduce un enfoque para visualizar la migración de migración de la cresta de los nervios oculares y craneofacial en el pez cebra, lo que es fácil observar la migración de la cresta neural regulado en tiempo real durante el desarrollo.
Este protocolo proporciona información para la generación de vídeos Time-lapse durante el desarrollo temprano del ojo en Tg (sox10:EGFP) y Tg (foxd3:GFP) de pez cebra transgénico, por ejemplo. Este protocolo se puede aplicar aún más para la visualización de alta resolución, tridimensional en tiempo real del desarrollo temprano de cualquier estructura ocular y craneofacial derivado de las células de la cresta neural en el pez cebra. Además, este método puede ser aplicado además para la visualización del desarrollo de otros tejidos y órganos en el pez cebra y otros modelos animales.

<table><tbody><tr><td>Tanques de cría con divisores</td> Juego de tanques de <td>acuanear</td><td>ZHCT100</td><td>cruce (1.0 litros) Policarbonato transparente con tapa e inserto</td></tr><tr><td>M205 FA Combi-Scope</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td>Microscopio de fluorescencia estereoscópica - FusionOptics y</td></tr><tr><td>cloruro de sodio</td><td>TripleBeam Millipore (EMD)</td><td>7760-5KG</td><td>Saco de PE doble. Nº CAS 7647-14-5, Nº CE 231-598-3</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Millipore (EMD)</td><td>1049380500</td><td>Cloruro de potasio 99.999 Suprapur. Nº CAS 7447-40-7, Nº CE 231-211-8.</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500 Botella de</td><td>polietileno; 500 g. CAS No. 10035-04-8</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio (anhidro)</td><td>Millipore (EMD)</td><td>MX0075-1</td><td>Botella de polietileno; 500 g. CAS No. 7487-88-9, Número EC 231-298-2</td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Millipore (EMD)</td><td>284-12</td><td>Frasco de vidrio; 25 g. Polvo, tinción biológica certificada</td></tr><tr>Millipore<td>de bicarbonato de sodio</td><td>(EMD)</td><td>SX0320-1</td><td>Frasco de polietileno; 500 g. Polvo, GR ACS. Nº CAS 144-55-8, número CE 205-633-8</td></tr><tr><td>N-feniltiourea</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>>98%. Número CAS 103-85-5, número CE 203-151-2</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma</td><td>D8418-500ML</td><td>grado de biología molecular. Número CAS 67-68-5, número EC 200-664-3</td></tr><tr><td>Tricaína Metanosulfonato</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS222</td><td>Tricaine-S</td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>ISC Bioexpress</td><td>E-3112-25</td><td>GeneMate Tamiz GQA Agarosa de bajo punto de fusión, 25 g</td></tr><tr><td>Cámara de baño abierta</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40HP</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio de alto</td> perfil <td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Cubreobjetos circulares. Grasa</td></tr> de alto vacío de 25 mm de diámetro <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5C</td><td>Tubo de 2.0 libras. DOW CORNING CORPORATION 1658832</td></tr><tr><td>Plataforma de intercambio rápido</td><td>Warner Instruments</td><td>QE-1 Adaptador de escenario de</td><td>35 mm</td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>SA-20LZ-AL</td><td>16,5 x 10 cm</td></tr><tr><td>Microscopio multifotónico TC SP5 MP</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser</td><td>SpectraPhysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser</td> <td>Safety BoxLeica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)&nbsp; Software</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS 6 Versión 13.0 x64 Software</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMovie Versión 10.1.4 Software</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la proyección de imagen de lapso tiempo multi-photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta neural en embriones de pez cebra

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Ojo congénita y anomalías craneofaciales reflejan alteraciones en los nervios de la cresta, una población transitoria de células migratorias que dan lugar a numerosos tipos de células en todo el cuerpo. Entender la biología de la cresta neural ha sido limitada, lo que refleja una falta de modelos genéticamente manejables que pueden ser estudiado en vivo y en tiempo real. Pez cebra es un modelo de desarrollo particularmente importante para el estudio de las poblaciones de células migratorias, como la cresta neural. Para examinar la migración de la cresta neural en el ojo en desarrollo, se implementó una combinación de las técnicas ópticas avanzadas de láser, microscopía de excitación de fluorescencia de varios fotones de onda larga para capturar videos de alta resolución, tridimensionales en tiempo real del ojo en desarrollo en embriones de pez cebra transgénico, es decir, Tg (sox10:EGFP) y Tg (foxd3:GFP), como sox10 y foxd3 han demostrado en numerosos modelos animales para regular la diferenciación temprana de la cresta neural y probablemente representan los marcadores para células de la cresta neural. La proyección de imagen multi-photon Time-lapse fue utilizada para discernir el comportamiento y los patrones migratorios de dos poblaciones de células de cresta neural que contribuye al desarrollo temprano del ojo. Este protocolo proporciona información para la generación de vídeos Time-lapse durante la migración de la cresta neural del pez cebra, como un ejemplo y puede aplicarse más para visualizar el desarrollo temprano de muchas estructuras en el pez cebra y otros organismos modelo.

Imágenes de Time-lapse de fluorescencia de varios fotones generan una serie de videos que revelaron los patrones de migración de las células de la cresta de los nervios craneales que dan lugar a las estructuras craneofaciales y segmento anterior del ojo en la Tg (sox10:EGFP) y Tg (foxd3:GFP) líneas de pez cebra. Por ejemplo, sox10 -células cresta neural positiva entre 12 y 30 hpf migran desde el borde del tubo neural en la región craneofacial (Video 1, <...

Se implementó una combinación de las técnicas de microscopía con largo excitación de fluorescencia de varios fotones de longitud de onda del láser ópticas avanzadas para capturar imágenes de alta resolución, tridimensionales en tiempo real de la migración de la cresta neural en Tg (sox10:EGFP) y los embriones de pez cebra de Tg (foxd3:GFP).

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

El objetivo general de la imagenología multifotónica con lapso de tiempo es capturar imágenes tridimensionales en tiempo real de alta resolución de poblaciones celulares migratorias. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología del desarrollo, como el mapeo de las vías de migración de diferentes poblaciones celulares. La principal ventaja de esta técnica frente a la microscopía confocal tradicional es que los láseres multifotónicos tienen una mayor penetración en los tejidos y una fototoxicidad reducida.Esto aumenta la utilidad en tejidos más gruesos y permite períodos más largos de adquisición de imágenes. Para preparar la recolección de embriones entre las 15:00 y las 21:00, arme los tanques de reproducción y llénelos con agua de ósmosis inversa, o agua RO.Transfiera hasta tres hembras y tres machos a los lados opuestos del tanque dividido. A la mañana siguiente, retire el divisor poco después de que se enciendan las luces en el vivario. Permita el apareamiento sin interrupciones durante 20 minutos o hasta que se produzca un número suficiente de embriones.Los embriones estarán en el fondo del tanque de reproducción. Cuando se observen los huevos, levante el tanque interno ranurado junto con los peces y colóquelos rápidamente en un tanque externo limpio y sólido lleno de agua RO. Utilice una pantalla recolectora de huevos para recoger los huevos del tanque externo y transfiera los huevos a placas de Petri que contengan 30 mililitros de medio para embriones 1X.Incubar los huevos recolectados a 28,5 grados Celsius. Para embriones transgénicos, a 24 horas post-fecundación o HPF, retire los huevos muertos y evalúe la etapa de desarrollo de los embriones. Con pinzas, retire las corionas de tres a cuatro embriones que expresen GFP.Bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia con un filtro de excitación de banda pasante estándar de 460 a 490 nanómetros, revise los embriones positivos para GFP. Transfiera estos embriones a una placa de Petri separada que contenga 30 mililitros de medio para embriones fresco 1X. Después de 20 HPF, coloque los embriones positivos para GFP seleccionados y descorionados en una solución de PTU al 0,003 % para inhibir la pigmentación.Evite iniciar el tratamiento antes, ya que puede tener efectos adversos en el desarrollo de la cresta neural y del neuroepitelio. Añada 0.4 gramos de polvo de Agarosa de Bajo Punto de Fusión a 20 mL de medio embrionario 1x. Caliente la mezcla durante uno o dos minutos o hasta que la solución esté clara y todas las partículas se hayan disuelto.Aliquote aproximadamente 1 mL de la solución de agarosa en tubos cónicos nuevos de 1,5 mL para su almacenamiento. Para montar la cámara de baño abierta, coloque una pequeña cantidad de grasa de alto vacío en la base de la cámara de baño abierta. Coloque un portaobjetos circular de vidrio en la base y enrosque la tapa de la cámara de baño abierta sobre la base hasta que quede ajustada.Pipetee aproximadamente 500-700 microlitros de solución de agarosa al 2% en la cámara de baño abierta hasta que la base esté llenada aproximadamente tres cuartas partes. Espere 30 segundos para permitir que la agarosa se enfríe ligeramente sin polimerizarse completamente y posteriormente transfiera un solo embrión al centro de la base. Bajo un microscopio estereoscópico fluorescente, utilice una punta de micropipeta de 10 microlitros para orientar el embrión y colocarlo cerca del fondo de la agarosa, de modo que no flote cuando se agregue el medio para embrión.Un paso fundamental es asegurarse de que el embrión esté correctamente posicionado en el agarosa. En estos experimentos, orientamos el embrión lateralmente, pero también puede colocarse para enfocar áreas dorsales y ventrales. Supervise y reposicione el embrión hasta que el agarosa haya solidificado.Luego, utilice una pipeta de transferencia para llenar completamente la cámara abierta ensamblada con medio para embriones de lapso de tiempo. Después de colocar todo el montaje sobre la platina del microscopio, siga el protocolo descrito en el texto y use el objetivo de cinco aumentos para localizar el embrión. A continuación, eleve manualmente la platina a la posición más alta y use el enfoque fino para colocar el embrión en el centro del rango del microscopio.Baje manualmente la platina y cambie el objetivo de cinco aumentos por el objetivo de inmersión en agua de 25 aumentos. Eleve cuidadosamente la platina para volver a enfocar el embrión. En el software, haga clic en el modo XYTZ para obtener múltiples imágenes en el plano XY a intervalos de tiempo o T, a lo largo de una profundidad Z. Utilice la vista de epifluorescencia o campo claro para encontrar la profundidad de enfoque en la zona de interés, lo que delimitará el z-stack.Para estos experimentos, el borde lateral del ojo es el inicio del z-stack. Cuando se enfoque aquí, haga clic en el botón de inicio en el software. Después de enfocar hasta la línea media del embrión, que es el final del z-stack, haga clic en el botón de finalización.Un paso fundamental es asegurarse de que el paso Z abarque el área de interés. En nuestro caso, queremos capturar el ancho del ojo desde los bordes lateral hasta medial. Haga clic en el menú para ajustar el tiempo de adquisición y la frecuencia de imagen. Para una recuperación adecuada del fluor4 y la supervivencia del embrión, mantenga una proporción de al menos uno a tres entre la adquisición del z-stack cuando la potencia del láser está encendida y el tiempo de recuperación cuando la potencia del láser está apagada. Con el tiempo adecuado para la recuperación del embrión, establezca el intervalo entre z-stacks en la ventana designada. Luego, configure la duración total del experimento en la ventana correspondiente.Ahora, active la configuración de imagen en vivo para realizar ajustes finales en la configuración del láser. Ajuste las barras deslizantes de transmisión del láser, ganancia y compensación dentro del software para optimizar la imagen de fluorescencia. Además, ajuste la orientación del embrión según sea necesario, dependiendo de la duración del experimento, el crecimiento previsto del embrión, etc.Asegúrese de que el área de interés permanezca dentro del encuadre durante toda la duración del experimento. Durante la adquisición de imágenes con lapso de tiempo, apague la fuente de luz de epifluorescencia, cubra la platina con la caja de seguridad láser, que es adecuada para proteger contra la luz de fondo, y luego presione inicio. Acceda a la cámara de baño abierto a través de las puertas correderas de la caja de seguridad láser para rellenarla con medio para embriones de lapso de tiempo cada 8-12 horas.Después de la adquisición de imágenes, abra los archivos en el software de procesamiento de imágenes y resalte la serie de imágenes correcta. En el software, elija el menú de procesamiento, haga clic en desconvolución 3D y aplíquelo para desconvolucionar cada z-stack. Importe archivos tif individuales al software de procesamiento de video, luego seleccione todos los archivos tif y arrástrelos al editor de video.Ajuste la duración de cada imagen dentro del video a 0,1 segundos. Finalmente, exporte el video como un archivo mov o mp4. Aquí se observan mediante imágenes de fluorescencia de múltiples fotones los patrones de migración de las células de la cresta neural craneal que dan origen a las estructuras faciales craneales y al segmento anterior del ojo en líneas de pez cebra transgénicas sox10:EGFP y foxd3:GFP.Las células de la cresta neural positivas para Sox10 entre 12 y 30 hpf migran desde el borde del tubo neural hacia la región craneofacial. Las células provenientes del prosencéfalo y del mesencéfalo migran dorsal y ventralmente hacia el ojo en desarrollo para colonizar el mesénquima perióptico. Como se indica aquí, las células positivas para sox10 forman el proceso nasal frontal.Las células de la cresta neural del rombencéfalo migran en dirección ventral y dan origen a los arcos faríngeos. La imagen de lapso de tiempo de células de la cresta neural positivas para foxd3 entre 30 y 60 hpf muestra que estas células migraron entre la copa óptica y el ectodermo superficial y a través de la hendidura ocular marcada por la flecha, y se agruparon alrededor del cristalino marcado por el asterisco, formando el estroma del iris. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse desde el inicio hasta el final en cuatro días si se lleva a cabo adecuadamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar elegir embriones con una alta cantidad de fluorescencia. La configuración inicial del software puede ser complicada, pero una vez determinados los parámetros, los cambios adicionales suelen ser mínimos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la microscopía de lapso de tiempo con fotones múltiples para obtener imágenes de células migratorias en el embrión.

multi-photon-time-lapse-imaging-to-visualize-development-real-time

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

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En este video, las técnicas para la multicolor confocal de imágenes a intervalos de tiempo y la ablación de células específicas se proporcionan. Time-lapse de imágenes se utiliza para controlar el comportamiento de los múltiples tipos de células de...

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El vídeo de la actualidad muestra un método que aprovecha las ventajas de la combinación de electroporación y la microscopía confocal para realizar las imágenes en vivo en cada células progenitoras neurales en el cerebro anterior pez cebra en desarrollo.

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Fuente: Williams, A. L., et al. Imágenes de lapso de tiempo multifotónico para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de células de cresta neural migratorias en embriones de pez cebra. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra un protocolo de imágenes de lapso de tiempo multifotónico para visualizar la migración de las células de la cresta neural en un embrión de pez cebra en tiempo real con alta resolución.

Visualización de la migración de células de la cresta neural en un embrión de pez cebra mediante imágenes de lapso de tiempo multifotónicas

La visualización de los datos experimentales se ha convertido en un elemento clave en la presentación de resultados a la comunidad científica. Generación de grabación a intervalos regulares en vivo de embriones en crecimiento contribuye a la mejor presentación y la comprensión de los procesos de desarrollo complejos. Este protocolo es una guía paso a paso para el etiquetado de células a través de la proteína fotoconversión Kaede en el pez cebra.

Visualización de Desarrollo Craneofacial en los SOX10: Kaede pez cebra transgénico Línea Usando Time-lapse microscopía confocal

Imagen confocal Time-lapse es una técnica de gran alcance útil para caracterizar el desarrollo embrionario. Aquí se describe la metodología y caracterizamos la morfogénesis craneofacial de tipo salvaje, así como PDGFRA, Smad5 y smo embriones mutantes.

Analizando Craneofacial en la morfogénesis de pez cebra Utilizando 4D Microscopía Confocal

Aquí, presentamos un método de montaje versátil que permite la obtención de imágenes a largo plazo del desarrollo posterior del cuerpo de embriones vivos de pez cebra sin perturbar el desarrollo normal.

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

La imagen in vivo es una poderosa herramienta que se puede utilizar para investigar los mecanismos celulares subyacentes al desarrollo del sistema nervioso. Aquí describimos una técnica para el uso de la microscopía confocal de lapso de tiempo para visualizar un gran número de células etiquetadas en Brainbow multicolor en tiempo real dentro del sistema nervioso de pez cebra en desarrollo.

Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

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Visualización de la morfogénesis ocular mediante microscopía de hoja de luz utilizando rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Demostramos un método que aprovecha la microscopía confocal de barrido rápido para realizar imágenes en vivo de las células de la microglía en el tectum óptico del pez cebra en desarrollo, lo que permite el análisis de la dinámica de estas células in vivo.

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Aprende a visualizar la migración de células de cresta neural en embriones de pez cebra mediante microscopía de láser de barrido multiphotón. Esta técnica permite obtener imágenes tridimensionales en tiempo real con alta resolución y menor fototoxicidad.

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra (Video) | JoVE Journal

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

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